CN102030821A - 人胎盘抗衰老活性蛋白及其分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人胎盘抗衰老活性蛋白及其分离方法和应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。其分离或克隆方法包括：(1)克隆人靶标基因或靶标基因结构域；(2)在细菌、酵母或真核细胞中，建立高通量筛选平台；(3)建立人胎盘cDNA文库；(4)将所建立的人胎盘cDNA文库导入步骤(2)所构建的高通量筛选平台，采用蛋白折叠和相互作用的可视化方法，筛选引起靶标基因或靶标基因结构域的蛋白质折叠变化的人胎盘蛋白，即得。本发明人胎盘活性蛋白具有体外扩增骨髓造血干/祖细胞细胞具有有效而价廉的特点。本发明人胎盘活性蛋白能使小鼠的寿命增加大约15％，可用于制备抗衰老或抗氧化药物或保健品。

Description

人胎盘抗衰老活性蛋白及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗衰老活性蛋白，尤其涉及一种从人胎盘中所分离、克隆的具有调控细胞自我更新功能的活性蛋白，本发明还涉及该活性蛋白的分离、克隆方法，本发明进一步涉及该活性蛋白在抗衰老中的应用，属于抗衰老活性蛋白领域。

背景技术

人胎盘含有多种原始生命活性物质和营养成分，更重要的是它含有人体干细胞-人体起源细胞发生和发展所需的全部活性物质和全部营养成分。干细胞具有自我复制和多分化潜能的能力，能形成人体各种组织器官的细胞，能定向恢复人体受损、衰老、退化和病变的细胞、器官和组织。干细胞有望解决人类面临的许多医学难题，具有不可估量的医学价值，成为本世纪最重要的生物治疗手段。

美国《时代》杂志在2007年评出了当年十大科学发现，其中的发现之一就是两本权威期刊《Cell》及《Science》在2007年11月20日同时刊出来自美国及日本两个研究团队的一项报告，证实皮肤细胞经过“基因直接重组后可以转化成为具有胚胎干细胞特性的细胞。这项发现一方面解决了利用胚胎进行干细胞研究的道德争议，另一方面也使得干细胞研究的来源更不受限。这两个研究团对分属于日本京都大学及美国威斯康辛大学麦迪逊分校的两个团队虽然独立研究，但使用的方法几乎完全相同，更巧合的是竟然同时分别被两本期刊审核通过，证明基因直接重组技术的确有效。他们所使用的方式都是利用病毒将四个基因送入皮肤细胞，促使普通的皮肤细胞产生变化，最后成为带有胚胎干细胞性质的细胞，称为诱导式多能性干细胞。

在这两个研究团队中，日本京都大学山中伸弥发现只需要将四个基因Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4送入已分化完全的小鼠纤维母细胞，即可以把纤维母细胞重新设定变回具分会全能性的类胚胎干细胞“诱导式多能性干细胞”。而美国威斯康辛大学的汤姆森(JamesThomson)研究团队则利用了OCT4，SOX2，NANOG，and LIN28四个核心基因，同样也可以将人类体细胞重新设定变回干细胞。

既然生命体最初是从一个干细胞发育而成，干细胞的万能分化和再生特又使干细胞具有特殊的重要意义，那么干细胞基因家族可是说是生物机体里最重要的基因家族了，因为干细胞具有再生和惊人的分化能力，是很多组织，器官和细胞的根源和起始。根据山中伸弥教授和汤姆森教授团队的研究最初需要四个诱导式多能性干细胞核心基因Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4或者OCT4，SOX2，NANOG，LIN28。但是最近德国马普研究所舒乐教授(Hans R.

)团队发表在《Cell》上的文章把这项工作推向了更进一步，他们只用了一个基因OCT-4就成功的在体细胞中诱导出了多能性干细胞iPS！值得指出的是舒乐教授是在神经细胞中只用一个OCT4基因就诱导出了多能性干细胞，而神经细胞的分化和发育是所有组织细胞中很难的一类，这也从另一个方面说明了OCT4基因的重要性！OCT4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，同时也是体外建立诱导多功能干细胞(iPS)的关键基因。OCT4基因在干细胞的增殖、分化、应激反应、凋亡过程等多个生物学过程中发挥着重要作用。OCT4基因含有一种叫POU的功能区域，POU的意思是(Pit OctUnc)，POU编码的POU蛋白DNA结合蛋白，对维持细胞多能性有重要作用。相信对与OCT4的研究将会讯速展开，因为OCT4不只是一个干细胞的全能控制基因，也可以说是生命机体里最重要的一个基因。

在动物细胞内和在其正常的生理状况下，大量存在着一些处于无功能状态的、非结构性的、或仅具有部分结构的蛋白，但这恰恰是它们的一般正常存在状态。一旦他们与其目标蛋白(偶联蛋白)相接触，这些无序蛋白质立即转变为结构型蛋白。这一过程经常涉及到细胞功能调节。蛋白-蛋白相互作用中，普遍存在偶联蛋白的折叠和结合；偶联蛋白的折叠和结合为多细胞生物体提供了重要的有益作用。

蛋白质Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR在体内的折叠并不是一个独立的过程，而是与其它众多的蛋白质的相互作用有关；比如分子伴侣，能在细胞内帮助新生肽链的折叠，而不参予新生肽的最终结构。在试管里对于蛋白质折叠的研究的结果，未必能够真实地反映蛋白质在体内的折叠过程，例如线粒体内蛋白质的浓度非常高，在试管内是难以达到如此高的蛋白质浓度的。在高蛋白质浓度下，蛋白质与蛋白质相互作用更易于发生，酶反应动力学就不适合用米氏方程式来表达，而且平时被忽略的水浓度也会影响酶促反应；此外细胞不是均匀的容器，细胞内有膜结构与微管系统将它分成许多功能小区。因此，由某些研究证明有相互作用结构基础的蛋白质，并不能表明这二个蛋白质在细胞内是否会相遇、或者这种相互作用在细胞内是否确实发生。因此，在整体细胞内进行Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR蛋白质与蛋白质相互作用的研究，具有非常重要的意义；在整体细胞内获得的蛋白质与蛋白质间相互作用的结果，可能更能反映体内这些作用在真实情况。

发明内容

本发明目的之一是提供一种从人胎盘中所分离、克隆出的抗衰老活性蛋白；

本发明目的之二是提供一种从人胎盘中分离、克隆出上述抗衰老活性蛋白的方法；

本发明目的之三是将述抗衰老活性蛋白制备成抗衰老、抗氧化的药物。

本发明上述是通过以下技术方案来实现的：

一种从人胎盘中所分离、克隆出的抗衰老活性蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；

编码SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列也当然属于本发明的保护之列，此外，含有该核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也属于本发明要保护的范畴。

本发明还提供了一种从人胎盘中分离、克隆出的抗衰老活性蛋白(SEQ ID NO：1)的方法，该方法包括以下步骤：

(1)克隆人Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR基因，得到靶标基因；或者克隆人TOR结构域基因，得到靶标基因结构域；

(2)在细菌、酵母或真核细胞中，建立高通量筛选平台，用于筛选能在体内与上述靶标基因或靶标基因结构域相互作用的蛋白；

(3)建立人胎盘cDNA文库；

(4)将所建立的人胎盘cDNA文库导入步骤(2)所构建的高通量筛选平台，采用蛋白折叠和相互作用的可视化方法(PNAS.Vol.100，No.2，p478-483)，筛选引起靶标基因或靶标基因结构域的蛋白质折叠变化的人胎盘蛋白，得到人胎盘康衰老活性蛋白。

本发明将从人胎盘中所分离、克隆到的人胎盘康衰老活性蛋白分别构建其高效表达的基因工程大肠杆菌、真菌或动物细胞，可实现蛋白的大规模生产和纯化的工艺流程。

OCT4，SOX2，c-Myc，Klf4，NANOG，and LIN28可以将人类体细胞重新设定变回干细胞。本发明从人的胎盘组织中，筛选出能与性的Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4，OCT4，NANOG，LIN28作用的活性蛋白，这些活性蛋白因此具有调控细胞自我更新的功能。本发明再从其中，筛选出那些具有抗衰老作用的活性蛋白，由此开发出应用与延缓衰老和延长生命，与整个人胎盘生物制剂作用近似、或作用相同的基因工程生物药品。

对于可能是天文数字的胎盘蛋白，需要相应快速简便有效的筛选鉴定方法。蛋白的折叠和相互作用的可视化技术，可以满足该实验的需要。对于体内Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR基因和(或)TOR结构域蛋白折叠的变化，用培养细菌的整体细胞绿色荧光(GFP)强度的变化来显示。(Visualization of the CoupledProtein Folding and Binding in Bacteria，Haoyong Wang，Shaorong Chong PNAS.Vol.100，No.2，p478-483.)，用蛋白质体内相互作用可视化技术、用Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR基因和(或)TOR结构域，建立抗衰老活性蛋白的细胞内高通量筛选平台。

人胎盘活性蛋白的单独作用及多蛋白的协同作用的研究结果表明，人胎盘活性蛋白具有体外扩增骨髓造血干/祖细胞细胞具有有效而价廉的特点。观察人胎盘活性蛋白抗衰老作用的动物实验结果表明，人胎盘活性蛋白能使小鼠的寿命增加大约15％。本发明所分离的人胎盘活性蛋白可用于制备成抗衰老或抗氧化药物或保健品。

附图说明

图1蛋白质的折叠变化可视性载体。

图2构建人胎盘cDNA文库蛋白的载体构建。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1  克隆人Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR基因和(或)TOR结构域基因

从人胎盘组织中克隆这些基因。它们的Genebank编号分别为：S81255.1；NM_003106.2；NM_004235.4；NM_024865.2；CAA25288.1；NP_078950.1；P42345.1；P42345.1。以Oct4为例人的克隆，具体步骤如下：

①人胎盘破碎

将600ul变性液置于1.5ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。将0.05g人胎盘用液氮冰冻。在液氮下，研磨组织块。待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。变性液组成：25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83％十二烷基肌氨酸钠、0.2mM β-巯基乙醇)。

②人胎盘RNA的抽提

经变性液匀浆的人胎盘600ul加60ul pH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器；加600ul酚\氯仿\异戊醇(25\24\1)，彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒；冰裕中10-15分钟；离心，4℃，10000g，20分钟；上层水相吸至无菌离心管中，加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA；离心4℃，10000g，20分钟；沉淀RNA，冷冻干燥15分钟，RNA沉淀重新溶于300ul变性液中，可振荡(有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短)；加60ul pH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器；600ul酚\氯仿\异戊醇(25\24\1)，彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒；冰浴10-15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟；上层水相吸至无菌离心管中；等体积异丙醇二次沉淀(-70℃，30分钟)，75％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去RNA酶的水中(对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。(酸性酚配制：55℃时，500g酚溶入500ml 50mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml 50mM，pH4.0乙酸钠，直到pH＜4.1。)

③用人胎盘的总RNA建立逆转录反应获得cDNA

试剂           浓度        体积μl

M-MLV          5×Buffer   8

dNTP           10mM        2

RNasin         40U/μl     1

M-MLV          200U/μl    2

RNA                        10

OCT4上游引物   10pM        1

OCT4下游引物   10pM        1

去离子水       DEPC处理    15

总体积                     40

混匀，离心，42℃ 60min。95℃ 10min(破坏MLV)。4℃保存

④PCR反应获得人OCT4

试剂           浓度        体积μl

Pfu DNA聚合酶       10×        10

Buffer

Pfu DNA聚合酶       2U/μl      2

dNTP                10mM        2

cDNA                            2

OCT4上游引物        10pM        1

OCT4下游引物        10pM        1

去离子水            DEPC处理    15

总体积                          100

反应条件为预变性94℃，5分钟；变性温度94℃，45秒，复性温度45℃，45秒，延伸温度为72℃，90秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟。获得长度为1.3kb的人OCT4基因片段。其中，上游引物的5’端加上EcoRI酶切位点以及SD序列(SD序列为在起始密码子ATG上游9-13个核苷酸处，可与核糖体16SrRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的一段共同序列，一般为AGGA。)下游引物的5’端加上PacI酶切位点。

上游引物5’GGTGAATTCGAGGAAGAAGACAACAATGAGAACCTTCAG 3’

下游引物5’AAATTTAATTAATTACTGGCGCCGGTTACAGAACCAC 3’

PCR扩增获得的长度为1.4kb的人OCT4基因片段和载体pUC19-pro质粒用EcoRI和PacI酶切后，克隆到pUC-pro的EcoRI和PacI酶切位点间；或克隆到pUC-pro的BamHI和PacI酶切位点间。对于结构基因的内部有EcoRI、BamHI和PacI酶切位点的结构基因，采用德国默克公司

系列定点突变试剂盒进行PCR定点诱变(DpnI法)，定点诱变去掉结构基因上所有的EcoRI、BamHI和PacI酶切位点而不改变结构基因编码的原有氨基酸序列。经过DNA测序，克隆人OCT4的序列为SEQ ID NO：2所示。

实施例2  在细菌、酵母和(或)真核细胞中，建立高通量筛选平台，用于筛选能在体内与上述靶标基因相互作用的蛋白

构建人Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR与GFP的融合蛋白表达质粒。GFP处于Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR的C端。通过观察细菌、酵母和(或)真核细胞GFP绿色荧光的强弱变化，来监测上游蛋白质的表达水平以及蛋白质的折叠变化情况。(图1，Promoter代表启动子，大肠杆菌用T7启动子，酵母Pichia用AOX1启动子，CHO细胞用CMV启动子)。

实施例3  筛选与Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR蛋白发生特异性作用的人胎盘活性蛋白

人胎盘总RNA提取：按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书提取总RNA。从液氮中取出人胎盘，称1g敲碎，迅速置研钵中，加液氮研成粉末，转至匀浆器中，待液氮挥发完全，加10ml TripureTM Isolation Reagent充分匀浆，加2ml氯仿混匀，作用5～10min，离心取上清，加5ml己丙醇混匀静置10min，离心收集沉淀，用75％乙醇洗涤收集沉淀凉干，用515μl DEPC水溶解RNA，取10μ1作紫外定量分析，确定RNA浓度，取5μl作琼脂糖凝胶电泳分析，确定RNA是否降解。

PolyA+mRNA提取：按Promega公司试剂盒说明书提取PolyA+mRNA。将上述提取的500μl总RNA在65℃水溶中解聚10min，加3μl Biotinylated-Oligodt、13μl 20×SSC室温孵育10min，将此退火的Oligodt-mRNA杂交产物加于含SA-PMP的柱上，经4次洗涤后，用洗脱液洗下Pol yA+mRNA，经乙醇沉淀洗涤后，用5μl DEPC水溶解mRNA，取2μl作琼脂糖凝胶电泳，确定mRNA的分子大小及初步定量。

cDNA的合成：按Clontech PT3000-2kit说明书进行。取3μlmRNA作模板、1μl Smart Oligonucleatide、1μl 3’Primer、20μl M-MLV反转录酶合成第一链；取2μl第一链cDNA作模板、2μl 5’PCR Primer、2μl 3’Primer、2μl 50×Advantage KlenTaq Polymer ase Mix合成第二链。在第二链合成时，cDNA：RNA杂交链上的RNA经Rnase H酶解，在DNA Polymerase的催化下将RNA置换成DNA。取5μl作电泳确定双链cDNA的大小，其余经末端补平、加衔接头、磷酸化，过cDNA size fractionation column以去除分子量小于400bp的cDNA片段。

cDNA的克隆与鉴定：将75ng的cDNA与500ng的λTripleX Arms连接，按Boehringer Mannheim公司的DNA Packaging kit包装噬菌体，并以XL-1 blue作受体菌滴定文库的滴度和重组率，并扩增文库。扩增库的滴度为3×10⁹pfu/ml。

构建人胎盘cDNA片段的大肠杆菌库和真菌库：用将上述PCR扩增突变产物构建滴度为10⁸的以上的蛋白表达库；构建方式如图2所示，胎盘cDNA与Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR同在一个载体上共同表达。(图2，大肠杆菌用T7启动子，酵母Pichia用AOX1启动子)。

根据培养细胞的细胞绿色荧光强弱来进行目的克隆的初步筛选和鉴定：对于Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR与GFP融合蛋白，N端蛋白在细胞内倾向于形成聚集体时其下游GFP不能很好地折叠，导致整体细胞的绿色荧光较弱。经过诱导表达后的培养细胞，当与Oct4-GFP、Sox2-GFP、Klf4-GFP、NANOG-GFP、c-Myc-GFP、LIN28-GFP、TOR-GFP共同表达的外来DNA片段，编码了与Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR正确折叠无关的蛋白质时，培养细胞的绿色荧光将无明显地变化。而当外来cDNA片段，编码了能明显促进Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR正确折叠的蛋白质时，将可以观察到培养细胞的细胞绿色荧光明显增强。在用该研究方法筛选能改变Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR蛋白折叠的cDNA克隆的过程中，细胞停止培养后不需要加任何处理，可以直接用肉眼或仅用荧光检测仪进行对结果进行初步鉴别。筛选过程简单、试剂消耗费用非常低、结果可靠重、复性好。进行高通量筛选非常容易。

从中筛选出若干蛋白，经过DNA测序，其中一个能与OCT4相互蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

本方案筛选出一批能够与Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28或TOR蛋白发生特异性作用的人胎盘活性蛋白。经过DNA测序鉴定，它们分别为：Rex-1、FGF4、Utf1、FBX15、Cdx2、Zfp206、C/EBPα、PARP1、TGF-beta、Wnt，Hedgehog，Notch1、HSF1、cbp、actr、DJ-1、HSP70、CREB、NAC1、KBP1、p300、MIBP1。

实施例4  高效表达和纯化人胎盘活性蛋白

将由实施例3获得、能特异地与靶标基因相互作用活性蛋白，分别构建其高效表达的基因工程大肠杆菌、真菌或动物细胞。完成所有蛋白的大规模生产和纯化的工艺流程。它们分别为：Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR、Rex-1、FGF4、Utf1、FBX15、Cdx2、Zfp206、C/EBPα、PARP1、TGF-beta、Wnt，Hedgehog，Notch1、HSF1、cbp、actr、DJ-1、HSP70、CREB、NAC1、KBP1、p300、MIBP1。

以Oct4为例，获得Oct4cDNA片段，亚克隆入pUC19质粒中进行DNA序列测定.将Oct4cDNA片段克隆入原核表达载体pET28a中进行表达.表达产物经7mol/L盐酸胍裂解变性、复性、层析等一系列纯化研究，纯化产物经SDS-PAGE电泳，高压液相色谱法(HPLC)纯度分析及活性测定，并通过N末端氨基酸序列测定鉴定表达产物.结果RT-PCR扩增所得片段大小与预期值一致.pET28a-Oct4表达产物经SDS-PAGE电泳显示，分子量与预计结果相符.Oct4表达量占菌体总蛋白量的20％.表达产物纯化后，纯度达97％以上，比活性大于3.0IU/mg.纯化产物经N末端15个氨基酸测定验证，为重组人Oct4.

试验例1  人胎盘活性蛋白的单独作用及多蛋白的协同作用的评价

试验

多种人胎盘活性蛋白共存于一个动态的组织环境中，胎盘活性蛋白之间的多重相互作用，导致有效发挥生物学活性、调节细胞的生长过程。

将Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR、Rex-1、FGF4、Utf1、FBX15、Cdx2、Zfp206、C/EBPα、PARP1、TGF-beta、Wnt，Hedgehog，Notch1、HSF1、Cbp、Actr、DJ-1、HSP70、CREB、NAC1、KBP1、p300、MIBP1蛋白纯品，以特定的组合方式混合，对各种混合组进行细胞学实验。检查所分离的人胎盘康衰老活性蛋白单独作用及多蛋白的协同作用对骨髓造血干/祖细胞的体外扩增作用。

用已知的几种细胞因子作为对照进行比较，用人胎盘抗衰老活性蛋白(实施例3所分离的以下蛋白：Oct4、Sox2、Klf4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR、Rex-1、FGF4、Utf1、FBX15、Cdx2、Zfp206、C/EBPα、PARP1、TGF-beta、Wnt，Hedgehog，Notch1、HSF1、Cbp、Actr、DJ-1、HSP70、CREB、NAC1、KBP1、p300、MIBP1)悬液及IL-3，GM-CSF，IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO作为刺激因子，并应用甲基纤维素半固体培养体系对骨髓GM-CFU，GM-GEMM和BFU-E进行了培养和比较。

试验结果表明，人胎盘抗衰老活性蛋白对骨髓CFU-GM，CFU-GEMM和BFU-E体外扩增最适蛋白浓度是100-200μgL，人胎盘抗衰老活性蛋白对骨髓造血干/祖细胞的体外扩增效果优于单独IL-3，单独GM-CSF和IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO组。结论提示，本发明所分离的人胎盘抗衰老活性蛋白具有体外扩增骨髓造血干/祖细胞细胞具有有效而价廉的特点。

试验例2  人胎盘抗衰老活性蛋白抗衰老作用试验

试验方法：将雌雄各半的500只KM小鼠随机分为5组：空白对照组、模型组、高、中、低剂量给药组，每组10只。空白对照组皮下注射生理盐水，5g·mL-1，1次/天，模型组皮下注射人胎盘抗衰老活性蛋白(实施例3所分离的蛋白：SEQ ID NO：1)(1-10mg/kg)，1次/天，连续给药42天后，一部分处死，采血，分离血清并测定生化指标。结果：人胎盘活性蛋白能使小鼠血清GSH-Px活性明显上升。

试验结论：人胎盘抗衰老活性蛋白可延缓小鼠衰老，提高抗氧化能力。剩余250支小鼠在连续给药42天后，停药。继续喂养，直至小鼠死亡。结果：与对照组相比，人胎盘抗衰老活性蛋白能使小鼠的寿命增加大约15％。

序列表

<110>葛龙海

<120>人胎盘抗衰老活性蛋白及其分离方法和应用

<130>yuanben018

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>310

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>1

Met Ser Gln Gln Leu Lys Lys Arg Ala Lys Thr Arg His Gln Lys

1                5                   10                  15

Gly Leu Gly Gly Arg Ala Pro Ser Gly Ala Lys Pro Arg Gln Gly

                 20                  25                  30

Lys Ser Ser Gln Asp Leu Gln Ala Glu Ile Glu Pro Val Ser Ala

                 35                  40                  45

Vak Trp Ala Leu Cys Asp Gly Tyr Val Cys Tyr Glu Pro Gly Pro

                 50                  55                  60

Gln Ala Leu Gly Gly Asp Asp Phe Ser Asp Cys Tyr Ile Glu Cys

                 65                  70                  75

Val Ile Arg Gly Glu Phe Ser Gln Pro Ile Leu Glu Glu Asp Ser

                 80                  85                  90

Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu Lys Lys Gly Ser Glu Gln Gln

                 95                  100                 105

Leu Ser Gln Lys Val Phe Glu Ala Ser Ser Leu Glu Cys Ser Leu

                 110                 115                 120

Glu Tyr Met Lys Lys Gly Val Lys Lys Glu Leu Pro Gln Lys Ile

                125                 130                 135

Leu Pro Gln Lys Ser Leu Glu Tyr Ser Glu Tyr Met Thr Gly Lys

                140                 145                 150

Lys Leu Pro Pro Gly Gly Ile Pro Gly Ile Asp Leu Ser Asp Pro

                155                 160                 165

Lys Gln Leu Ala Glu Phe Ala Arg Lys Lys Pro Pro Ile Asn Lys

                170                 175                 180

Glu Tyr Asp Ser Leu Ser Ala Thr Ala Cys Pro Gln Ser Gly Cys

                185                 190                 195

Thr Arg Lys Leu Arg Asn Arg Ala Ala Leu Arg Lys His Leu Leu

                200                 205                 210

Ile His Gly Pro Arg Asp His Val Cys Ala Glu Cys Gly Lys Ala

                215                 220                 225

Phe Val Glu Ser Ser Lys Leu Lys Arg His Phe Leu Val His Thr

                230                 235                 240

Gly Glu Lys Pro Phe Arg Cys Thr Phe Glu Gly Cys Gly Lys Arg

                245                 250                 255

Phe Ser Leu Asp Phe Asn Leu Arg Thr His Val Arg Ile His Thr

                260                 265                 270

Gly Glu Lys Arg Phe Val Cys Pro Phe Gln Gly Cys Asn Arg Arg

                275                 280                 285

Phe Ile Gln Ser Asn Asn Leu Lys Ala His Ile Leu Thr His Ala

                290                 295                 300

Asn Thr Asn Lys Asn Glu Gln Glu Gly Lys

                305                 310

<210>2

<211>225

<212>DNA

<213>homo sapiens

<400>2

gacaacaatg agaaccttca ggagatatgc aaagcagaaa ccctcgtgca ggcccgaaag 60

agaaagcgaa ccagtatcga gaaccgagtg agaggcaacc tggagaattt gttcctgcag 120

tgcccgaaac ccacgctgca gcagatcagc cacatcgccc agcagcttgg gctcgagaag 180

gatgtggtcc gagtggtccg agtgtggttc tgtaaccggc gccag                 225

Claims (7)

1.一种从人胎盘中所分离、克隆出的抗衰老活性蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述抗衰老活性蛋白的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.一种分离、克隆权利要求1所述抗衰老活性蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)克隆人0ct4、Sox2、K1f4、NANOG、c-Myc、LIN28、TOR基因，得到靶标基因；或者克隆人TOR结构域基因，得到靶标基因结构域；

(2)在细菌、酵母或真核细胞中，建立高通量筛选平台；

(3)建立人胎盘cDNA文库；

(4)将所建立的人胎盘cDNA文库导入步骤(2)所构建的高通量筛选平台，采用蛋白折叠和相互作用的可视化方法，筛选引起靶标基因或靶标基因结构域的蛋白质折叠变化的人胎盘蛋白，得到人胎盘衰老活性蛋白。

6.一种抗衰老的药物组合物，含有有效量的权利要求1所述的抗衰老活性蛋白和药学上可接受的载体或辅料。

7.权利要求1所述的抗衰老活性蛋白在制备抗衰老或抗氧化药物中的用途。

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