CN102037930A - 新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
一种新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法，包括在低氧条件下培养怀孕动物，并采用消炎痛对所述怀孕动物进行处理，处理量：0.5mg/kg，一日两次，连续3天，低氧条件为小于20％的氧浓度。本发明由于应用低氧检测系统和腹腔内注射消炎痛，本发明的PPHN大鼠模型的构建更加精确与稳定，模型的可复制性也较强；并且我们应用BNP间接测定新生大鼠的肺动脉压力，使该模型的构建更加可靠。相对于大型动物PPHN模型的构建过程，此大鼠PPHN模型易于建立，时间周期较短，价廉，方便以及稳定可靠，适于实验室研究应用。
Description
技术领域
本发明属生物领域，涉及一种新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法。
背景技术
新生儿持续性肺动脉高压(persistent pulmonary hypertension of the newborn，PPHN)是指生后肺血管阻力持续性增高，肺动脉压超过体循环动脉压使由胎儿型循环过渡至正常“成人”型循环发生障碍，导致卵圆孔及(或)动脉导管水平血液的右向左分流，临床表现为严重的低氧血症，多见于足月儿及过期产儿。PPHN是新生儿重症监护室的一个重要的临床问题，它在新生儿中的发病率可高达7/1000。机械通气、吸入一氧化氮(nitric oxide，NO)以及体外膜肺氧合等治疗措施虽然改善了PPHN的预后，但死亡率仍然较高。
PPHN的病理学特征表现为右心室肥厚、肺动脉中层肥厚、肺小动脉远端肌化、肺毛细血管密度减少。迄今为止，PPHN发病机制已经从肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞水平进行了研究，但确切的机制尚未完全阐明。传统的PPHN动物模型可以由低氧、动脉导管关闭、药物(消炎痛)、胎粪吸入以及内毒素血症等诱导。目前PPHN研究的动物模型大多数基于外科手术结扎胎羊动脉导管而诱导的。羊PPHN模型可以实时监测肺动脉压力以及可以进行气管插管以模拟PPHN生后的病理演变过程，但同时也存在一定的缺点，譬如动脉导管结扎手术难度较大、动物妊娠周期较长、动物购买费用昂贵等。
尽管低氧和消炎痛单独处理新生鼠可以诱导类似于PPHN的肺血管结构变化。然而，Geggel等研究认为单单慢性胎鼠缺氧尚不足以引起与PPHN相似的肺动脉结构改变，而且直接测定新生鼠肺动脉压力相当困难。
近来，脑型利尿肽(brain-type natriuretic peptide，BNP)已逐渐成为一种能够反映右心室压力负荷的标记物。BNP主要是在容量负荷、压力负荷以及心室应激的情况下由心室所分泌，而且BNP不能通过胎盘，新生儿BNP水平一般不受母亲条件的影响。因此，BNP水平可以作为诊断新生儿肺动脉高压的潜在的生物标记物。Reynolds等报道血浆BNP初始浓度大于550pg/ml可以预测PPHN，其敏感性为83％、特异度为100％；而且所有的PPHN患儿血浆BNP浓度均大于835pg/ml。
由低氧或消炎痛单个处理因素所诱导的模型已经被研究，然而由低氧联合消炎痛共诱导的动物模型还没有报道。我们假设，与单个处理因素相比，低氧联合消炎痛处理能够引起新生大鼠更加显著的肺血管重构。我们也假定新生大鼠血浆BNP水平将能够反映增加的肺动脉压力，可以间接地反映PPHN模型的建立。
发明内容
本发明的目的是提供一种新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法，所述方法包括在低氧条件下培养怀孕动物，并采用消炎痛对所述怀孕动物进行处理，通过以下步骤实现建模：
将体重在250-300g雌性SD大鼠交配过夜(计作d0天)，第二天标记为妊娠第一天(d1)，该模型中大鼠妊娠期是21天，在妊娠的第19天，孕鼠被随机分为四组开始低氧处理，即低氧组、消炎痛组、低氧和消炎痛联合处理组以及对照组，所有的处理持续3天，通过腹腔内输入消炎痛对培养的怀孕动物进行处理；腹腔内输入消炎痛，0.5mg/kg，一日两次，连续3天；消炎痛首先溶解在95％的酒精中并用孔径0.2um的过滤器除菌后4℃保存，在输入前用注射用水稀释至38％酒精浓度，输入量0.5mg/kg，一日两次，连续3天。低氧条件下培养怀孕动物3天，低氧条件为小于20％的氧浓度，优选12％的氧浓度。
本发明的有益之处是：由于应用低氧检测系统和腹腔内输入消炎痛，本发明的PPHN大鼠模型的构建更加精确与稳定，模型的可复制性也较强；并且应用BNP间接测定新生大鼠的肺动脉压力，使该模型的构建更加可靠，十分适于实验室研究应用。相对于大型动物PPHN模型的构建过程，此大鼠PPHN模型易于建立，时间周期较短，价廉，方便以及稳定可靠。本模型采用了测定血BNP的方法来无创评价肺动脉高压，在动物模型中尚没有报道过。
附图说明
图1为低氧装置。
图2为心脏组织HE染色。
图3为肺小动脉免疫组化图。
图4为肺组织成纤维细胞α-SMA表达。
图5为肺组织VG染色图片。
图6为肺动脉内皮细胞eNOS表达。
图7为肺动脉内皮细胞电镜图谱。
图8为Western blot图片。
具体实施方式
本发明结合实施例和附图作进一步的说明。
实施例1
1、动物模型的建立
体重在250-300g雌性SD大鼠交配过夜(计作d0天)，第二天标记为妊娠第一天(d1)。该模型中大鼠妊娠期是21天，在妊娠的第19天，孕鼠被随机分为四组开始低氧处理，即低氧组、消炎痛组、低氧和消炎痛联合处理组以及对照组。所有的处理持续3天。
低氧组：将孕d19大鼠放于12％氧浓度的有机玻璃盒中，连续3天。低氧装置参见图1，是将氮气瓶2中的氮气(约87％)和氧气瓶3中的氧气(约12％)共同通向一个带有两个小孔的有机玻璃盒1，使得有机玻璃盒1内的氧浓度维持在12％左右，盒内放置有钠石灰与无水氯化钙(各20-30g/天，每天更换)用于吸收CO2与水分。氧浓度由测氧仪进行持续的检测。
消炎痛组：消炎痛首先溶解在95％的酒精中并用孔径0.2μm的过滤器除菌后4℃保存。在注射前用注射用水稀释至38％酒精浓度，腹腔注射0.5mg/kg，一日两次连续3天。
低氧联合消炎痛组：将孕d19大鼠放于12％氧浓度的有机玻璃盒中，并腹腔内注射消炎痛，0.5mg/kg，一日两次，连续3天。
对照组：置于空气中，并且在孕19-21天时与实验组孕鼠接受相同频率和相同体积的生理盐水处理。
在怀孕第22天，按照50mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉孕鼠并迅速剖腹取出胎鼠。新生鼠处死后立即取肺并液氮速冻，然后-80℃保存。部分心肺被取出后用福尔马林4℃固定24小时；组织用石蜡包埋然后切成厚度45μm的薄片，用于HE染色、VG染色以及免疫组化。结果参见图2，(A)对照组、(B)低氧组、(C)消炎痛组、(D)低氧加消炎痛联合处理组，显示联合处理组右心室壁明显增厚。RV＝右心室，LV＝左心室。
2、动物模型的评价
每只胎鼠在分娩后立即测量其体重。心脏被横断面切开，测量右心室游离壁和整个心脏的重量。通过α-SMA染色测量直径＜100um和≥100um的肺小动脉的中层的厚度，以及平滑肌所占面积；用eNOS免疫染色分析肺动脉内皮细胞中eNOS表达丰度；用VG染色方法来研究血管外膜弹力蛋白的相对含量。一个系统随机的抽样方法被用来评估每个变量，终末细支气管用来作为寻找肺小动脉的标志。Image Pro Plus软件被用来进行上述测量。
(1)免疫组化
4-5μm厚的石蜡切片用于光学显微镜的免疫组化。切片脱水并转移至含3％过氧化氢的100％的甲醇中，以除去内源性的过氧化物酶的作用。之后用PBS漂洗切片，用终止血清终止反应10分钟，然后用主要针对平滑肌特异性的a肌动蛋白(α-SMA)或者内皮一氧化氮合酶的抗体进行孵育过夜。对照组切片用PBS代替抗体孵育过夜。切片再与二抗山羊抗体(HRP多聚体37℃孵育30分钟)。加入DAB(3-3’-二氨基联苯胺)显色剂，就能在荧光显微镜下看到切片并能观察其颜色变化。每只胎鼠的肺至少取8个切片并用来研究。
(2)电子显微镜
肺组织用2.5％的戊二醛灌注。选取小块肺组织并用戊二醛在4℃固定24小时，然后用磷酸盐缓冲液处理；组织块脱水并用EPON包埋，然后切片并用氨基甲苯胺蓝染色，包含小动脉的组织块切成超薄的切片，超薄片用透射显微镜观察。
(3)Western blot测定α-SMA，弹力蛋白和eNOS蛋白的含量
肺组织总蛋白用RIPA裂解液提取，并用BCA方法测定蛋白浓度。30ug蛋白被加入8-10％SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后将蛋白转移到PVDF膜上，PVDF膜用5％的脱脂奶粉T-TBS溶液室温下孵育2小时然后膜用抗α-SMA，elastin，和eNOS的抗体4℃孵育过夜，并用过氧化物酶结合的二抗室温下孵育60分钟。
(4)BNP测量
将十只胎鼠的血液共2ml收集于肝素抗凝管，4℃1600g离心15分钟取血浆-80℃冻存备用。用Phoenix Pharma EIA试剂盒测定BNP的浓度。
结果
(1)物理测量
实验组动物(包括缺氧组，消炎痛组，缺氧和消炎痛联合作用组)中可以观察到右心室游离壁的厚度明显增厚。左心室游离壁加上室间隔与右心室的重量的比值，正常对照组(生理盐水)为2.89±0.146，经过缺氧和消炎痛联合作用3天后显著降低到2.37±0.089。虽然心室重量的比值在缺氧和消炎痛联合作用组中的比值最高，但是与缺氧组和消炎痛组相比，没有明显的统计学诧异。
(2)组织学测量
通过对α-SMA蛋白进行免疫组化分析直径＜100um和≥100um的肺小动脉发现，中膜与中膜加内腔面积的比率在消炎痛和缺氧联合作用组最高。动脉中层和中层加内腔厚度的比值在联合作用组中与其它两组相比也是最高的。此外，成纤维细胞中α-SMA的表达量在缺氧和消炎痛作用组中比其它两组都显著增高。结果参见图3和图4，图3为来源于对照组(A)、低氧组(B)、消炎痛组(C)、低氧加消炎痛联合处理组(D)的肺组织抗α-SMA的免疫组化图，与正常组比较，各个处理组的肺动脉中膜明显增厚，尤其以联合处理组最为明显。直方图E为直径＜100μm肺小动脉中膜厚度的百分比(中膜厚度/(中膜厚度+血管内腔直径)x100％)，可见低氧加消炎痛联合组较单个处理组或对照组明显增加。直方图F为直径≥100μm的肺小动脉中膜厚度的百分比，可见在低氧加消炎痛联合组中是最高的。*表示与对照组相比较(P＜0.05)，**表示与对照组或单个处理组相比较(P＜0.05)。图4为来源于对照组(A和B)、低氧组(C)、消炎痛组(D)、低氧加消炎痛联合处理组(E和F)的肺组织抗α-SMA的免疫组化图，可见低氧加消炎痛联合处理组表达α-SMA的成纤维细胞明显增多。
通过使用VG染色技术，可观察到弹力蛋白在动脉外膜面积中所占的比率在缺氧和消炎痛联合组是最高的。这些变化表明暴露与缺氧和消炎痛中肺组织纤维化的趋势。结果参见图5，与对照组(A)相比，低氧组(B)、消炎痛组(C)、低氧加消炎痛联合处理组(D)的肺小动脉外膜的弹力蛋白表达明显增加，尤其以联合处理组最为明显，直方图(E)为各组的肺动脉外膜弹力蛋白所占面积的相对百分比，可见联合处理组较其它各组明显增加。*表示与对照组相比较(P＜0.05)，**表示与对照组或单个处理组相比较(P＜0.05)。
对eNOS蛋白进行免疫组化染色以检测内皮细胞增生。与其它两组相比，表达eNOS的内皮细胞的数量在缺氧消炎痛联合作用组的肺动脉中显著增加。肺动脉内皮细胞中eNOS免疫染色的密度在对照组、缺氧组、消炎痛组以及缺氧消炎痛联合处理组中分别为9.5+1.0，43.7+6.9，55.4+10.9和87.5+6.6，该值在缺氧加消炎痛联合组比其它组显著增高。然而显著的肺动脉内膜增生在所有组织中都没有观测到。结果参见图6，是来源于对照组(A)、低氧组(B)、消炎痛组(C)、低氧加消炎痛联合处理组(D)的肺组织抗eNOS的免疫组化图，可见联合处理组的肺动脉内皮细胞的eNOS表达明显增加。直方图(E)为各组内皮细胞内eNOS蛋白表达的相对光密度，可见联合处理组是最高的，提示eNOS蛋白表达最为明显。*表示与对照组相比较(P＜0.05)，**表示与对照组或单个处理组相比较(P＜0.05)。
(3)电子显微镜
内皮细胞增生和细胞外基质沉积在缺氧消炎痛联合处理组动物的肺动脉中可见，而在缺氧或者消炎痛单独作用组中未观察到。结果参见图7，来源于对照组(A)、低氧加消炎痛联合处理组(B和C)电镜图片，可见联合处理组的肺动脉内皮细胞(B，箭头所示)和细胞外基质(C，箭头所示)增加。
(4)Western blots
a-SMA蛋白表达水平在缺氧和消炎痛联合组中是最高的，这进一步证明了只有联合作用组可以引起显著的大鼠肺血管重塑。弹力蛋白的水平在消炎痛组和缺氧消炎痛联合组中比对照组显著升高。与弹力蛋白类似，α-SMA蛋白水平在消炎痛作用组和缺氧消炎痛联合作用组中也是显著升高。而且，eNOS蛋白水平在缺氧加消炎痛联合组比其它两组显著升高。α-SMA，弹力蛋白和eNOS蛋白表达水平的升高表明肺动脉重塑的程度在缺氧加消炎痛联合组比其它组更加显著，同时也间接的说明了肺动脉压力在缺氧加消炎痛联合组比其它组要更加明显。结果参见图8，来源于对照组、低氧组、消炎痛组、低氧加消炎痛联合处理组的α-SMA(A)、elastin(C)、eNOS(E)蛋白Western blot图片。可见在联合处理组组中各个蛋白的表达水平为最高。直方图B、D、F分别为α-SMA、elastin、eNOS蛋白Western blot图片相对光密度比值。*表示与对照组相比较(P＜0.05)，**表示与对照组或单个处理组相比较(P＜0.05)。
(5)血浆BNP水平
血浆BNP浓度在对照组、低氧组、消炎痛组以及低氧加消炎痛组分别是143±35pg/ml、706±32pg/ml、735±44pg/ml和873±63pg/ml。与其他组相比较，血浆BNP水平在缺氧消炎痛联合作用组中显著升高(p＜0.05)，这表明肺动脉压力在改变组中比在缺氧或者消炎痛单独作用组中要高。
Claims (10)
1.一种新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括在低氧条件下培养怀孕动物，并采用消炎痛对所述怀孕动物进行处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述怀孕动物为大鼠。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述怀孕动物为孕21天的大鼠；
优选地，所述大鼠为SD大鼠。
4.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述大鼠在孕19天进行低氧条件下培养。
5.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述低氧条件为12％的氧浓度。
6.如权利要求1-5所述的方法，其特征在于，所述低氧条件为12％的氧浓度。
7.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养怀孕动物3天。
8.如权利要求1-7所述的方法，其特征在于，将怀孕动物在低氧条件下培养3天。
9.如权利要求1-8所述的方法，其特征在于，采用腹腔内输入消炎痛对培养的怀孕动物进行处理；
优选地，先将消炎痛溶解于水和/或酒精的溶剂中再进行腹腔输入；
进一步优选地，先将消炎痛溶解于95％的酒精中，过滤除菌后用注射用水稀释至38％酒精浓度，再进行腹腔输入。
10.如权利要求1-9所述的方法，其特征在于，所述消炎痛的处理量为0.5mg/kg，1日2次，连续处理3天。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103416346A (zh) * | 2012-05-22 | 2013-12-04 | 浙江中医药大学 | 一种多因素联合刺激致紧张性高血压动物模型的制备方法 |
| WO2021155866A1 (zh) * | 2020-02-07 | 2021-08-12 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 一种广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型的制备与应用 |
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2010
- 2010-08-27 CN CN 201010269477 patent/CN102037930A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
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