CN102047841B - 一种植物免去雄高纯度杂交制种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物免去雄高纯度杂交制种方法。该方法，包括下述步骤：1)将tfdA基因导入植物筛选表达tfdA基因的植株即为杂交父本；所述tfdA基因具有GENBANK Accesion version Number为AY365053.1的5′端第36915-37778位核苷酸序列；2)用杂交父本花粉给未去雄蕊的杂交母本授粉获得种子；3)将获得的种子种植出苗后，喷施2.4-D溶液处理，筛选真叶形状为正常叶片的植物苗，即为杂交植物，该杂交植物生长的种子为杂交种。免去雄杂交制种技术体系具有简易高效、真假杂交种简易鉴别、制种成本低；杂交种纯度可达100％；自由选配组合等特点。本发明的方法将在双子叶植物杂种优势利用(特别是棉花)的中发挥巨大作用。

Description

一种植物免去雄高纯度杂交制种方法

技术领域

本发明涉及一种植物免去雄高纯度杂交制种方法，特别涉及一种棉花免去雄高纯度杂交制种方法。

背景技术

棉花是我国重要经济作物，是棉农的主要收入来源。在影响棉花产量的众多因素中，种子约占60％的作用。作物杂交种一般均具有杂种优势，从1950-1984我国小麦、玉米、水稻的平均单产分别增长170％、337％和202％，其中玉米的增产幅度最大为337％，主要原因是大面积种植了杂交种。棉花的杂交种也具有显著增产效果，一般比常规品种增产15～30％。

我国从上世纪80年代末开始有零星配制及种植棉花杂交种。但直到上世纪九十年代末，杂交种占整个棉田的面积仍然不超过5％，且主要分布在长江流域，而冀鲁豫及新疆的杂交种面积极少。本世纪初，随着抗虫杂交种的推出，杂交种才得以在长江流域普及，黄河流域开始有一定规模种植，新疆刚开始示范种植。目前全国棉花杂交种推广面积不超过总面积的13％。

杂交种难以大面积推广的原因：制种成本高、制种数量少、种子价格高。当前棉花杂交种主要采用人工去雄授粉的传统模式，在制种季节(7月上旬至8月中旬)每天、每亩制种田需要3个劳动力，每天平均工作时间8小时以上，随着劳动力日工值的提高，制种用工由每天15元提高到了每天30元～50元不等，若按照制种45天计算，每亩杂交制种用工为4050元～6750元，种子成本还需根据产种子量计算，产种量又受到制种人员技术、制种期和吐絮期天气状况等多种因素的影响，因此杂交种种子的成本是非常高、又是不固定的。上世纪末，我国杂交制种基地主要集中在山东滨州及鲁西南地区、河南与安徽交界地域及江苏的苏北地区，这些区域也是我国棉花高产稳产地带。制种区域以此为中心：若向北移，受无霜期及积温不足的限制，向南移，受到降水过多或严重伏旱等限制，向西北移，受劳动力匮乏及无霜期等因素限制。我国棉花杂交制种最佳制种区域位于黄河流域的南部与淮河流域的北部，因此限制了杂交种的产种子数量；受劳动力价格和劳力相对不足的影响，直接导致了杂交种成本的上升和产种子数量的不足。

发展趋势：劳动力成本将继续提高、制种工不愿在酷暑季节从事繁重的体力劳动。杂交制种地区多为工商业不发达区域，随着我国经济的快速发展，许多地区的工商企业发展较快，主要劳力多外出谋职，杂交制种主要依靠老弱劳力及中学生，而中学生多为独生子女，他们中的多数人不情愿从事制种工作，原有的传统制种区域正面临着难以持续的趋势。因此，若要大规模配制、普及棉花杂交种，就必须减轻劳动强度、降低制种成本、增加种子数量，改变传统杂交制种技术。

种植棉花杂交种可大幅度增加棉花产量和提高纤维品质，而制种成本高和制种数量少是制约杂交种大面积推广的瓶颈。因此，寻找高效制种技术、简化制种程序、扩大制种数量是解决这一难题的唯一途径。

棉花杂交制种方法各异，也出现了不少专利技术，总体可概括为三方面技术：不育系杂交制种技术、常规人工杂交制种技术、标记杂交制种技术。

(1)人工去雄常规杂交制种技术。该技术即需要每天下午将母本上次日要开花的雄蕊用手工去除，次日上午取父本的花粉授予母本柱头上。该方法具有容易获得优势杂交组合、技术容易熟练掌握、若严格监控可保证种子质量。缺陷是，制种成本高、劳动环境艰苦、监控不利难以保证种子纯度等不利因素。目前推广的杂交种80％以上是采用人工去雄常规杂交制种技术所获得。

(2)不育系杂交制种技术：

利用不育系制种方法，其中包括核不育的两系制种方法、核质互作不育的三系杂交制种方法。

三系包括不育系、同形保持系及恢复系。美国最早发现了棉花三系材料，但受恢复系的恢复力限制及杂种优势不高等限制，一直未能取得突破。我国浙江大学、河北邯郸农科院及中国农科院生物技术研究所等单位单独或合作，在选育良好恢复系、培育优势杂交种方面取得了突破，育成了高优势杂交种。该技术是最终发展方向，但目前选育众多优良不育系、保持系及恢复系进程较为漫长。

两系只包括不育系和恢复系，其不育性状受核基因控制，一般为一对或两对阴性基因，其优点为制种省工、可配出优势杂交种，在目前有一定制种面积。不足之处：棉花的不育系与可育株的混合群体苗期无法识别，待现蕾后识别时棉株较大，去除50％可育株必定影响个体发育、田间密度及制种产量；个别不育系的育性不稳定，受环境影响可能变为可育株；此外，现有核不育系对黄萎病高度感病。

(3)标记杂交制种技术：

标记性状主要包括：红叶、黄叶、鸡脚叶、色素腺体等。河北农科院早在1970年代就采用红叶父本与绿叶母本杂交培育杂交种，杂交种F1的叶色呈红色，由此可鉴别杂交种与自交种，该方法可作为早期鉴别杂交种的良好标记，但转育红叶性状尚不被人们普遍认可，另从光合效率方面推测：红叶的光合效率难以超过绿叶；南京农业大学较早提出利用芽黄基因鉴别杂交种，该性状可作为早期鉴别杂交种的标识，但芽黄基因来自海岛棉，与晚熟等不利性状连锁，至今未见到大面积应用；国内多家育种单位从1990年代开始推出鸡脚叶杂交种，鸡脚叶杂交种大幅度提高种植密度、通过增加叶面积系数提高光合效率，最终实现杂交种的增产优势。鸡脚叶杂交种在新疆推广最为成功，但在黄河流域及长江流域未能得到大面积应用。在杂交种鉴别方面，由于到第4～5片真叶才表现鸡脚叶，因此不适合作为杂交种的早期鉴别标记性状。

(4)不育系结合昆虫传粉方法。利用不育系结合昆虫如蜜蜂传粉是目前为止最为理想的方法。其原理是利用不育系与恢复系按照一定比例混合种植，在棉花开花季节，通过蜜蜂将父本(恢复系)的花粉传给母本，从而获得杂交种。该方法也是未来发展方向，但由于授粉效率较低尚未大面积应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物免去雄高纯度杂交制种方法。

本发明提供的植物免去雄高纯度杂交制种方法，包括下述步骤：

1)将tfdA基因导入植物筛选表达tfdA基因的植株即为杂交父本；所述tfdA基因具有GENBANK Accesion version Number为AY365053.1的5′端第36915-37778位核苷酸序列；

2)杂交时制种时，用父本花粉给未去雄蕊的杂交母本授粉获得种子，母本上所结的种子主要为杂交种子(也有一些自交种子)；

3)将步骤2)获得的种子种植出苗后，用2.4-D处理，喷药后长出的真叶形状正常的棉苗，即为杂交种棉花(植物)植株；不正常的畸形子叶棉苗(植物)则为自交苗。

所述方法中，授粉时，所述植物杂交母本花冠即将张开至张开后3小时内；所述植物为双子叶植物；优选为棉花。

所述方法中，所述步骤3)的中种植方法为将步骤2)获得的种子播种于苗床或大田；当种子播种于大田时，播种方法为穴播，每穴2-3粒，最好为3粒种子。

所述方法中，所述2.4-D溶液的浓度可为0.003％-0.005％。

本发明的方法，利用转tfdA基因的父本，选用适合当地生态环境的优良品种作为母本，在母本不去雄情况下，直接用父本花粉进行授粉。在棉花出苗后，通过在苗床或大田中喷施2.4-D，由于杂交种携带有抗2.4-D的基因(该基因来自父本，父母本杂交方可获得杂交种)，而母本(雌雄同花植物例如棉花)自身花粉授粉则不携带抗性基因，又由于棉花对2.4-D极为敏感，因此在极低的浓度下即可鉴别出不携带该基因的自交种(新出叶片畸形)和携带该基因的杂交种(新出真叶形状正常)，由此，通过人工识别可彻底去除自交种，从而保证田间杂交种纯度达到100％。

免去雄杂交制种技术体系具有三大优点：(1)简易高效：真假杂交种简易鉴别、制种成本低。(2)杂交种纯度可达100％。(3)自由选配组合：本技术母本不受不育性状等限制，因此与不育系相比，更容易选出优势杂交组合。本发明的方法将在双子叶植物杂种优势利用(特别是棉花)的中发挥巨大作用。

附图说明

图1为免去雄杂交种F1田间表现

图2为免去雄授粉过程

图3为免去雄杂交种苗期表现(鉴别真假杂交种示意图)

图4为不同授粉时间段所获得的杂交种比例示意照片

图5为pSPT载体的结构示意图

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、棉花免去雄杂交制种技术

一、转tfdA基因的父本的获得

我们利用强启动子CaMV 35S驱动tfdA基因，通过花粉管通道方法获得了转基因棉花植株，然后用有性杂交获得了一系列早、中、晚熟的父本，具体方法如下所述：

1、强启动子CaMV 35S驱动表达tfdA基因重组载体的获得

pSPT载体是以pCambia1300为基础进行改造的，我们所用目的基因的启动子为Super强启动子，在启动子后面增加了Flag序列，此外把报告基因由Hygromicin(R)基因更换为tfdA基因，经过改造后的载体命名为pSPT(图2)。pSPT载体的构建过程如下所述：

将pCAMBIA1300中的CaMV35S启动子更换为Super强启动子。本实验室首先将pCAMBIA1300的多克隆位点进行改造，改造后的位点为：SalI、KpnI、BamI、SpeI、SalI、ApaI、SmaI、SwaI、PstI、HindIII、XbaI及AccIII。我们首先合成了含有MfeI、BamI、SpeI、SalI、ApaI、SmaI、SwaI、PstI、HindIII、XbaI、AccIII及HindIII酶切位点的DNA片段，其序列为：CAATTG GGATCC ACTAGT GTCGACGGGCCC CCCGGG ATTTAAAT CTGCAG AAGCTT TCTAGA GTAGACAAGCTT。然后将pCAMBIA1300载体和人工合成的多克隆片段用EcoRI和HindIII酶切，回收载体大片段和多克隆片段(再测序)，用T4连接酶连，由此完成了酶切位点的更换。

然后在AccIII和XbaI之间插入Super启动子，在Super启动子5’端增加PinA酶切位点，利用AccIII和PinA酶的互补序列使得启动子之前不在具有酶切位点。经测序验证后命名为pCAMBIA1300-Super载体。Super启动子长度为1143bp，由pMSP3535H3为模板设计引物上游引物5’-agtactCTAGATTCGACGGTATCGCGATAAG(引物中前面小写部分为PinA酶切位点)，下游引物5’-tctagaGTCGATTTGGTGTATCGAGATTG(引物中前面小写部分为XbaI酶切位点)PCR扩增PCR扩增获得(pMSP3535H3购自BVTech公司)，其序列见序列表5。PCR扩增获得的Super启动子插入上述载体的AccIII和XbaI之间之前，先用PinA和XbaI双酶切，然后可连接到用AccIII和XbaI酶切后的pCAMBIA1300上，由此可消除启动子前面的酶切位点。

在pCAMBIA1300-Super载体基础上，我们进行了如下改造：

1)CaMV35S启动子的获得

首先我们设计引物获得CaMV35S启动子，5’端引物包含有BstXI酶切位点、3’端引物包含有NcoI：BstXI-35S-5’：5’-CCAACATGGTGGAGCACGACACTCTC-3’和35S-NcoI-3’：5’-CCATGGATCTCATTGCCCCCCCGGATCTG-3’，以pCAMBIA1300(购自金维克(中国)生物技术中心)为模板扩增得到CaMV35S启动子(825bp)，序列为序列1。

2)tfdA基因的获得

以pJP4(购自DSMZ GmbH)为模板获得了tfdA基因，以上游引物5’CCATGGGTGAGCGTCGTCGCAAATC(引物的5’端加NcoI酶切位点)，下游引物为5′-CTCGAGCTAGACGACGGCATCGTCCAGGGT(引物的5’端加XhoI酶切位点)，进行PCR扩增，结果获得888bp的片段，测序证明该片段具有GENBANK Accesion version Number为AY365053.1的5′端第36915-37778位核苷酸序列，即tfdA基因序列(序列表中序列2)。

3)pSPT载体的构建

①将CaMV35S启动子和tfdA分别连接与pMD18-T载体上(购自华绿渊生物技术有限公司)，再用NcoI和SalI分别酶切含有tfdA的pMD18-T载体，回收tfdA片段，然后将该tfdA片段与经过NcoI和SalI酶切的含有CaMV35S启动子的pMD18-T载体的连接，即将tfdA基因连接于含有CaMV35S启动子的pMD18-T载体上；将经酶切和测序表明正确的重组载体命名为pMD18-T-35S-tfdA；pMD18-T-35S-tfdA中，CaMV35S启动子连接于tfdA基因的5′端。

②tfdA基因与CaMV 35S启动子连接后，再用BstXI和Sal I(酶切的切口可与XholI酶切口匹配)从pMD18-T-35S-tfdA上切下，同时用BstXI和XholI酶切质粒pCambia1300，通过连接酶将CaMV35S启动子+tfdA插入到质粒pCambia1300(购自CAMBIA公司)的BstXI和XhoI酶切位点之间，得到重组载体。经过对重组载体的酶切和测序鉴定，命名为pSPT01载体。pSPT01载体中，tfdA基因的5′端与CaMV 35S启动子相连接，3′端与pCambia1300载体自身的PolyA终止子相连。

③人工合成5’端含有XbaI酶切位点、3’端含有HindIII酶切位点的Flag标签序列：TCTAGAGATGGCGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGACTATAAAGATGACGATGACAAGTCTAGAAAGCTTCTGCAGGTCGACGATTCCAAGCTT(序列表中序列4)，用XbaI和HindIII双酶切pSPT01和上述人工合成片段，再用T4连接酶连接，将Flag标签序列插入Super强启动子的后面，构建获得重组载体，经酶切和测序表明正确的载体命名为pSPT载体(图5)。

2、转tfdA基因的父本的获得

我们选择棉花品种包括早熟棉花品种如采用新疆的新陆早33号(购自新疆国棉三益种业有限责任公司)，中熟品种为GK164(自育品种，已于2007年通过了河北省新品种审定，审定编号：冀审棉2007007号，购自山东农兴种业有限公司)，中熟品种为泗棉3号(购自合肥丰乐种业股份有限公司)等作为构建父本的材料。

将步骤构建的pSPT载体利用采用花粉管通道法(王长海，蓝海燕，利用花粉管通道法将外源质粒DNA注入棉花的改良方法，棉花学报，1999年04期)分别导入上述棉花品种，获得T1代种子后，首先播种于温室，待出苗后用质量百分浓度为0.003％的2.4-D溶液喷于棉苗的子叶表面，10天左右淘汰畸形真叶植株保留正常株(可能为转基因植株)，然后再通过特异引物PCR检测，并对PCR产物进行测序进一步确认阳性植株。PCR检测引物为5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC，和5’-GTCCGCGGTGAAGAACGCAGCGG；PCR获得799bp的片段(序列表中序列3)的植株为阳性植株。

将上述PCR鉴定为阳性的植株通过夏季北方种植，冬季海南加代，一般T3代即可获得纯合株系(对T2代分单株收获，可得到T3代种子，播种出苗后可得到T3代幼苗，对幼苗进行2.4-D处理鉴别，凡是不再出现非正常叶形的即可视为纯合株系候选株系，再经过PCR进一步验证可以确认)。将鉴定为转pSPT载体的纯合株系作为杂交父本进行如下免去雄杂交。

二、免去雄杂交

利用转tfdA基因的父本，选用适合当地气候特点的优良品种作为母本，在母本不去雄情况下，直接用父本花粉进行授粉。在棉花出苗后，通过在苗床或大田中喷施2.4-D，由于杂交种携带有抗2.4-D的基因(该基因来自父本，父母本杂交及获得杂交种)，而母本自交种则不携带抗性基因，又由于棉花对2.4-D极为敏感，因此在极低的浓度下即可鉴别出自交种(新出叶片畸形)和杂交种(新出真叶形状正常)，通过人工识别可彻底去除自交种，从而保证田间杂交种纯度达到100％。

首先，发明人对授粉时间进行了筛选，按照下述的方法分别在每天早上分别在如下几个时间段授粉：1)6:00-7:00；2)7:00-8:00；3)8:00-9:00；4)9:00-10:00；5)10:00-11:00；6)11:00-12:00。然后种植杂交种，观察棉花长势，结果表明，2)、3)、4)的时间段授粉时，杂交种(真叶正常展开的植株)所占比例较大且长势良好，如图4所示，GK164转基因株为父本和鲁棉研18(购自山东农兴种业公司)为母本授粉后获得的混合杂交种，幼苗经过喷施2.4-D后的照片。从图4中看出2)、3)4)等3个授粉时间段所获得的混合种子中正常植株(杂交种)所占的比例较大，因此，在免去雄直接授粉时，授粉时间以每天早上7～10点最佳，在最佳时间段授粉有利于提高杂交种的比率。

将上述获得的转tfdA基因的父本分别与鲁棉研18进行免去雄杂交制种。免去雄杂交制种具体方法如下所述：

1)在父本开花后，取父本花粉(父本花药可于前一天下午5-6点钟摘取次日将要开花的花蕾，也可在次日上午6-10点直接取花粉)给母本即将开放(花冠长度超过5cm)至开放3个小时之内的花授粉。具体操作方法为：于每天早晨7～10，取棉花父本的花粉装入小瓶，在小瓶盖子上打一小孔，大小正好可容纳棉花的柱头进出，然后把母本将花冠撕开(若花已开则省略此步骤)，将小瓶倒置使得柱头可以进入小瓶与其中的花粉接触，用手指轻叩小瓶底部即可完成授粉过程(图2)；棉花收获时所获得的种子包含有杂交种和自交种。

2)第二年将混合种子播种于苗床或大田，播种量适当增加，若直播于田间则最好为穴播，每穴3粒种子较为适宜(本实施例选择大田田间播种，穴播，每穴3粒种子)，待棉花出齐苗后喷质量百分浓度为0.003％或0.005％的2.4-D溶液，注意要在无风情况下用专用喷雾器带喷雾罩喷洒，以免影响其他双子叶植物；喷药后约10-15天可依据真叶形状，保留正常叶片棉苗(杂交种)，去除畸形叶片(自交种)即可。图3为免去雄杂交种苗期表现(鉴别真假杂交种示意图)。杂交种的后期移栽及田间管理完全同其他棉花杂交种，经过鉴别保留的正常棉苗即免去雄杂交种F1代植株，F1代植株的田间表现如图1。上述实验证明，0.003％和0.005％的2.4-D溶液，可使杂交种棉苗生长正常，使非杂交种棉苗真叶畸形，在2.4-D 0.003％和0.005％作用浓度下，其作用效果没有差异，平时可以使用0.003％-0.005％的2.4-D溶液处理，筛选杂交种。

对于免去雄所配制的杂交种，待种子收获后随机取样种植于温室，出苗后喷施2.4-D，7-10天后记录正常真叶株数，并对正常真叶的植株进行如上步骤2所述PCR检测筛选正常株，正常株占总苗数的比例即为该混合种子的杂交种纯度。

按照上述方法，经过多年反复试验证明，步骤1)授粉后获得的混合棉花种子中杂交种的比例为通常在67％左右，而母本自交种比例33％左右；这可能是由于外来花粉比母本自身的花粉更具有竞争力，并且本发明方法也选择了利于外来花粉竞争力的时间条件，上述实验也证明，最终通过步骤2)筛选得到的杂交种(苗)纯度可达100％。

上述实验证明，本发明的免去雄杂交制种技术体系具有三大优点：(1)制种成本低。我们通过3年大规模试验，若在免去雄情况下直接授粉，每亩只需用工5.6小时/天，而人工去雄授粉每天大约需要30小时/天。因此，免去雄杂交制种技术可节约用工81.3％；(2)杂交种纯度可达100％。在棉花出苗后利用2.4-D处理，经过间苗剔除自交种后，可保证杂交种纯度达到100％；(3)自由选配组合。该项技术只需采用携带tfdA基因的父本，母本选择不受限制，可选用当地具有优良农艺性状或品质优异的品种，与不育系技术相比，更容易获得适合当地生态环境的优势杂交组合。

由于2.4-D为专杀双子叶植物的选择性除草剂，因此免去雄杂交制种方法同样适合于棉花之外的其他双子叶植物。

Claims (7)

1.一种植物免去雄高纯度杂交制种方法，包括下述步骤：

1)将tfdA基因导入植物，筛选表达tfdA基因的纯合植株，即为杂交父本；所述tfdA基因具有GENBANK Accesion version Number为AY365053.1的5′端第36915-37778位核苷酸序列；

2)用杂交父本花粉给未去雄蕊的杂交母本授粉获得种子；

3)将步骤2)获得的种子种植出苗后，喷施2.4-D溶液处理，筛选喷药后长出的真叶形状为正常叶片的植物苗，即为杂交植物，该杂交植物生长的种子为杂交种；

所述植物为棉花。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述授粉是取父本开花后的花粉对所述杂交母本即将开放至开放三小时之内的花的花柱进行授粉，所述即将开放为花冠长度超过5cm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中所述授粉的时间为每天早晨7～10点之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中种植的方法为将步骤2)获得的种子播种于苗床或大田；当种子播种于大田时，播种方法为穴播，每穴3粒种子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述2.4-D溶液的喷施的质量百分浓度为0.003-0.005％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述tfdA基因通过植物表达载体导入双子叶植物中，所述植物表达载体中，tfdA基因由CaMV35S启动子启动表达；所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体中还包括Flag标签，所述Flag标签的核苷酸序列为序列表中序列3；所述植物表达载体的基础构架载体为pCAMBIA1300。