CN102041270A - 胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对DEC1基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒DEC1-siRNA1/2。本发明胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体能高效的特异性的抑制DEC1基因表达，用于制备治疗高表达DEC1基因的胃癌的基因药物。
Description
技术领域
本发明涉及表达DEC1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1)基因的胃癌的基因治疗药物，具体涉及靶向胃癌DEC1基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途，属于生物医药技术领域。
背景技术
分化型胚胎软骨发育基因1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1，通称DEC1)是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白家族的一个新成员，含有bHLH结构域。近来发现它是一个与肿瘤的发生、发展密切相关的转录因子，其功能涉及肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及早老，是参与缺氧调节的基因，与肿瘤组织的低氧状态密切相关，可作为一个对放疗和化疗后肿瘤反应的预测标志。研究发现在结肠癌细胞中DEC1可对抗血清饥饿诱导的调亡，并选择性抑制procaspases3、7、9的活性，但对procaspase8不起作用。而突变体DEC1转染子(缺少DNA结合的结构域)则无对抗凋亡作用，说明转录因子DEC1可通过线粒体途径抑制凋亡。肿瘤细胞对低氧环境及血清饥饿的耐受，是其高度恶性的特质，DEC1的这种对抗血清饥饿诱导凋亡的作用，也证实其可能作为一个癌基因参与了肿瘤的发生发展。
已有研究报道DEC1在多种肿瘤细胞系，如白血病、结肠癌、肺腺癌、神经胶质瘤、肾癌中存在高表达，可调控肿瘤生长、凋亡相关因子的表达，与肿瘤的发生发展有着重要的联系。我们的一项研究也发现在胃癌组织中DEC1表达明显高于癌旁组织，且与肿瘤的分化程度密切相关(Zheng Y，Jia YF，Wang YS，etal.The hypoxia-regulated transcriptionfactor DEC1(Stra13，SHARP-2)and its expression in gastric cancer.OMICS.2009，13(4)：301-306)。通过阻断在胃癌细胞中DEC1的表达，进而影响其生物活性，同时结合其它的治疗手段可能是治疗高表达DEC1肿瘤的新策略。
RNA干扰作用分子——小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，脱去一条链，然后和RISC一起与靶mRNA上的相应的碱基序列配对结合。在RISC作用下，靶mRNA在相被切断，然后3’端序列在细胞质中被酶降解，siRNA与RISC的复合体脱离被破坏的靶mRNA，继续切割其他的靶mRNA。剩下的5’端在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRP)作用下生成互补链，新生的dsRNA会在Dicer酶的作用下生成更多的siRNA，继续诱导靶mRNA沉默。如此循环使得在一段时间内，目标mRNA的蛋白质表达受到抑制，一般可维持96-120小时或3-4个细胞周期。近来Brummelkamp等发现通过向细胞质导入可以表达siRNA的质粒，可以使RNA干扰稳定地维持2个月(Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammaliancells.Science，2002，296(5567)550-553)。
肿瘤是多基因疾病，在基因治疗领域RNA干扰特别适合用于某个基因过度表达或由于体内突变基因表达所致的疾病。利用RNA干扰相关技术可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子及其受体以及部分关键酶等，在不影响正常基因功能的前提下抑制突变基因表达或基因的过量表达，从而达到治疗肿瘤的目的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。
本发明以利用RNA干涉技术为主，针对DEC1基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector1/2，以下简称DEC1-siRNA1/2。其示意图谱见图1，能高效的特异性的抑制DEC1基因表达，可用于制备治疗高表达DEC1基因的胃癌的基因药物。
本发明的技术方案如下：
靶向DEC1基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGreenPuro shRNA Cloning andExpression vector为载体，针对人分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)编码区上游、下游的两段序列，在可较高表达DEC1胃腺癌细胞系BGC823中发挥RNA干扰作用。这两段DEC1特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’，起始于661位；②5’-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，起始于2476位，是用于由DEC1基因相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得：
(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成
选择DEC1基因编码区的两段序列①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’、②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下：
①DEC1寡核苷酸序列1：
正义链：
5’-GATCCCATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAACTTCCTGTCAGATTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAACATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAATCTGACAGGAAGTTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGG-3’
②DEC1寡核苷酸序列2：
正义链：
5’-GATCCCCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAACTTCCTGTCAGATTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAAAATCCGGAAACTCTTCGATTCGAACCTCTGACAGGAAGTTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGG-3’
(2)合成的寡核苷酸分别与线性载体pGreenPuro shRNA Cloning and Expressionvector连接、转化、扩增及质粒的提取。
首先将步骤(1)合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用4分钟后缓慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选单个菌落大量培养。用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。
(3)质粒的鉴定
将步骤(2)提取的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳，应用引物ForwardH PCR Primer和ReverseH PCR Primer进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入片断测序。
本发明的胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体在制备治疗表达DEC1的胃癌的基因药物中的应用。
为了对DEC1基因siRNAs表达质粒对DEC1基因的抑制效果及对胃癌细胞的抑制作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，RT-PCR法测定对DEC1mRNA表达水平的抑制作用，western blotting测定抑制DEC1后对DEC1蛋白表达水平的影响。
本发明的针对DEC1基因构建的2种siRNAs表达质粒是可用于高表达DEC1胃癌的治疗物质，其中DEC1-siRNA1抑制胃癌细胞DEC1表达的效率较高，可用于进一步研究DEC1基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。
本发明的胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体的制备方法和生物学活性的鉴定主要包括如下内容：
一、质粒的制备，包括RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成，将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector连接、转化、扩增及质粒DNA的提取，质粒的鉴定。
二、质粒生物学活性的鉴定，包括质粒的转染、脂质体转染效率的计算、RT-PCR检测DEC1基因的表达、western blotting测定抑制DEC1后对DEC1蛋白表达水平的影响。
下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法：
1.RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成沿mRNA序列寻找连续两个AA及后面的25-27个核苷酸，通过同源性比较，选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的siRNA靶位点(靶位点不含有3个以上的相同序列，GC含量在30％-50％左右)。按照载体试剂盒说明，针对DEC1基因的编码序列，为找到具有最佳沉默效果的靶位点，选取两段靶序列，分别从中上游选择2个符合条件的靶位点，分别为：
①DEC1-1 661 CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA
②DEC1-2 2476 CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA
设计并合成两对互补的寡核苷酸序列，每一正向单链寡核苷酸内，(25-27nt)的寡核苷酸以正反向组合，以TTCAAGAGA为发夹环序列间隔，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补；每对寡核苷酸两端分别带有与线性化载体(pGreenPuro shRNACloning and Expression vector)上相互补Bam HI和EcoRI限制性酶切位点，这是连接线性化载体所必需的。按以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。
2.合成的寡核苷酸分别与线性载体pGreenPuro shRNA Cloning and Expressionvector连接、转化、扩增及质粒的提取。
首先将合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选单个菌落大量培养。质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。
连接反应体系：
Linearized pGreenPuro Vector(50ng/μl) 1.0μl
双寡核苷酸(1μM) 0.5μl
10X T4DNA Ligase Buffer 1.0μl
去离子水 6.5μl
T4DNA ligase(40U/μl) 1.0μl
总体积 10.0μl
3.质粒的鉴定质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳，应用引物ForwardH PCR Primer和ReverseHPCR Primer进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入片断测序。
上述方法所构建的质粒生物学活性鉴定方法如下：
1.胃癌细胞培养及质粒的转染BGC823细胞培养在含10％新生牛血清的RPMI-1640中，置于37℃，5％CO2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒5μg加入250μl opti-MEM，轻轻混匀，按LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen)说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分五组，分别为空白对照组，8μl∶4μg组，10μl∶4μg组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入500μl转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37℃培养6h后，补加新鲜的含10％新生牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后48h于荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。
2.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测
(1)提取总RNA取转染后的胃癌细胞BGC823，用PBS漂洗2次，按106-107个细胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下续反应。
(2)cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50℃30min，99℃5min，5℃5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI22μl，10X RTBuffer 1μl，dNTPs混合物1μl，RNase Inhibitor 0.25μl，AMV Reverse Transcriptase0.5μl，Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μl，RNA 4.8μl；然后取cDNA 1μl在PCR仪(PE5700)中进行扩增，反应条件为94℃2min一个循环，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min共30个循环，反应总体系为20μl，包括5X PCR buffer 5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRa ExTaq HS酶0.125μl，DEC1上、下游引物各1μl，内参β-actin上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。
目的基因PCR引物序列及扩增片段长度
3.蛋白水平验证DEC1表达的变化
(1)培养细胞蛋白提取步骤：取出培养细胞，弃去旧培养液，冰预冷PBS洗1次。加1×SDS Loading buffer裂解细胞，用细胞刮子将细胞刮下来，并转移至Ep管中，保持在冰上。剪切DNA 10-15s，降低样本粘滞度。95～100℃加热10min，冰上冷却，4℃离心11000×4min。吸取上清至0.5m lEp管中，-80℃保存。
(2)蛋白样品电泳步骤：先灌入约4ml的分离胶，凝固约30min；接着灌入约1ml的浓缩胶，凝固约20min。将胶板放入电泳槽中，加满电泳液。将蛋白样品加入到孔里，4℃90v电压电泳1.5～2h。
(3)转膜步骤：PVDF膜处理：甲醇浸泡10s，去离子水浸泡5min，1×转移缓冲液浸泡15min。(剪膜时戴手套，防止手上沾染的蛋白污染膜)。由负极到正极，按照三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸的顺序放好。(膜的大小≥滤纸的大小＞胶的大小；各层之间不能出现气泡)，4℃稳流50mA转移12～14h。
(4)抗体孵育步骤：转膜后用25ml TBS洗膜，室温5min。室温用封闭缓冲液孵育膜1h(摇床上摇)。25ml TBST洗膜3次×5min/次。一抗稀释液孵育膜轻微振荡4℃过夜。TBST洗膜3次×5min/次。HRP-标记的二抗稀释液(用封闭液稀释)室温孵育膜1h。TBST洗膜3次×5min/次。将滤膜放在瓶皿中，加入适量的新鲜配置的DAB底物溶液，5-15分钟即可显色，用水冲洗终止反应并照相。
所构建质粒及生物活性的鉴定结果如下：
1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于8000bp附近，已知构建好的质粒大小约为7936bp左右。
2.紫外分光光度计检测结果如下表所示各质粒浓度如下；各质粒的A260/A280比值均在1.80左右，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。
紫外分光光度计检测所提质粒DNA的浓度和纯度
3.PCR鉴定结果应用引物ForwardH PCR Primer和ReverseH PCR Primer进行PCR鉴定(见图3)。
4.测序结果通过测序(图4)验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了DEC1-miRNA1/2。
5.转染率计算结果在转染后48h于流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒载体为8μl∶4μg转染效果最好(见图5所示转染率为85％)，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例。当脂质体体积更大时(10μl∶2μg)，转染率没有显著增加。
6.RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，各组均可见DEC1基因的特异性条带(395bp)和内参β-actin主带(512bp)，与空载体对照的条带比较可发现DEC1-siRNA1和DEC1-siRNA2的DEC1条带亮度都有所减弱，其中以DEC1-siRNA2更为明显，抑制率为52％，说明该质粒抑制DEC1的效率较高。
7.Western bloting检测DEC1-siRNA干扰质粒对DEC1表达水平的影响转染后48小时，提取各实验组细胞总蛋白，Western bloting检测，在约45kD位置出现了目的蛋白表达，DEC1和GAPDH的灰度比值显示，DEC1-siRNA1和DEC1-siRNA2的DEC1条带亮度都有所减弱，其中以DEC1-siRNA1更为明显，抑制率43为％，说明该质粒抑制DEC1的效率较高。(见图7)。
本发明靶向DEC1基因的siRNAs表达载体，能显著抑制肿瘤细胞内高表达的DEC1，进而影响其生物活性，在制备治疗高表达DEC1的胃癌的基因药物中应用。
本发明的优良效果如下：
本发明人在近几年国内外RNA干涉研究的工作基础上，针对DEC1基因，利用RNA干扰技术结合基因重组技术成功构建了CMV启动子驱动的2种siRNAs表达质粒，并通过在胃癌细胞株BGC823中表达DEC1特异性siRNAs分子，特异性的抑制了DEC1基因的表达，并筛选出抑制率最高的一种siRNA表达质粒，以达到特异性、有效阻断DEC1表达及治疗胃癌的目的。
I.本发明构建的2种DEC1特异性siRNAs表达质粒可有效抑制DEC1基因的表达。主要有如下优点：①本质粒可在大肠杆菌JM109中大量扩增，即可不断获得表达siRNAs的载体；②针对DEC1编码区中、上游分别设计了RNA干扰的靶位点，从而找到了对DEC1基因抑制效率较高的位点；③安全性高，无插入突变危险，亦无免疫毒性反应。
II.本发明构建、筛选的上特异性siRNAs表达质粒针对DEC1基因，抑制效果明显。本发明针对DEC1基因的siRNAs表达质粒是可用于DEC1相关胃癌的治疗物质，能显著抑制肿瘤细胞生长并能诱导其凋亡，可进一步研究DEC1基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗。
III.本发明所采用的siRNA技术能够在mRNA和蛋白水平上干扰基因的表达。siRNA是近几年发现的一种非编码的单链RNA，其长度为19-25nt。在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，在基因调控中扮演着重要的角色。本研究所构建的质粒siRNA干扰表达载体采用CMV启动子，能够促进目的基因的表达和转录。该质粒首先通过体内转录的方式合成一个约73nt的具有茎-环结构的shRNA，在特异性核酸内切酶Dicer的作用下，生成发夹状的单链siRNA分子，能与靶序列特异性的结合，从而降解靶mRNA，阻止其蛋白翻译，即RNA干扰(RNA interference)。
附图说明
图1DEC1-siRNA1/2载体图谱。
图2质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图：①DNA Marker；②空载体对照；③DEC1-siRNA1；④DEC1-siRNA2。
图3PCR鉴定图：①DL2000 DNA Marker；②空载体对照；③DEC1-siRNA1；④DEC1-siRNA2。
图4插入片段的基因测序图：A：质粒DEC1-siRNA1测序图；B：质粒DEC1-siRNA2测序图。
图5荧光显微镜检测转染率：A：Hochest染色B：转染后的实验组(脂质体/质粒载体为8μl∶4μg)。
图6RT-PCR检测转染DEC1-siRNA1/2后48小时后对BGC823细胞DEC1mRNA表达水平的抑制作用。
图7Western bloting检测转染DEC1-siRNA1/2后48小时后对BGC823细胞DEC1蛋白表达的抑制效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。本发明所有试剂及原料均可通过市场购买。
一、主要试剂
1.载体pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector购自SBI公司(Catalog no：SI505A-1)
2.工程菌JM109购自于promega公司(Catalog no：L1001)
3.T4连接酶购于NEW ENGLAND公司(Catalog no：M0202)；质粒的提取和纯化试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit)购自于QIAGEN公司(Cat No：27104)
4.DEC1和β-actin特异性PCR引物合成、引物ForwardH PCR Primer和ReverseH PCRPrimer、DEC1特异性siRNA寡核苷酸链合成和DNA序列测定(南京金斯瑞生物科技有限公司)
5.转染试剂Lipofectamine 2000(Cat.No：11668-027，Invitrogen)
6.TRzol Reagent(Cat.No.152476-026，Invitrogen)RT-PCR试剂盒RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.DRR019A，Takara)
7.HRP标记的山羊抗鼠IgG(Cat.No：A00160，南京金斯瑞生物科技有限公司)
8.浓缩型DAB显色试剂盒(目录号ZLI-9032，北京中杉金桥生物技术公司)
9.预染蛋白marker(目录号SM0671，Fermentas)
二、主要仪器
1.紫外分光光度计(GeneQuant Pro)：Amersham Biosciences
2.凝胶成像系统(ChemilmagerTM 4400)：Alpha Innotech
3.生物安全柜(Hfsafe1200)：上海力申科学仪器公司
4.二氧化碳培养箱(HF90)：上海力申科学仪器公司
5.荧光显微镜(ECLIPSE TE 2000-S)：Nikon
6.CCD(penguin150CL)：美国pixera公司
7.台式冷冻离心机(TGL-16G)：上海安亭科学仪器厂
8.PCR仪(PE5700)：ABI
三、质粒的制备方法及其生物学活性鉴定
1.RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成
1.1选择靶序列选取两段靶序列，这两段序列分别为：①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’，起始于661位；②5’-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，起始于2476位。
1.2设计寡核苷酸每一正向单链寡核苷酸内(25-27nt)的寡核苷酸以正反向组合，以TTCAAGAGA为发夹环序列间隔，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补；每对寡核苷酸两端分别带有与线性化载体(pGreenPuro shRNA Cloning andExpression vector)上相互补Bam HI和EcoRI限制性酶切位点，这是连接线性化载体所必需的。按以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。
按照以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如下：
①DEC1寡核苷酸序列1：
正义链：
5’-GATCCCATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAACTTCCTGTCAGATTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAACATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAATCTGACAGGAAGTTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGG-3’
②DEC1寡核苷酸序列2：
正义链：
5’-GATCCCCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAACTTCCTGTCAGATTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAAAATCCGGAAACTCTTCGATTCGAACCTCTGACAGGAAGTTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGG-3’
2.构建pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector DEC1干扰真核表达载体
2.1退火用高压去离子水重悬DEC1的寡核苷酸干粉至浓度为20μM，上下游序列按下列反应体系以混合，95℃水浴2分钟，自然冷却至室温反应20分钟。
上游链(20μM) 1μl
下游链(20μM) 1μl
10mM Tris-HCl，pH 8.5 18μl
总体积 20μl
2.2连接将退火产物DEC1双寡核苷酸1/2分别与pGreenPuro shRNA Cloning andExpression vector(载体图谱见图1)，用T4DNA连接酶连接。16℃过夜孵育。
连接反应体系：
Linearized pGreenPuro Vector(50ng/μl) 1.0μl
双寡核苷酸 0.5μl
10X T4DNA Ligase Buffer 1.0μl
去离子水 6.5μl
T4DNA ligase(40U/μl) 1.0μl
总体积 10.0μl
2.3转化
①取感受态细胞JM1093管(50μl/每EP管)，冰上融化10min.
②分别加入各连接产物5μl混匀，冰上放置30min，每隔5min轻轻摇动EP管。
③42℃水浴中放置30秒，勿晃动。迅速取出置于冰中，静置2min.
④每管加入250μl的37℃预热的SOC培养基，37℃振摇(约225转)1小时左右。
⑤取不同体积菌液(50μl-200μl)涂布于含有氨苄青霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，37℃培养12-16小时。
2.4阳性重组子小量扩增与分离纯化
①挑选上述含氨苄青霉素的LB平板中的单个克隆，种在4ml含氨苄青霉素(终浓度为50μg/ml)的LB液中，37℃振摇(约170转)14-16小时。每组都分别挑选5个克隆。
②实验组各取1ml菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入片段测序。另用甘油保存余下菌液，置-80℃保存备用。
③取出测序正确的菌种，划线接种在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃孵育14-16小时。挑单个菌落接种在4ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇(约170转)14-16小时。
④质粒的小量提取：取3ml菌液按QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)说明书提取质粒。
1)收集菌液与离心管中，室温下10000rpm离心5min；收集菌体，重悬于250μl的细胞悬浮液P1；
2)加入250μl碱裂解液P2，盖紧管口，颠倒旋转离心管4-6次以混匀，室温静置5min；
3)加入350μl缓冲液N3，立即温和颠倒离心管5～10次，室温下13000rpm离心10min；
4)将上清液小心移入吸附柱，室温下10000rpm离心1min，倒掉收集管的液体，将吸附柱放于同一收集管中；
5)在吸附柱中加入750μl洗涤液PE，室温10000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，重复洗涤一遍；
6)倒掉收集管中液体，讲吸附柱放入同一收集管中。室温10000rpm离心1min，去除残留洗液；
7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附模中央加入50μl洗脱液EB，静置1min，室温离心1min；
8)质粒保存在-70℃
3.质粒DNA的检测
3.1琼脂凝胶电泳分析：配制0.8％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)，取1μl质粒DNA进行电泳，检测提取的质粒DNA。
3.2应用引物ForwardH PCR Primer和ReverseH PCR Primer进行PCR鉴定。PCR的反应体系如下：
Mg2+ 1.5μl
Tag酶 0.1μl
10×buffer 2.0μl
dNTP 0.4μl
引物 1.0μl
DNA菌液 1.0μl
H2O 14.0μl
总体系 20μl
反应条件：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃3min
3.3紫外分光光度计分析：取1μl质粒DNA用69μl超纯水稀释，在自动紫外分光光度计下检测A260nm和A280nm处的吸光值，以测定质粒DNA的浓度和纯度。
4.胃癌细胞培养及质粒的转染BGC823细胞培养在含10％新生牛血清的RPMI-1640中，置于37℃，5％CO2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒5μg加入250μl opti-MEM，轻轻混匀，按LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen)说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分五组，分别为空白对照组，8μl∶4μg组，10μl∶4μg组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入500μl转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37℃培养6h后，补加新鲜的含10％新生牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后48h于荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。
5.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测
5.1提取总RNA取转染后的胃癌细胞BGC823，用PBS漂洗2次，按106-107个细胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下续反应。
5.2cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50℃30min，99℃5min，5℃5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI22μl，10X RTBuffer 1μl，dNTPs混合物1μl，RNase Inhibitor 0.25μl，AMV Reverse Transcriptase0.5μl，Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μl，RNA 4.8μl；然后取cDNA 1μl在PCR仪(PE5700)中进行扩增，反应条件为94℃2min一个循环，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min共30个循环，反应总体系为20μl，包括5X PCR buffer 5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRa ExTaq HS酶0.125μl，DEC1上、下游引物各1μl，内参β-actin上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。
目的基因PCR引物序列及扩增片段长度
6.蛋白水平验证DEC1表达的变化
6.1培养细胞蛋白提取步骤：取出培养细胞，弃去旧培养液，冰预冷PBS洗1次。加1×SDS Loading buffer裂解细胞，用细胞刮子将细胞刮下来，并转移至Ep管中，保持在冰上。剪切DNA 10-15s，降低样本粘滞度。95～100℃加热10min，冰上冷却，4℃离心11000×4min。吸取上清至0.5m 1Ep管中，-80℃保存。
6.2蛋白样品电泳步骤：先灌入约4ml的分离胶，凝固约30min；接着灌入约1ml的浓缩胶，凝固约20min。将胶板放入电泳槽中，加满电泳液。将蛋白样品加入到孔里，4℃90v电压电泳1.5～2h。
6.3转膜步骤：PVDF膜处理：甲醇浸泡10s，去离子水浸泡5min，1×转移缓冲液浸泡15min。(剪膜时戴手套，防止手上沾染的蛋白污染膜)。由负极到正极，按照三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸的顺序放好。(膜的大小≥滤纸的大小＞胶的大小；各层之间不能出现气泡)，4℃稳流50mA转移12～14h。
6.4抗体孵育步骤：转膜后用25ml TBS洗膜，室温5min。室温用封闭缓冲液孵育膜1h(摇床上摇)。25ml TBST洗膜3次×5min/次。一抗稀释液孵育膜轻微振荡4℃过夜。TBST洗膜3次×5min/次。HRP-标记的二抗稀释液(用封闭液稀释)室温孵育膜1h。TBST洗膜3次×5min/次。将滤膜放在瓶皿中，加入适量的新鲜配置的DAB底物溶液，5-15分钟即可显色，用水冲洗终止反应并照相。
四、结果
1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于6557bp和4361bp之间，已知构建好的质粒大小约为7960bp左右。
2.紫外分光光度计检测结果如下表所示各质粒浓度如下；各质粒的A260/A280比值均在1.80左右，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。
紫外分光光度计检测所提质粒DNA的浓度和纯度
| DEC1-siRNA1 | DEC1-siRNA2 | 空载体对照 | |
| 质粒浓度(μg/μl) | 1.32 | 1.20 | 1.34 |
| A260/A280 | 1.860 | 1.839 | 1.823 |
3.PCR鉴定结果应用引物ForwardH PCR Primer和ReverseH PCR Primer进行PCR鉴定(见图3)。
4.测序结果通过测序(图4)验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了DEC1-siRNA1/2。
5.转染率计算结果在转染后48h于流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒载体为8μl∶4μg转染效果最好(见图5所示转染率为85％)，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例。当脂质体体积更大时(10μl∶4μg)，转染率没有显著增加。
6.RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，各组均可见DEC1基因的特异性条带(395bp)和内参β-actin主带(512bp)，与空载体对照的条带比较可发现DEC1-siRNA1和DEC1-siRNA2的DEC1条带亮度都有所减弱，其中以DEC1-siRNA2更为明显，抑制率为52％，说明该质粒抑制DEC1的效率较高。
7.Western bloting检测DEC1-siRNA干扰质粒对DEC1表达水平的影响转染后48小时，提取各实验组细胞总蛋白，Western bloting检测，在约45kD位置出现了目的蛋白表达，DEC1和GAPDH的灰度比值显示，DEC1-siRNA1和DEC1-siRNA2的DEC1条带亮度都有所减弱，其中以DEC1-siRNA1更为明显，抑制率为43％，说明该质粒抑制DEC1的效率较高(见图7)。
Claims (2)
1.靶向DEC1基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGreenPuro shRNA Cloning andExpression vector为载体，针对人分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)编码区上、下游的两段序列，在较高表达DEC1的胃癌细胞系BGC823中发挥RNA干扰作用；这两段DEC1特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’，起始于661位；②5’-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，起始于2476位，由以下方法制得：
(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成
选择DEC1基因编码区的两段序列①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’、②5’-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下：
①DEC1寡核苷酸序列1：
正义链：
5’-GATCCCATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAACTTCCTGTCAGATTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAACATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAATCTGACAGGAAGTTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGG-3’
②DEC1寡核苷酸序列2：
正义链：
5’-GATCCCCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAACTTCCTGTCAGATTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAAAATCCGGAAACTCTTCGATTCGAACCTCTGACAGGAAGTTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGG-3’
(2)将步骤(1)合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；
(3)质粒的鉴定
将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用引物Forward sequencing primer H和Reverse sequencing primerH进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGreenPuro shRNACloning and Expression vector质粒中。
2.权利要求1的靶向DEC1基因的siRNAs表达载体在制备治疗表达DEC1的胃癌的基因药物中的应用。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: JI NAN CELL BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: WANG YUNSHAN Effective date: 20120525 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Henghuan Inventor after: Jia Yanfei Inventor after: Zheng Yan Inventor after: Ma Xiaoli Inventor after: Xiao Dongjie Inventor after: Sun Shanhui Inventor after: Wei Yan Inventor after: Wang Yunshan Inventor after: Cai Pingping Inventor before: Wang Yunshan Inventor before: Jia Yanfei Inventor before: Zheng Yan Inventor before: Ma Xiaoli Inventor before: Xiao Dongjie Inventor before: Sun Shanhui Inventor before: Wei Yan |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 250013 JINAN, SHANDONG PROVINCE TO: 250101 JINAN, SHANDONG PROVINCE Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WANG YUNSHAN JIA YANFEI ZHENG YAN MA XIAOLI XIAO DONGJIE SUN SHANHUI WEI YAN TO: WANG HENGHUAN JIA YANFEI ZHENG YAN MA XIAOLI XIAO DONGJIE SUN SHANHUI WEI YAN WANG YUNSHAN CAI PINGPING |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20120525 Address after: 250101 Shandong city of Ji'nan province high tech Zone Shun Road No. 750 B201 Applicant after: Jinan Cell Bio-Technology Co., Ltd. Address before: 250013 central laboratory, No. 105, Jiefang Road, Lixia District, Shandong, Ji'nan Applicant before: Wang Yunshan |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120718 Termination date: 20140921 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |