CN102016580A

CN102016580A - 多元细胞信号转导测定

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Publication number: CN102016580A
Application number: CN2009801107874A
Authority: CN
Inventors: J·K·霍尔顿
Original assignee: GE Healthcare UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2009-01-15
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2029-01-15
Also published as: EP2255186B1; JP5574979B2; GB0800938D0; WO2009090215A1; JP2011510282A; US8673554B2; US20140199704A1; EP2255186A1; CN102016580B; US20100311069A1

Abstract

本发明公开了用于采用成像仪器进行化合物筛选的基于细胞的多元测定的方法。本文所述方法提供关于检测试剂的生物效价、脱靶效应和潜在候选药物的细胞毒性等的高容量的信息。

Description

多元细胞信号转导测定

发明领域

本发明涉及高容量的细胞筛选测定(high-content cellular screeningassay)，更具体地涉及用于筛选细胞刺激剂并在单细胞或单细胞群中采用报告分子的多元监测的测定。

发明背景

发现一种新的治疗剂的过程传统上包括以下阶段，在患者或者合适的模型系统中：i)鉴定药物靶标；ii)验证该靶标；iii)筛选影响靶标活性的化合物；iv)测定先导化合物的毒性；v)测定先导化合物的副作用；和vi)考查先导化合物的代谢及稳定性。一旦鉴定并验证潜在的治疗靶标，药物发现的初始阶段需要筛选通常是成数十万种化合物，来鉴定那些以适当治疗方式调节靶标的药物。这种筛选过程需要开发能够迅速廉价地测量调节目的靶标因子的化合物的效力的测定技术。这些高通量的筛选测定可采取各种形式，其包括通常依靠基于比色、荧光、放射性测量或发光的检测的基于细胞的测定或生化测定，以测量受体激活、RNA浓度、蛋白浓度、酶活性或蛋白质间形成功能复合体的物理相互作用。药物发现领域面临的始终的挑战是提高速度和效率，依赖这种速度和效率从化合物筛选库中所测定的数十万种化学化合物里鉴定出潜在的先导化合物，然后优化成新的药物。在先导化合物优化过程中遇到的一个普遍问题是，最初根据其调节一种或几种特定靶蛋白活性的能力鉴定出的候选药物，也常常有一种或多种禁忌症。化合物缺乏特异性从而导致药物除了既定的靶标外还靶向范围广泛的因子和生物过程，这能够产生有害作用。令人关注的其它领域包括药物毒性和代谢，这些引起毒性反应的化合物能破坏正常细胞和组织的功能，导致细胞死亡。某些化合物也已被证实调控其自身代谢，藉此刺激该靶物质分解并从机体排泄，导致药效降低。

目前高通量的筛选测定通常集中于测量化合物在调控单一因子或靶标的活性中的效用，并依赖于二次筛选及后续分析(follow-upanalyse)的延续过程，以便测定化合物功能的其它特性，例如特异性和毒性。这增加了将化合物开发并优化为具有高治疗指数(即高效率、高特异性、低毒性)的药物所需的时间及花费。结果，很多因为其对靶标的活性而原本被选定的化合物，最终因为后续发现的副作用被放弃，导致在先导药物评价上所做的努力浪费，这最终证明不能令人满意。

在药物发现和先导药物优化过程中，需要更快速、更高效、更廉价、特别是信息丰富的筛选测定，这样的测定同时提供关于各种化合物特性及其对各种细胞途径作用的信息(即功效、特异性、毒性和药物代谢)。

例如，先前采用过的一种方法阐述于US 2005/0164321(PromegaCorp)中，其阐述了用酶介导反应的方法，该方法用于在同一孔中的多元发光和不发光测定，以检测样品中一个或多个部分的量(例如活性)或存在情况，所述部分包括酶促反应的辅因子(例如ATP)、结合和/或改变分子构象的蛋白质(肽或多肽)(例如修饰或剪切肽或多肽底物的蛋白质)或被蛋白质结合和/或改变的分子。

WO 98/58074(Allelix Biopharma)阐述了用于筛选化学化合物以鉴定受体(包括G-蛋白质偶联受体)的配体的测定方法和组合物。该发明采用的细胞为其中目标受体通过第二信使系统被偶联到受环核苷酸门控(gate)的离子通道的细胞。受体刺激导致第二信使系统产生环核苷酸，这导致可测量的离子通过通道流入。该发明还提供了这样的多元系统，其中用不同的离子内流(ion influx)荧光报告分子装载表达不同受体类型的混合细胞培养物。

EP1439384(Cellomics Inc)提供用于测定细胞中荧光标记报告分子的分布、环境或活性的方法和分析系统，所述方法和分析系统的目的是筛选大量的特异性影响特定生物功能的化合物。

Bertelsen，M.，(Methods in Enzymology，(2006)，414，348-363)阐述了使用高容量的成像系统进行炎症信号转导和细胞内蛋白质易位的多元分析。

Howell，B.J.等(Methods in Enzymology，(2006)，414，284-300，2006)阐述了基于细胞的多元成像测定的开发和实施，所述测定采用荧光显微镜监测细胞增殖、细胞周期阶段和细胞凋亡。

Nickischer，D.等(Methods in Enzymology，(2006)，414，389-418)阐述了三种促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)细胞内信号转导途径成像测定的开发和实施，以便为激酶抑制剂提供MAPK模块选择性概况分析(profiling)：MK2-EGFP易位、c-JUN和ERK活化。

Hanson，B.等(J.Biomolecular Screening，(2006)，11，644-651)阐述了多元细胞内测定，其通过联合fluo-4钙迁移测定和β内酰胺酶报告系统，使得可以用单细胞系进行两个G-蛋白偶联受体测定药物筛选。

Jonas，J-C.等(Diabetes，(1998)，47，1266-1273)阐述了细胞内Ca²⁺浓度和细胞外胰岛素从用葡萄糖刺激的分离的胰岛细胞的细胞灌流液中分泌之间的时间和数量关系，所述胰岛素。在含有葡萄糖的培养基中用钙指示剂fura-PE3装载培养的胰岛，并将单个胰岛转移到灌注室中。用荧光显微镜测量[Ca²⁺]，而用RIA测定灌流液下游收集的组分中的胰岛素。因此，本文阐述了[Ca²⁺]与大群混合(即异质)的细胞群的胰岛素分泌之间的关系，因此在单细胞水平上，细胞刺激与相关的分析物的产生之间没有特定的相关性。此外，Jonas等没有阐述细胞相关的分子/分析物的多元测定或测量。

Marriott等(J.Cellular Physiology，1998，177，2，232-240)阐述了鼠腹腔巨噬细胞内白细胞介素6mRNA表达的诱导和细胞内钙的测量。mRNA和细胞内钙的测量都是细胞内事件，因为mRNA不被细胞分泌。

Veronesi等(Neurotoxicology，2003，24，463-473)阐述了支气管-气管上皮细胞的胞内钙和胞外IL-6测量。在该论文中，IL-6与细胞无关，用ELISA进行下游测量。

McMillen等(Clinical Care Medicine，1995，23，(1)34-40)阐述了用下游放射免疫分析法进行人单核细胞的胞内钙的测量和胞外IL-6的测量，这种方法的实施不需细胞洗涤步骤。

Drucker等(Blood，2002，100，(11)，摘要编号5025)报道了用下游ELISA进行多发性骨髓瘤细胞系的胞内钙和胞外IL-6的测量，其不需细胞洗涤步骤。

Kohno等(Diabetes，2003，52，(4)948-956)披露了在同一细胞群中细胞内钙的测量和神经肽Y(NPY)的免疫化学染色。在用4％低聚甲醛对死细胞进行细胞固定后检测NPY。

Lundgren等(World Journal of Surgery，1996，20，(7)727-735)阐述了通过下游放射免疫分析法测量人甲状旁腺细胞的胞内钙和胞外PTH，其不需细胞洗涤步骤。

以上方法都没有给出来自刺激活细胞的即时及多元的高容量信息，其中在来自单一同质细胞群的细胞中测量胞内及与细胞相关的信号转导因子。因此，以上方法不能使特定细胞内事件和细胞相关分析物的下游产生相关联。本发明解决了这些限制，并提供了优于已知方法的很多优点。

发明概述

本发明提供用于采用成像仪器进行化合物筛选的基于细胞的多元测定方法，所述测定提供高容量的信息，这些信息涉及检测试剂的生物效能、脱靶效应(off-target effect)和潜在候选药物的细胞毒性。因此，本发明的第一方面提供用于在单个活细胞群中测量至少一种细胞内事件和细胞相关分析物的方法，其中所述至少一种细胞内事件和细胞相关分析物是在细胞中运行的协同生化过程的各个组分，所述方法包括以下步骤：

a)提供含有单个活细胞群的样品；

b)让单个细胞群中的至少一个活细胞与引起或怀疑引起至少一个细胞产生细胞相关分析物的检测试剂接触；

c)测量在至少一个细胞中的物理性质的变化，作为至少一种细胞内事件的度量(measure)；

d)洗涤细胞以去除细胞外液体；

e)测量细胞相关分析物的存在、含量或活性；和

f)将至少一个细胞中的至少一种细胞内事件的变化与细胞相关分析物的存在、含量或活性相联系。

因此，本发明提供综合性的高容量、高通量的基于细胞的测定方法，所述方法能够产生关于外源性药物对细胞作用的生物活性数据。活细胞通过在时间和空间上调控的复杂的生物化学途径网络不断响应其环境中的重要信号，以给细胞提供对协调响应必不可少的综合信息交换。激素、生长因子和神经递质都属于已被广泛研究的信号转导物质。另外，本发明提供用于测量同一细胞中发生的多个事件的信息丰富的方法，所述方法能协助生物化学途径分析。这进而有助于阐明与临床病况相关的各种途径，所述临床病况如癌症、动脉粥样硬化、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化症、哮喘和慢性阻塞性肺疾病。在本文所述方法中采用的样品将合适地含有单细胞群。按照所述方法，细胞与检测试剂接触，以刺激细胞引发下游生化过程(或事件)级联。所述过程可导致细胞内的激素、第二信使、气体、酶、转录因子、反应元件和/或基因表达产物水平改变。此外，还可能将观察到的细胞刺激后的细胞内事件的变化与因响应所述细胞刺激而可能产生的细胞相关分析物的形成相关联，所述变化的特征在于一种或多种相应的细胞内效应分子的水平或数量变化。

在一个实施方案中，可将在检测试剂存在下测量的细胞内事件的变化和细胞相关分析物的存在、含量或活性的变化，与在缺少检测试剂时的至少一种细胞内事件和所述细胞相关分析物的存在、含量或活性每一种的对照值比较。对照值可方便地以电子形式存储在数据库中或其它电子格式中。

检测试剂可为化学实体，例如药物、食用色素、激素、毒素、烷基化剂、氧化剂或致癌物。或者，检测试剂为物理因子，例如电磁辐射(例如UV、X-射线、微波)、β^-辐射或热。

技术人员应理解，去除细胞外液体的洗涤步骤d)可在步骤b)之后但在步骤c)之前实施。

本文所述术语“多元测定”或“多元方法”涉及测量或传达来自同一来源的两种或多种信使的信息或信号的方法(多元测定的实例由Ugozzoli等阐述(Analytical Biochemistry，2002，307，47-53))。

本文所用术语“高容量筛选”是药物发现方法，其用活细胞作为分子发现的试管。它阐述了利用空间或时间解决的方法，以便从单独实验中比从仅含一个单独输出的一个单一实验中发现更多。其运用细胞生物学与分子工具的组合，通常用自动高分辨率显微镜和自动化处理(Giuliano等，J Biomol Screen.，1997，2，249-259)。本文所述方法阐述用活细胞的测定方法的用途。

本文所述术语″细胞内事件″意欲指与细胞信号传导和信号转导相关的基本的细胞过程，包括例如受体激活、钙释放、第二信使产生、氧化氮释放、磷酸化、酶激活、转录因子和响应元件激活及基因表达。因此，在本发明的情况中，将检测物理性质的变化作为细胞内事件的度量，意欲指检测细胞内效应分子的存在与否或测量其水平或含量的变化，或测量细胞内酶、第二信使、氧化氮、转录因子、响应元件或一种或几种基因表达产物活性的变化。优选细胞内事件为离子浓度(例如细胞内钙)增加和/或基因表达增加。

本文所述术语″细胞过程″意欲包括活细胞经历的正常过程并包括：生物合成、吸收、运输、调控、受体结合和内化、代谢、细胞生理、生化应答、细胞呼吸作用、生长和细胞死亡。另外的细胞过程可包括细胞粘附(其中细胞经由细胞粘附分子附着到另一个细胞或底层基底或基质)、细胞信号转导、形态发生、复制和响应刺激物。

本文所述术语″细胞相关分析物(cell-associated analyte)″意欲指在刺激细胞后通常由协同的生化过程或途径产生的细胞组分，这种组分随后可由细胞分泌，但在测量细胞相关分析物的存在、含量或活性时其与细胞在物理上相连(physically associated)。本发明阐述了经过设计以测量存在于细胞内和细胞外液体中的两种或多种不同分析物的联合测定或多元测定。例如，细胞内分子可存在于细胞质和细胞核中，而细胞相关分析物可存在于沐浴细胞直接表面的液体中。在优选实施方案中，将测定设计为测量与细胞紧密相连的细胞相关分析物，例如与细胞膜结合或存在于细胞直接环境中的细胞相关分析物，因为这样可以提供对分泌因子或分析物的表达水平及产生水平的时间特性的准确测量。

本发明方法适用于几乎任何类型的细胞。在一个实施方案中，细胞群为正常(即未经修饰的)细胞，其在来源方面可来自任何公认来源，包括哺乳动物细胞、细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。在优选实施方案中，采用真核细胞类型，例如哺乳动物细胞。实例包括CHO、3T3、Cos-7、HEK-293、Jurkat、HeLa、Sf-9、HUVEC、HMEC、HL-60、U2OS、J774、BHK、ECV304和THP-1细胞。备选细胞包括酵母细胞和昆虫细胞。

在另一实施方案中，通过用重组表达载体转染来修饰细胞，所述表达载体包含第一报告基因构建体，所述构建体包含编码第一可检测报告分子的核酸序列，所述核酸序列与表达控制元件可操作地连接并在其控制之下。在该实施方案中，第一方面的接触步骤b)合适地在允许报告基因构建体表达的条件下进行。

本文所述术语″可操作地连接″表明对包含报告基因构建体的元件的安置使其功能与其预期目的一致，即对报告基因构建体的安置使转录在启动子中启动并经过编码报告分子的DNA序列来进行。

在再一实施方案中，报告基因构建体可另外编码目的蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、硝基还原酶报告分子(NTR)或催化荧光素产生光的荧光素酶基因。另一种细菌中常用的报告分子是lacZ基因，其编码β-半乳糖苷酶蛋白，从而导致细胞表达该基因，以便当细胞生长在含有底物类似物X-gal的培养基时出现蓝色。

如本文所述，报告基因(或报告分子)是在培养中的细胞中连接到另一目的基因(表达例如荧光素酶)上的基因。选择某些基因作为报告分子，是因为它们赋予表达它们的生物体的特性易于被鉴定并检测，或者因为这些基因为细胞内事件或分子的选择标记，并因此可被用于诸如绿色荧光蛋白(GFP)易位测定等技术。用报告基因来确定目的基因是否被细胞吸收或被表达，或在细胞或细胞群中基因表达是否被激活或改变。为了将报告基因导入生物体中，将报告基因和目的基因安置在同一核酸构建体中，将该构建体插入或转染到细胞或细胞群中。例如，对培养的细菌或真核细胞而言，众所周知这种构建体通常是环状(质粒)DNA形式。

在一个实施方案中，通过用第一报告基因构建体转染来修饰的细胞包含编码荧光蛋白的核酸序列，所述荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)或来源于维多利亚水母(Aequorea Victoria)的GFP功能类似物。用于所述方法中的优选荧光蛋白包括EGFP(Cormack，B.P.等，Gene，(1996)，173，33-38)；EYFP和ECFP(US 6066476，Tsien，R.等)；F64L-GFP(US 6172188，Thastrup，O.等)；BFP，(US 6077707，Tsien，R.等)。其它荧光蛋白包括NFP(Clontech)和Renilla GFP(Stratagene)。

在另一实施方案中，修饰的细胞包含第一报告基因构建体，所述报告基因构建体包含编码酶的核酸序列，例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和硝基还原酶。在特别优选的实施方案中，报告基因构建体编码硝基还原酶。合适的酶报告分子是能够在该酶的底物中产生可检测信号(例如荧光信号或发光信号)的报告分子。特别适合的酶/底物包括：荧光素酶/荧光素；β-半乳糖苷酶/DDAO半乳糖；β-半乳糖苷酶/荧光素二-β-D-半乳糖苷；碱性磷酸酶/Attophos；硝基还原酶/CytoCy5S^TM(如WO 2005/118839中所述)。

用多种酶基因作为报告基因的方法众所周知(见综述Naylor L.H.，Biochemical Pharmacology，(1999)，58，749-757)。选择报告基因以使在其它细胞蛋白存在下可测量该基因的产物，并在所选择的调控序列控制下将该报告基因转入细胞，所述调控序列响应宿主细胞中基因表达的变化。典型的调控序列包括响应激素的那些调控序列和其它细胞控制因子和信号转导因子。例如，已知结合七种跨膜受体的激动剂能调控包括cAMP响应元件、NFAT、SRE和AP1在内的启动子元件；MAP激酶激活导致SRE调节，从而导致Fos和Jun转录；DNA损伤导致DNA修复酶和肿瘤抑制基因p53转录激活。可通过选择适当的调控序列，用报告基因来测定加入的试剂对涉及所选择的研究中的调控序列的细胞过程的作用。

用作报告分子的硝基还原酶基因可用众所周知的方法分离，例如用聚合酶链式反应(PCR)从cDNA文库中扩增(Molecular Cloning，ALaboratory Manual(分子克隆，实验手册)，第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第14.5-14.20页)。一旦被分离，可将硝基还原酶基因插入到适用于哺乳动物启动子的载体中(Molecular Cloning，ALaboratory Manual(分子克隆，实验手册)第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第16.56-16.57页)，所述启动子与研究中的基因调控序列相连并受其控制。然后可将含有硝基还原酶报告分子和相关调控序列的载体，通过用众所周知的技术转染引入到宿主细胞中，所述转染技术例如用DEAE-葡聚糖或磷酸钙(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press1989，第16.30-16.46页)。其它合适的技术为本领域技术人员所熟知。业已证明以这种方式表达时硝基还原酶被保留在细胞中(见Bridgewater等，Eur.J.Cancer 31a，2362-70)。

可通过本领域技术人员熟知方法通过限制酶切消化、连接、转化和质粒纯化的标准重组分子生物学技术制备DNA构建体，所述方法在Sambrook，J.等(1989)，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中阐述。或者，可通过已建立的方法来合成制备构建体，所述方法例如Beaucage和Caruthers(Tetrahedron Letters，(1981)，22，1859-1869)阐述的亚磷酰胺(phosphoramidite)方法或Matthes等(EMBO J.，(1984)，3，801-805)阐述的方法。根据亚磷酰胺方法，例如在自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆到合适的载体中。还可通过聚合酶链式反应(PCR)用特异引物制备DNA构建体，例如其如US4683202中或由Saiki等(Science，(1988)，239，487-491)所述。在PCR方案(1990)，Academic Press，San Diego，California，U.S.A.中可找到PCR方法的综述。

在制备DNA构建体的过程中，必须让编码报告分子的基因序列与细胞周期阶段特异性破坏控制元件在读框架内连接，并任选空间定位控制元件。然后将得到的DNA构建体置于合适的细胞周期阶段特异性表达控制元件的控制之下。

可通过采用对所述分子特异的荧光探针，通过检测及定量测量由细胞发射的荧光来合适地完成细胞内事件(例如在细胞刺激后激素、第二信使或钙的水平变化)的测量。可用已知的方法完成细胞内激素、第二信使、转录因子等的测量。可测量的细胞内事件和相关的效应分子的实例包括：

i)细胞钙流或钙瞬变测定

所述测定采用细胞渗透荧光指示染料分子，例如Fluo-2和Fluo-4，以使探针与钙离子结合引起的荧光发射增加。参见例如″CellularCalcium，A Practical Approach″，由McCormack和Cobbold(1991)编辑，IRL Press。

ii)GFP标记的易位测定

这些测定需要表达GFP的核酸构建体，致使可鉴定出在细胞质与细胞膜、早期内体或细胞核之间发生蛋白质易位。参见例如Hancock等，生物分子筛选学会(The Society for Biomolecular Screening)，第九届年度会议和展览(9^th Annual Conference and Exhibition)，DrugDiscovery at the Cutting Edge(2003)，Portland，Oregon)，其阐述了用于监测和定量多种信号转导事件(包括AKT-1激活)的活细胞内GFP标记的蛋白易位测定。

iii)报告基因测定

可将报告基因测定用于检测目的基因的表达，所述基因的表达产生对培养的细胞几乎没有明显的或立刻的作用的细胞蛋白质。本文将报告分子直接标记目的基因以形成基因融合。这两个基因受同一启动子的控制，并被转录成单个信使RNA分子，进而被翻译成蛋白质例如酶报告分子。重要的是这些例子中两种蛋白质都能正确折叠成有活性的构象，其尽管融合但仍与它们的酶底物相互作用。在DNA构建体的形成中，通常包括编码柔性多肽接头区的DNA区段，致使报告分子与基因产物之间的干扰减至最小。所述方法实例众所周知，参见例如Bronstein等，Chemiluminescent and Bioluminescent Reporter GeneAssays(化学发光和生物发光报告基因测定)，Analytical Biochemistry，(1994)，219，169-181。

iv)细胞裂解测定

本文在细胞裂解液中测定细胞内组分，所述细胞裂解液经常加有使细胞膜离解的去污剂。所述细胞裂解步骤和测定的实例可在US6900019(Horton)中找到。

测量细胞相关分析物的存在、含量或活性的测定众所周知，其包括免疫细胞化学、蛋白质结合测定和酶测定。测定的组分通常可包括：

a)含有或疑似含有将被测定的分析物的细胞样品；

b)分析物的未标记的特异性结合配偶体(binding partner)，其被或能够被固定在固相支持体上；

c)分析物的特异性结合配偶体或类似物，其被标记或者不被标记，并能够被标记。

在一个实施方案中，所述测定为酶测定。在这种形式中，微孔板的孔中含有组分a)、b)和c)，组分c)为待测定化合物的酶标记的特异性结合配偶体。通过将适用于检测酶标记的检检测试剂加入到孔中来启动所述测定的测量。参见例如Berg，J.，Tymoczko J和Stryer L，Biochemistry，W.H.Freeman and Company，(2002)。

在另一实施方案中，被标记的特异性结合配偶体可包括荧光标记。适用于通过免疫细胞化学测定法测量分析物的合适的荧光标记物众所周知，其包括例如荧光素、罗丹明和花菁染料。

在另一实施方案中，采用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定来测量细胞相关分析物。参见Czerkinsky，C.，等，J.Immunol.Methods，(1983)，65(1-2)，109-21)。在该实施方案中，可用半透明(PVDF)膜测定细胞相关分析物，所述膜起抗体或其它结合试剂的固相支持体的作用，用酶标记的探针和荧光底物检测细胞相关分析物。

在又一实施方案中，可用活细胞ELISA技术进行细胞相关分析物的测量，其中可能含有待测量的分析物的细胞样品包含在容器中，并用合适的探针和发光体或荧光底物检测细胞相关分析物。参见例如Grunow，R.等，J.Immunological Methods，(1994)，171，93-102。

细胞相关分析物的性质不是本发明关键，除非所述分析物的存在、活性或数量可与细胞内事件(其通过细胞内组分或报告基因激活或GFP易位的改变来测定)相关联。特异性结合配偶体所适用的任何细胞相关分析物原则上可用于本发明中。适用于本发明的典型特异性结合配偶体组合可选自：半抗原-抗体、配体-受体、DNA-DNA、RNA-RNA、DNA-RNA、生物素-链霉亲和素、蛋白质-抗体、肽-抗体和多肽-抗体相互作用。优选特异性结合测定为蛋白质结合测定，或更具体为免疫细胞化学测定。典型的分析物包括蛋白质、肽、神经递质、神经营养因子、维生素、肽激素、酶、生长因子、类固醇激素、前列腺素、整联蛋白、基质组分、粘附素、分化分子簇、细胞因子、趋化因子、淋巴因子和白三烯等。

对某些细胞内组分的测量指示细胞内事件的变化，所述组分包括第二信使、ADP、ATP、AMP、环ADP-核糖、细胞钙、cGMP、cAMP、IP₃、IP₁、IP₄、丝氨酸-苏氨酸激酶、PI3-激酶、甘油二酯、AKT-1、核糖体蛋白S6激酶、SMAD-9、磷脂酶C、磷脂酶Cδ-1、β淀粉样蛋白前体、ras同源基因家族、成员A.PARAPARA(ARHA)、与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶2、热休克蛋白70-kD 1A、(HSPA1A)、鞘氨醇激酶-1(SPHK1)、SPHK2、Forkhead Box O1A(FOXO-1A)、糖皮质激素受体(GCCR)、半胱氨酸蛋白酶、AKT1和转录因子。可例如用以下方法分别测量这些细胞内分析物：GFP易位标记物、报告分子-基因测定法、荧光或发光探针、酶介导的测定、蛋白结合技术、电生理法、光谱法、核磁共振技术、流式细胞术、离子运输、显微镜法和放射测定。

可用光学成像方法进行荧光强度变化的检测和测量，其采用结合电荷耦联装置(CCD)成像器(例如扫描成像器或区域成像器)的仪器。例如，LEADseeker^TM多模态成像统(Multimodality Imaging System)(GEHealthcare)特征在于CCD相机，其使得可以单向(single pass)对高密度微孔板进行定量荧光成像。或者，可用IN Cell 1000分析仪光学成像系统(Analyzer Optical Imaging System)(GE Healthcare)以″活细胞″形式对细胞成像。在这种方式中，应该将合适的细胞标记物引入到细胞中，所述细胞标记物例如细胞质、细胞核或细胞膜荧光标记物，其具有与目的化合物的荧光发射波长不同且可区别的荧光发射波长。

根据本发明，可联合各种方法，使得能在用检测试剂处理的单细胞或单一同质细胞群中并行监测细胞内和细胞外的细胞相关事件。因此，本发明提供了一种有利的方法，其用于直接测定推定药物或试剂对单细胞或单细胞群的作用效果，由此减少开发和优化高疗效的化合物所需的时间和花费。

发明简述

为清晰起见，本发明某些实施方案将通过参考以下附图举例阐述，其中：

图1显示来自实施例1的联合测定结果。通过结合钙敏感的细胞渗透性染料Fluo-4，来检测钙离子载体A23187刺激的来源于单个群体的U2OS细胞引起的细胞质中胞内钙的增加。用IN Cell 1000分析仪光学成像系统测量荧光发射(λ_发射＝535nm)，用10x物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置及200毫秒曝光来成像。

图2为免疫细胞化学分析图像，其显示根据实施例4来源于单个群体的A23187刺激的U2OS细胞的细胞相关分泌性人IL-6。在IN Cell1000分析仪上测量荧光。

图3显示来自U2OS细胞的钙离子载体刺激的IL-6的产生，这表明根据实施例3细胞相关的IL-6从培养中的A23187刺激的单U2OS细胞群分泌。让细胞与检测试剂(钙离子载体A23187)接触4小时，在用检测试剂刺激细胞后测量细胞相关IL-6。刺激后滗出细胞上清液，在与抗IL-6抗体孵育前，用PBS彻底洗涤细胞3次。在添加化学发光底物前，用PBS彻底洗涤细胞3次。在获得IL-6结果之前用相同的细胞群获得钙瞬变结果。与图1所示结果联合获得数据。用LEADseeker多模态成像系统曝光20秒获得结果(图3)，其使用化学发光底物和发光信号报告分子(用辣根过氧化物酶标记的抗IL-6)。

图4显示实施例2的联合测定的结果。通过结合钙敏感的细胞渗透性染料Fluo-4，来检测用组氨酸刺激的来源于单个群体的U2OS细胞引起的细胞质中胞内钙的增加。用IN Cell 1000分析仪测量荧光发射(λ_发射＝535nm)，用10x物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置及200毫秒曝光来成像。

图5显示根据实施例3来源于单个群体的人U2OS细胞产生组氨酸刺激的IL-6。让细胞与组氨酸检测试剂过夜接触，在刺激细胞后测量细胞相关IL-6。用LEADseeker多模态成像系统曝光20秒获得结果，其使用化学发光底物和发光信号报告分子(用辣根过氧化物酶标记的抗IL-6)。

图6显示已知量的重组IL-6的标定曲线，其用已知量的重组IL-6(0.48-1500pg/ml)用实施例3的化学发光测定(R&D Systems，目录代码Q6000B)来制作。在LEADseeker多模态成像系统中测量结果。

图7显示来自钙离子载体A23187刺激的培养中生长的人U2OS细胞的钙瞬变，其联合实施例4的IL-6测量数据获得。在IN Cell 1000分析仪上实施图像分析，用10x物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置及200毫秒曝光来成像。荧光测量显示与无刺激的对照(0离子载体)相比，细胞内钙增加。

图8显示来自A23187刺激的U2OS细胞的细胞内钙和细胞相关IL-6之间的关系，细胞内钙和细胞相关分子二者都显示随着离子载体A23187浓度的增加而剂量依赖性增加。细胞来源于单个群体。用INCell 1000分析仪按照实施例4获得结果。

图9显示来自A23187刺激的来源于单个群体的U2OS细胞的细胞内钙和细胞相关IL-6之间的关系。数据显示当细胞仅与检测试剂接触时细胞内钙和细胞相关IL-6增加。无刺激(对照)的细胞显示在细胞内钙和细胞相关IL-6之间没有相关性。用IN Cell 1000分析仪按照实施例4获得结果。

图10显示来自A23187刺激的来源于单个群体的人U2OS细胞的细胞内钙和细胞相关IL-6之间的良好的相关性(相关系数＞0.99)。用IN Cell 1000分析仪按照实施例4获得结果。

图11显示来自EGFP易位和PDGF测量(细胞相关分子)的联合测定的EGFP-NFAT1c易位。

图12显示从EGFP-NFAT1c转染的U2OS细胞释放的洛诺霉素(ionomycin)刺激的PDGF，其与EGFP-NFAT1c易位联合。

图13显示细胞内NFAT1c易位和细胞相关PDGF之间的相关性，所述细胞相关PDGF来自洛诺霉素刺激的EGFP-NFAT1c转染的来源于单个群体的U2OS细胞。

图14显示在用洛诺霉素+PMA刺激转染的细胞时的EGFP-NFAT1c易位，其用成像系统测量。

图15显示与EGFP-NFAT1c易位联合获得的从EGFP-NFAT1c转染的U2OS细胞中释放洛诺霉素+PMA刺激的TNFα。

图16显示细胞内NFAT1c易位和细胞相关人TNFα的相关性，所述细胞相关人TNFα来自洛诺霉素+PMA刺激的EGFP-NFAT1c转染的U2OS细胞。

发明详述

实施例

1.在离子载体A23187刺激的U2OS细胞中测量钙瞬变

1.1材料

钙流缓冲液(calcium flux buffer)(5mM KCl，含有1mM MgSO4、100mM HEPES、10mM D-葡萄糖、145mM NaCl和1mM CaCl2，pH7.4)。

Fluo-4(InVitrogen)

Hoescht 33342(InVitrogen)

7.5％白蛋白(Sigma)

钙离子载体A23187(Sigma)

U2OS细胞(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of CellCultures)，Porton Down，UK)

1.2方法和结果

i)以6000个细胞/孔将U2OS细胞接种到96孔Greiner聚簇板(cluster plate)，于100μl完全McKoys培养基中，并在37℃、5％CO₂中孵育过夜。

ii)用42.8ml钙流缓冲液与6.65ml的7.5％白蛋白制备加样缓冲液。将该缓冲液保存在37℃。

iii)用118.16ml钙流缓冲液和1840ul的7.5％白蛋白制备120ml维持缓冲液。

iv)将5mg钙离子载体A23187溶解在1ml的DMSO中。随后用完全维持缓冲液稀释离子载体，以获得在1.56-100μM范围内的离子载体终浓度。通过将456μl的DMSO加到50μg小瓶中来制备Fluo-4染料，充分混合小瓶以提供100μM浓度的Fluo-4储液。将100μl的100μM Fluo-4染料和6μl的16mM Hoescht细胞核染料加到9.894ml加样缓冲液中。从细胞培养板中去除培养基，加入100μl/孔的经温热的完全加样缓冲液。让板在37℃、5％CO₂中孵育40分钟。孵育后去除加样缓冲液，加入150μl/孔的维持缓冲液。将板转移到IN Cell 1000分析仪(Kinetic Module)上，使用10x物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置(Fluo-4)、200毫秒曝光、360/460滤光器装置(Hoescht)、300毫秒曝光。在以下时间后每五秒获取一次图像：0秒、5-60秒。20秒后分配(dispense)离子载体，继续采集图像。用目标强度算法(object intensity algorithm)(INCell Investigator软件)分析结果。

v)图1显示来自用钙离子载体A23187(1.56-100μM)刺激在培养中生长的U2OS细胞后细胞内钙浓度的联合测定的结果。图3显示细胞相关IL-6的增加。数据显示用钙离子载体刺激时细胞响应为细胞质胞内钙增加，其如由细胞渗透性染料Fluo-4(λ_发射＝535nm)发射的荧光的增加所显示。图1显示细胞内钙经八分钟增加，表明细胞内钙水平峰值和下降的时间变化。细胞内事件的变化也取决于测定中采用的钙离子载体的剂量。

2.组氨酸刺激的U2OS细胞中钙瞬变的测量

2.1材料

钙流缓冲液(5mM KCl，含有1mM MgSO₄、100mM HEPES、10mMD-葡萄糖、145mM NaCl和1mM CaCl₂，pH 7.4)。

Fluo-4钙荧光(calcium fluor)(InVitrogen)

Hoesch 33342 DNA染色液(InVitrogen)

7.5％白蛋白(Sigma)

组氨酸(Sigma)

U2OS细胞(欧洲细胞培养物保藏中心，Porton Down，UK)

2.2方法和结果

i)以6000个细胞/孔将U2OS细胞接种到96孔Greiner聚簇板，于100μl完全McKoys培养基中，并在37℃、5％CO₂中孵育过夜。

iii)用118.16ml钙流缓冲液和1840μl的7.5％白蛋白制备120ml维持缓冲液。

iv)称取25.3mg组氨酸，并将其溶解在1ml经温热的维持缓冲液中。随后用完全维持缓冲液稀释组氨酸，以获得在1.56-100μM范围内的组氨酸终浓度。通过将456μl的DMSO加到50μg小瓶中来制备Fluo-4染料，充分混合小瓶以提供100μM浓度的Fluo-4储液。将100μl的100μM Fluo-4染料和6μl的16mM Hoescht细胞核染料加到9.894ml加样缓冲液中。从细胞培养板中去除培养基，加入100μl/孔的经温热的完全加样缓冲液。让板在37℃、5％CO₂中孵育40分钟。孵育后去除加样缓冲液，加入150μl/孔的维持缓冲液。将板转移到IN Cell 1000分析仪(Kinetic Module)上，使用10x物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置(Fluo-4)200毫秒曝光、360/460滤光器装置(Hoescht)，300毫秒曝光。在以下时间后每五秒获取一次图像：0秒、5-60秒。20秒后分配组氨酸，继续采集图像。用目标强度算法(IN Cell Investigator软件)分析结果。

v)图4显示来自用组氨酸(1.56-100μM)刺激在培养中生长的U2OS细胞后细胞内钙浓度联合测定的结果。图5显示细胞相关IL-6的增加。数据显示用组氨酸检测试剂刺激时细胞群响应为细胞质胞内钙增加，其如由细胞渗透性染料Fluo-4(λ_发射＝535nm)发射的荧光的增加所显示。图4显示细胞内钙经八分钟升高，亦表明细胞内钙水平峰值和下降的时间变化。细胞内事件的变化也取决于测定中采用的组氨酸检测试剂的剂量。

3.在测量钙瞬变后对来自组氨酸或钙离子载体A23187刺激的 U2OS细胞的人白细胞介素-6的联合测定

3.1材料

抗人IL-6抗体(R&D SYSTEM，SQ6000B)

发光底物(R&D SYSTEM，SQ6000B)

钙离子载体A23187(Sigma)

组氨酸(Sigma)

U2OS细胞(欧洲细胞培养物保藏中心，Porton Down，UK)

3.2方法和结果

ii)用A23187或组氨酸刺激细胞(参见以上实施例1和2)，并测量钙瞬变(见图1和4)。用离子载体或组氨酸刺激后，滗出细胞上清液，用PBS彻底洗涤细胞3次，然后与抗IL-6抗体孵育。在加入化学发光底物之前，用PBS洗涤细胞3次。在获得IL-6结果之前用同一单细胞群获得钙瞬变的结果。

iii)联合图1和4所示的结果获得IL-6数据。在LEADseeker多模态成像系统中用化学发光底物和发光信号报告分子(用辣根过氧化物酶标记的抗IL-6)曝光20秒获得结果(表1和图3为离子载体刺激；图5为组氨酸刺激)。

iv)用已知量的重组IL-6作为标准的标定曲线结果如表2和图6所示，其使得可准确测量细胞相关的IL-6。结果(表2和图6)显示随着IL-6浓度增加化学发光信号增加。从LEADseeker多模态成像系统中获得这些数据。

表1来自培奍中经刺激的U2OS的白细胞介素-6样品测量结果

表2来自成像系统的白细胞介素-6标定曲线

4.来自钙离子载体A23187刺激的U2OS细胞的细胞内钙和人白细胞介素-6在IN Cell 1000中的联合测定

4.1材料

抗IL-6(R&D SYSTEMS)

连接Cy-5的山羊抗人IgG(GE Healthcare)

钙离子载体A23187(Sigma)

U2OS细胞(欧洲细胞培养物保藏中心，Porton Down，UK)

4.2方法和结果

i)以6000个细胞/孔将U2OS细胞接种到96孔组织培养板，于100μl完全McKoys培养基中，并在37℃、5％CO₂中孵育过夜。

ii)用A23187刺激细胞8分钟，然后如实施例1所述在IN Cell 1000分析仪上测量钙瞬变。图7显示与IL-6测量数据(该数据示于图2)联合获得的用钙离子载体A23187刺激的在培养中生长的人U2OS细胞产生的钙瞬变。在IN Cell 1000分析仪上测量该测定结果，用10x物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置200毫秒曝光。荧光测量显示与无刺激(0离子载体)的对照比较，细胞内钙增加(1.56μM离子载体)。

iii)图2显示来自联合测定(与细胞内钙，见图1)的免疫细胞化学分析，其显示来自培养中的A23187刺激的U2OS细胞群的细胞相关IL-6(细胞相关分析物)。细胞与检测试剂(钙离子载体A23187)接触4小时，在用检测试剂刺激细胞后测量细胞相关IL-6。用离子载体刺激后滗出上清液，用PBS彻底洗涤细胞3次。用抗人IL-6抗体(抗IL-6单克隆抗体)及荧光染料标记的抗人IgG(抗人gG，连接Cy-5(GEHealthcare))定位细胞相关IL-6。与单克隆抗IL-6抗体孵育60分钟后，将细胞洗涤3次，加入染料标记的抗人IgG。与荧光-标记的第二抗体孵育60分钟后，用PBS洗涤细胞3次，在IN Cell 1000分析仪上进行荧光检测，用10x物镜、51008bs二色性620/700滤光器装置(Cy-5滤光器装置)、500毫秒曝光。用目标强度算法(INCell Investigator软件)分析结果。结果(图2)清晰地显示细胞相关IL-6。

iv)图8显示来自A23187刺激的U2OS细胞的细胞内钙和细胞相关IL-6之间的关系，细胞内钙和细胞相关分子二者都显示随着离子载体A23187浓度的增加而剂量依赖性增加。细胞来源于单群体。如上所述在IN Cell 1000分析仪光成像系统中获得结果。用目标强度算法(IN Cell Investigator软件)分析结果。

v)图9显示来自A23187刺激的自单个群体获得的U2OS细胞的细胞内钙和细胞相关IL-6之间的关系。数据显示当细胞仅与检测试剂接触时细胞内钙和细胞相关IL-6两相增加。无刺激(对照)的细胞显示在细胞内钙与细胞相关IL-6之间没有相关性。如上所述用IN Cell 1000分析仪光成像系统获得结果。用目标强度算法(INCell Investigator软件)分析结果。

vi)图10显示来自A23187刺激的自单个群体获得的人U2OS细胞的细胞内钙与细胞相关IL-6之间的相关性(相关系数＞0.99)。如上所述用IN Cell 1000分析仪光成像系统获得结果。用目标强度算法(INCell Investigator软件)分析结果。

5.用遗传工程改造的细胞进行EGFP NFAT测定

5.1NFAT蛋白

活化的T细胞核因子(NFAT)蛋白是转录因子，其活化受Ca²⁺/钙调蛋白依赖的磷酸酶即钙依赖磷酸酶的控制。在很多过程中涉及NFAT信号转导，所述过程包括淋巴细胞发育和激活、骨骼肌基因表达、心血管系统的重建、发育及功能。目前为止，已鉴定出五个不同NFAT基因：NFATc(NFATc1或NFAT2)、NFATp(NFATc2或NFAT1)、NFAT4(NFATc3或NFATx)、NFAT3(NFATc4)和NFAT5。

通过抗原在T细胞中的信号转导激活NFATc1亚基，这导致细胞因子表达，但也已显示涉及哺乳动物心脏的形态发生。

在大多数细胞类型中尚未充分表征导致NFAT活化的上游受体-配体互相作用。然而，各种GPCR可激活蛋白(NFATc1-c4)的NFATc(细胞质)家族成员，所述各种GPCR激活PLC并诱导IP₃-介导的钙从细胞内储池(intracellular store)瞬间释放。在大多数细胞类型中，通过特化的钙释放激活的钙(CRAC)通道的另外的钙内流，为激活NFATc靶基因所需。IP₃还可覆盖GAP连接点(junction)，并在邻近细胞中激活CRAC通道和NFATc靶基因。

导致NFAT激活的第二途径存在于诸如肥大细胞等一些细胞类型中。通过钙依赖磷酸酶控制的信号转导途径来介导肥大细胞的FcεR1激活，所述途径与由Ras超家族的GTP酶、Ras和Rac-1调控的途径起协同作用。

失活的NFATc驻留在细胞溶胶中。其在丝氨酸残基处被磷酸化，这掩闭(mask)了其核定位序列(NLS)并显现了其细胞核输出序列(NES)。为响应持续升高的钙水平，钙依赖磷酸酶使NFATc去磷酸化，这使其NLS外露，并且其迅速易位到细胞核中。在细胞核中，它与诸如AP-1、GATA4、GATA2和MEF2等其它转录因子形成转录复合体。如果钙水平降低，则使NFATc重新磷酸化，露出NES，该蛋白被输出返回到细胞质。

可通过细胞产物和药理学产物两者抑制NFATc去磷酸化和细胞核易位。业已鉴定出四类钙调蛋白磷酸酶复合体的细胞抑制剂：支架蛋白AKAP79、CAIN或CABIN蛋白质；钙依赖磷酸酶B同源物；CHP和唐氏综合症临界区1相关基因；MCIP1、2和3。微生物产物FK506和孢环素-A(Cyclosporine-A)分别结合细胞内蛋白FKBP和亲环素，随后结合钙依赖磷酸酶并封阻磷酸酶活性。这些药剂使移植治疗彻底改变，因为它们具有防止对移植组织的免疫反应的能力。各种激酶涉及NFAT负调控，所述激酶包括GSK3、酪蛋白激酶1、MEKK-1和p38MAPK。

5.2EGFP-NFAT测定

本专利说明书阐述了用于用细胞分泌的细胞相关分析物监测NFATC1信号转导途径的方法。所述测定方法基于在稳定转染的哺乳动物细胞中EGFP-NFATc1融合蛋白的细胞内易位。NFATc1是涉及T-细胞信号转导和组织发育的转录因子。失活的NFATc1转录因子驻留在细胞质中。它们在用激动剂激活后易位到细胞核中。

在INCell Analysis System(GE Healthcare)中用核运输分析模块(Nuclear Trafficking-Ahalysis Module)优化NFAT测定的图像获取和分析，但该测定可在其它系统中成像。核运输分析模块测量加入激动剂时EGFP-NFAT从细胞质易位到细胞核的程度。

5.3来源于U-2OS的亲本细胞系

从一名15岁女孩的胫骨的中度分化肉瘤中获得亲本细胞系U-2OS(ATCC HTB-96)。U-2 OS细胞系的染色体已被高度改变(alert)，且染色体数量在超三倍体范围内，其表达胰岛素样生长因子I和II受体。

5.4来源于U-2OS的表达EGFP-NFATc1的细胞系

按照制造商的说明书用FuGENE 6转染方法(Roche AppliedScience)用pCORON1000 EGFP-NFATc1载体(GE Healthcare)转染U-2OS细胞。用500μg/ml的遗传霉素(Geneticin)对表达重组融合蛋白的稳定克隆进行大约2周挑选。克隆该稳定的细胞系，并用荧光激活的细胞分选仪进行分选，得到均一细胞系。FACS后将传代数设置为1。分选后让细胞再培养8代次，然后冷冻。所测细胞为支原体、细菌和酵母污染阴性。

5.5EGFP-NFATc1表达载体

8.6kb的pCORON1000-EGFP-NFATc1含有细菌氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因和哺乳动物新霉素(neomycin)抗性基因。

5.6所需材料和设备

微孔板。用InCell，Packard黑色96-孔观察板(Packard Black 96-wellViewPlate)(Perkin Elmer 6005182)进行分析。

推荐CASY1细胞计数器和分析仪系统(Cen Counter and AhalyserSystem)(Model TT)(Scharfe System GmbH)，以确保在接种前准确计数细胞。或者，可使用血细胞计数器。

环境调控培养箱(5％CO₂、95％相对湿度、37℃)。

成像器(例如INCell 1000 GE Healthcare)。

层流细胞培养工作台

组织培养瓶(T型瓶)和移液器

调控冷冻速率的设备提供每分钟1℃的受控冷冻速率。

标准组织培养试剂和设备。

5.6.1软件要求

INCell分析系统：可自GE Healthcare获得核运输分析模块，其用于EGFP-NFAT测定的自动图像分析。分析的数据以ASCII格式作为数字文件输出。可将ASCII格式数据输入Microsoft Excel、MicrosoftAccess或用于进一步数据分析的任何类似的软件包中。

培养并维持来源于U-2OS的表达EGFP-NFATc1的细胞系。

5.6.2组织培养基和试剂需求

需要以下培养基和缓冲液来培养、维持和制备细胞，并实施测定。

含Glutamax-1的GIBCO Dulbecco改良的EAGLE培养基(DMEM)(Invitrogen Life Technologies 31966-021)或等同物。

胎牛血清(FBS)，JRH Biosciences 12103或等同物。通过在56℃水浴中孵育30分钟热灭活血清。

GIBCO青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，P/S)(5000单位/ml青霉素G钠和5000μg/ml硫酸链霉素)Invitrogen Life Technologies15140-122或等同物。

遗传霉素(G418)，Sigma G-7034或等同物。

在HBSS中的不含钙或镁的GIBCO胰蛋白酶-EDTA，InvitrogenLife Technologies 25300-054或等同物。

GIBCO HEPES缓冲液，1M溶液，Invitrogen Life Technologies15630-056或等同物。

牛血清白蛋白(BSA)，Sigma A-7888或等同物。

GIBCO磷酸盐缓冲液(PBS)Dulbecco液，其不含碳酸氢钙、碳酸氢镁或碳酸氢钠，Invitrogen Life Technologies 14190-094或等同物。

二甲基亚砜(DMSO)，Sigma D-5879或等同物。

含Glutamax的GIBCO营养混合物F-12培养基，Invitrogen LifeTechnologies 31765-027或等同物。

洛诺霉素，钙盐，Calbiochem，407952

Hoechst 33258，Molecular Probes H-3569

5.6.3试剂制备

生长培养基：含Glutamax-1的DMEM，补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)青霉素-链霉素和0.5mg/ml遗传霉素。

冷冻培养基：含Glutamax-1的DMEM，补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)DMSO。

测定培养基：含Glutamax的营养混合物F-12培养基，补充有10mM HEPES、0.5％(w/v)BSA和3.0μM Hoechst核染色液。

洛诺霉素：在100％DMSO中制备1mM储液。可将其保存在-20℃。用测定培养基制备4μM工作稀释液(四倍终浓度)。这导致DMSO在测定中的终浓度为0.1％(v/v)。应该用测定培养基为对照孔制备0.4％(v/v)DMSO(四倍终浓度)。

5.6.4细胞冻融程序

1.从储藏室取出冷冻小瓶。

2.固定冷冻小瓶，将冷冻小瓶底部四分之三浸入37℃水浴中，轻轻旋动1-2分钟直到内容物融化。

3.从水浴中取出冷冻小瓶，用70％(v/v)乙醇擦拭。立即将细胞转移到T-25瓶中，逐滴加入5ml预热的生长培养基，以防止损毁细胞。再加2ml生长培养基，在37℃孵育。

5.6.5细胞继代培养程序

孵育：5％CO₂、95％湿度、37℃。

这些细胞应以1∶10的比例分离，一周两或三次，直到它们有90％汇合。

1.将所有试剂温热至37℃。

2.从细胞中吸出培养基并丢弃。

3.用PBS洗涤细胞，在洗涤的过程中小心别破坏细胞层，但要保证细胞表面得到洗涤。

4.从细胞中吸出PBS并丢弃。

5.加入胰蛋白酶-EDTA(T-75瓶加2ml，T-162瓶加4ml)，确保所有细胞皆与该溶液接触。等待3-10分钟后细胞变圆(roundup)/松动。

6.当细胞松动时，轻轻拍打瓶以驱散细胞。加入生长培养基(T-75加6ml，T-162瓶加8ml)，用10ml移液器轻轻重悬细胞直到所有的团块分散。

7.吸出细胞混悬液，将1ml细胞分配到新的培养容器中。

5.6.6细胞接种程序

1.针对将被接种到96-孔微板中的在T-75和T-162瓶中生长的细胞，对接下来的程序进行优化。

2.将所有试剂温热到37℃。

3.从细胞中吸出培养基并丢弃。

4.用PBS洗涤细胞。在洗涤的过程中小心别破坏细胞层，但要保证细胞表面得到洗涤。

5.从细胞中吸出PBS并丢弃。

6.加入胰蛋白酶-EDTA(T-75瓶加2ml，T-162瓶加4ml)，确保所有细胞皆与该溶液接触。等待3-10分钟后细胞变圆/松动。

7.当细胞松动时，轻轻拍打瓶以驱散细胞。加入生长培养基(T-75加3ml，T-162瓶加6ml)，用10ml移液器轻轻重悬细胞直到所有的团块分散。

8.用自动细胞计数器或血细胞计数器计数细胞。

9.用新鲜的生长培养基调整细胞密度以将所需数量的细胞递送到每孔中。例如，为了在200μl体积中每孔加1.0x10⁴个细胞，调整悬浮液到每ml 5x10⁴个细胞。

10.将200μl细胞分配到微孔板的每个孔中。

11.在37℃将微孔板中的细胞孵育24小时，然后开始测定。

5.6.7细胞冷冻程序

1.收获并计数细胞。

2.将细胞以300xg离心5分钟。从细胞中吸出培养基。

3.轻轻重悬细胞直到冷冻培养基中没有团块物存留，浓度是1ml中1x10⁶个细胞，转移到冷冻小瓶。每管应含有1ml冷冻培养基中的1x10⁶个细胞。

4.将小瓶转移到冷冻设备中，并在-80℃冷冻16-24小时。

5.将小瓶转移到液氮储存设备气相中。

5.6.8生长特性

在标准生长条件下，细胞应该保持平均18.5μM大小，其如用CASY1细胞计数器和分析仪系统(CASY1 Cell Counter and AnalyzerSystem)所测量(TT模型)。指数生长期细胞系的倍增时间为在标准条件下14小时。

5.6.9激动剂测定方案(96-孔形式)

1.在37℃、5％CO₂和95％湿度中孵育微孔板。

2.在开始测定的前一天以每孔1x10⁴个细胞接种200μl生长培养基。37℃孵育24小时。如果将细胞板的孔之一用于平视野校正(flat field correction)，其不应该含有细胞。

3.在测定当天，制备测试化合物、溶剂对照(如果用到)和参考激动剂对照(洛诺霉素)。这些样品通常在测定培养基中以4倍终浓度来制备。

4.从细胞板滗出生长培养基，去除所有多余的液体并添加200μl。用细胞培养培养基洗涤细胞。滗出洗涤液。

5.加入150μl含有检测试剂的测定培养基。孵育60分钟。

6.总体积为200μl。适当孵育后在INCell 1000上用合适的滤光器和二色镜对所述板成像。

7.用核运输分析模块进行数据分析。

6.用遗传工程改造的细胞进行CHO-M1硝基还原酶基因报告分子测定

6.1简介

报告基因测定技术广泛用于监测与信号转导及基因表达相关的细胞事件。使用术语报告基因来定义具有易于测量表型的基因，其可容易地从内源蛋白背景中辨认出来。报告基因构建体由驱动报告基因表达的诱导型转录调控元件组成。

通常基于测定的灵敏度、动态范围、便利性以及可靠性来选择这些报告分子。

硝基还原酶(NTR)是从大肠杆菌B菌株(Escherichia coli B.)分离的FMN-依赖酶。NTR是结构上同源的家族的一个成员，所述家族含有其晶体结构已经被解析的四个黄素蛋白。该家族可被分为硝基还原酶类(NTR为其中的成员)和黄素还原酶类(例如FRase 1)两类。硝基还原酶类可以进一步再分为对氧气敏感和不敏感两类。本系统中阐述的NTR属于对氧气不敏感的酶类。NTR结构由48kDa的同型二聚体与两个已结合的FMN分子组成，其能够还原多种含硝基的化合物。在多种哺乳类细胞中业已证明NTR表达，而均未报道有毒性。该酶还原硝基基团的能力是猝灭分子荧光的常见机理，其导致开发出基于NTR表达和细胞渗透性的猝灭的花菁染料CytoCy5S的便捷基因报告测定系统。CytoCy5S可渗透膜，其作为该酶的底物起作用，这使得可以在活哺乳动物细胞中使用NTR作为基因表达报告分子。业已优化底物以改善反应产物的细胞内停留时间。目前通常可利用的报告基因系统是侵袭性的(invasive)，并需要破坏细胞来测量报告基因的表达(萤火虫荧光素酶)，或者由于缺乏酶促扩增而灵敏度有限(GFP)。为了克服这些缺陷，开发了作为非侵袭性活细胞报告系统的NTR基因报告系统，所述系统利用细胞渗透性荧光底物。在INCell 1000上进行的NTR基因报告分子测定分析使得在单个活细胞中的基因表达可视化。NTR基因报告分子系统操作简易、便捷。

6.2转染方法

为了建立报告基因测定，将报告基因置于启动子或者含有最小启动子的增强子的转录调控之下。将启动子加上报告基因插入合适的载体中，所述载体例如含有赋予对生长抑制化合物(例如抗生素，例如新霉素)抗性的选择性标记的质粒。将报告DNA引入细胞中以进行瞬时测定，或稳定整合到宿主细胞系的基因组中从而提供稳定的报告细胞系。将质粒构建体引入哺乳动物细胞称为转染，有许多市售试剂用于将DNA递送到细胞中，所述试剂实例包括脂质体、磷酸钙和树枝状聚合物(dendrimer)技术。

质粒瞬时转染是通用的简易操作技术。瞬时转染通常需要过夜进行，并允许研究者进行提供关于载体DNA功能性信息的单个的“一次性”实验。载体DNA分子并没有整合到宿主染色质中，而是以染色体外的分子存在，且寿命通常为24-96小时，在这之后所述DNA以及报告基因的表达消失。瞬时转染的一个主要局限性是转染效率不定，如果不包括内部对照，这可产生异质细胞群及很差的效果。

稳定转染则可以提供含有整合到宿主基因组的报告基因加选择标记的细胞系，即可遗传基因型。

6.3稳定、瞬时转染的细胞系的产生

6.3.1瞬时转染

6.3.1.1方法-基于质粒的转染

1.将细胞接种至60mm的无菌组织培养处理的培养皿中。37℃孵育所述培养皿过夜。

2.当细胞达到50-70％汇合时，用3ml新鲜生长培养基更换培养基。

3.将报告DNA/转染试剂复合物加到每个培养皿中(按照厂商说明制备并优化DNA与转染试剂的比率)。37℃孵育过夜。

4.过夜孵育后，从每皿移除培养基(按照厂商说明制备并优化DNA与转染试剂的比率)。37℃孵育过夜。

5.过夜孵育后，从每皿移除培养基，用3ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤单层细胞。

用胰蛋白酶处理并合并来自各培养皿的细胞，制备已转染的细胞悬液。

6.3.2稳定转染

建立稳定细胞系的过程包括许多变量，其中很多是细胞系依赖性的。产生细胞系的标准方法和指南可在以下文献中找到：Freshney R.I.Cloning and Selection of Specific Cell Types in Culture of Animal Cells，第3版，Wiley-Liss Inc，第11章，第161-178页，1994。简言之，为了获得稳定细胞系，对于pCORON-1003NFAT-NTR载体有必要用G418选择，或者对于pCORON5023NFAT-NTR载体有必要用潮霉素(hygromycin)选择。细胞转染24-48小时后，应该将其置于适当浓度的抗生素下选择。

一旦有足够多的细胞生长，应该以低密度将它们接种到合适的培养皿或培养板的含有选择抗生素的培养基中。

选择抗生素的最佳浓度随细胞类型和生长速率而变化，使用者在转染前应该建立宿主细胞的死亡曲线。一周应更换两次含有选择抗生素的培养基，直到出现抗药性集落。这一过程可以持续2-6周，视细胞类型而异。为了测定筛选程序的效率，应该包括未转染细胞阴性对照。在筛选后3-10天之间应该观察对照细胞的死亡。应该选择单集落并扩增从而建立细胞系文库。应该基于使用者的标准针对确切的生物反应和最佳的测定性能对单个克隆细胞系进行筛选。

6.4CHO-M1 NFAT-NTR细胞系的细胞培养

6.4.1细胞融化程序

从储存室取出冷冻小瓶。

固定冷冻小瓶，将冷冻小瓶底部四分之三浸入37℃水浴中，轻轻旋转1-2分钟直到内容物融化。融化细胞过程不要超过3分钟，因为这会降低细胞存活力。

从水浴中取出冷冻小瓶，用70％(v/v)乙醇擦拭。在37℃立即将细胞转移到含有生长培养基的T-细胞培养瓶中。

以1∶10的比例在补充10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Ham氏F12培养基中常规传代CHO-M1 NFAT-NTR细胞。以0.5mg/ml新霉素(G418)和0.25mg/ml潮霉素维持筛选。细胞在162cm²的组织培养处理的瓶中孵育为单层细胞，在37℃、含5％CO₂气氛下孵育。在从深低温冷冻保藏中取出细胞时，建议在细胞贴壁(通常需要过夜)之前不要加0.5mg/ml G-418和0.25mg/ml潮霉素。一旦建立了细胞培养，就用0.5mg/ml G-418和0.25mg/ml潮霉素维持筛选。

6.4.2测定方案

构建含有NTR基因上游的4个重复NFAT响应元件的报告分子质粒。将质粒引入CHO-M1细胞中，并保持双重选择直到获得克隆。用有限稀释法分离单克隆，并使其增殖和进行生物学反应评估。

6.5试剂制备

6.5.1磷酸盐缓冲盐水

Gibco BRL 14190-094

可以使用备选制剂和市售浓缩液等。

6.5.2CytoCy5S溶液

用DMSO复溶成1-5mM的浓度。应该用测定缓冲液进一步稀释以得到溶液(通常5-10μM)，通常将该溶液作为10x的储液加到细胞中以得到所需的最终浓度。

6.5.3卡巴胆碱(Carbachol)

Sigma C4382-1g

用PBS制备100mM储液。涡旋振荡以重新悬浮内容物。用测定培养基稀释至所需浓度。

6.5.4Hoechst试剂

如果图像分析需要细胞核染色，那么用测定缓冲液制备Hoechst储液。在酚红/无血清培养基中制备25μM Hoechst溶液，每孔加入10μl。为了在INCell 1000分析仪上使板成像，应该将合适的细胞标记物引入到细胞中。实例是细胞核标记物Hoechst。该标记应该足够明亮，以使在分析期间可将细胞辨别为目标，并在光谱上与CytoCy5S分开，防止干扰信号。Hoechst的通常使用浓度为2.5-5μM。

6.5.5瞬时测定对照

6.5.5.1未转染对照

每个实验应该包括对照。未转染对照提供关于任何荧光背景水平的信息，其为确定宿主细胞系中无NTR类似活性存在的核查方法。测定应该在有及没有激动剂两种情况下进行。

6.5.5.2无刺激的对照

无刺激对照提供关于在所选细胞系中在NFAT响应元件调控下NTR基因基线表达的信息。来自该对照的数值可能随不同的细胞系和测定设置条件而变化。

6.6 96孔测定方案实例

在含有2mM L-谷氨酰胺和10％FCS(无选择剂)的完全Ham氏F12培养基中以每毫升2.5x10⁵个细胞制备CHO-M1NFAT-NTR细胞。将200μl(5x10⁴个细胞)分配到96孔微孔板的各个孔中。让板在37℃孵育过夜。

1.过夜孵育后移走培养基，用200μl PBS洗涤细胞单层。

2.将测定培养基中的90μl激动剂(例如卡巴胆碱)加到合适孔中，加90μl测定培养基到对照孔。让板在37℃孵育16小时。

3.孵育16小时后，分配10μl测定培养基中的10μM CytoCy5S(终浓度通常为0.5μM-1μM)。

4.37℃再孵育2小时。

5.加入10μl酚红/无血清培养基中的25μM Hoechst细胞核染料。室温孵育30分钟。

6.让板成像。用适合CytoCy5S的滤光器(激发光滤光器620/60nm；发射光滤光器700/75nm)。在InCell Ahalyzer 1000上用目标强度算法进行成像测定。

7.用于分泌的/细胞相关的分析物测量的ELISPOT测定

7.1简介

Elispot(酶联免疫斑点)测定提供测量在单细胞水平或在极少量细胞数量中由细胞产生抗体或细胞因子的有效方法。

7.2试剂

1.抗TNF抗体(Sigma)

2.ELISPOT板(Millipore HTS，货号MSIPS4510)

3.洛诺霉素或卡巴胆碱(Sigma)

4.生物素化的抗TNF抗体(R&D Systems)

7.3方法

第一天

1.用第一抗体包被ELISPOT板(Millipore HTS货号MSIPS4510)(见下面)。

2.用15μl的35％乙醇预湿润各孔1分钟。在乙醇挥发前用150μl无菌PBS冲洗3次。

3.用100μl无菌PBS中(10μg/ml)的(例如)抗TNF抗体包被板。4℃孵育过夜。

4.将以下对照孔纳入到测定中。

5.无细胞

6.无第一抗体

7.不用检测试剂刺激

第二天

1.封闭膜

2.滗出第一抗体溶液

3.每孔用150μl无菌PBS洗掉未结合的抗体；滗出洗涤液并重复。

4.每孔用150μl细胞培养基(RPMI-1640，10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺)在37℃封闭膜至少2小时。

5.制备细胞(例如野生型U-2OS(ECAAC)或来源于U-2 OS的表达EGFP-NFATc1融合蛋白的细胞系(GEHealthcare)，或中国仓鼠卵巢(CHO)NFAT-NTR细胞(GEHealthcare))。

6.用无菌PBS洗涤细胞，并以细胞培养基将细胞重悬为终浓度2.5X10⁵个细胞/ml。

7.用检测试剂(例如洛诺霉素或卡巴胆碱)刺激细胞。

8.覆盖(plate out)细胞。

9.从ELISPOT板滗出封闭培养基。

10.以每孔100μl将细胞培养基加入到细胞中。

11.在37℃、5％CO₂及95％湿度中孵育18至48小时。

第三天

1.滗出细胞.

2.用PBS/0.01％吐温-20洗涤板6次。可以使用挤压瓶(squeeze bottle)来确保合适洗涤。

3.用PBS/0.5％BSA将生物素化的抗TNF抗体稀释至2μg/ml。通过0.45μM过滤器过滤。每孔加100μl。

4.在37℃、5％CO₂和95％湿度中孵育2小时。

5.用PBS/0.01％吐温-20洗涤6次。

6.用无菌PBS以1∶1000制备链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物。

7.每孔加100μl链霉亲和素碱性磷酸酶。室温孵育45分钟。

8.滗出链霉亲和素，用PBS/0.01％吐温-20洗涤3次，接着用PBS洗涤3次。

9.每孔加100μl的BCIP/NBT加底物。孵育5分钟。

10.流水冲洗并长时间洗涤终止斑点显色。洗涤时去除对底板的板密封，继续冲洗。

11.用吸附纸吸干板以去除多余的液体并吸干孔背面。这将确保底物完全从膜上除去。

12.立即捕获细胞/斑点图像，或者作为选择，让ELISPOT板在黑暗中过夜干燥。

13.用INCell成像系统用亮视野设置来分析板。

8.在INCell 1000分析仪上用EGFP易位测定来联合测定来自洛诺霉素、洛诺霉素+PMA或钙离子载体A23187刺激的EGFP-NFATc1 转染的U-2OS细胞的人TNF、IL-8或PDGF

8.1材料

兔抗人TNF或兔抗人IL-8抗体(Sigma)

抗兔抗PDGF-A(N-30)抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-128)。

抗兔IgG(全分子)R-藻红蛋白缀合物(Sigma；P9537)。

抗兔IgG(全分子)荧光素缀合物(GE Healthcare；N1034)。

洛诺霉素(Sigma；13909)。

钙离子载体A23187(Sigma)C7522。

PMA Sigma(P1585)。

8.2方法

1.在测定开始的前一天以每孔1x10⁴个细胞接种200μl生长培养基中的EGFP-NFATc1转染的U2OS细胞。

2.测定当天制备检测试剂(洛诺霉素、洛诺霉素+PMA、A23187)。这些样品通常用测定培养基制备。

3.从细胞板滗出生长培养基，移走所有多余液体，加入200μl。用细胞培养基洗涤细胞。滗出洗涤液。

4.加入150μl含有检测试剂的测定培养基。孵育60分钟。

5.总体积为200μl。在合适孵育期后，在INCell 1000上用合适的滤光器和分色镜使板成像。

6.用核运输分析模块进行数据分析。

7.让细胞与检测试剂再接触3-18小时，用检测试剂刺激后测量细胞相关的TNF、IL-8或PDGF。

8.用检测试剂刺激后，滗出上清液，用PBS洗涤细胞3次。用抗人TNF、IL-8或PDGF抗体和荧光染料-标记的抗兔IgG(抗兔IgG(全分子)R-藻红蛋白缀合物(Sigma；P9537)或抗兔IgG(全分子)荧光素缀合物(GEHealthcare；N1034))来定位细胞相关的TNF、IL-8或PDGF。

9.与兔抗体孵育60分钟后，洗涤细胞三次，加入染料-标记的抗兔IgG。与荧光标记的第二抗体孵育60分钟后，用PBS洗涤细胞3次，在INcell 1000分析仪(GEHealthcare)上检测荧光，用10x物镜、合适的滤光器装置和分光镜、500毫秒曝光。用目标强度算法分析结果(INCell Investigator软件)。

图11显示EGFP易位和PDGF测量(细胞相关分子)联合测定中的EGFP-NFAT1c易位。用洛诺霉素或钙离子载体A23187刺激转染的U2OS细胞，这导致在INCell上可测量的EGFP-NFAT1c细胞响应。

图12显示与EGFP-NFAT1c易位联合的从EGFP-NFAT1c转染的U2OS细胞中释放的洛诺霉素-刺激的PDGF(图11)。

图13显示来自洛诺霉素-刺激的EGFP-NFAT1c转染的来自单个群体的U2OS细胞的胞内NFAT1c易位和细胞相关PDGF之间的相关性(相关系数0.9629)。如上所述，在INCell分析仪光学成像系统上获得结果。

图14显示在用洛诺霉素+PMA刺激转染的细胞时的EGFP-NFAT1c易位，其如在INCell 1000分析仪光学成像系统中所测量。

图15显示与EGFP-NFAT1c易位联合获得的从EGFP-NFAT1c转染的U2OS细胞释放的洛诺霉素+PMA刺激的TNFα(图14)。

图16显示来自洛诺霉素+PMA-刺激的EGFP-NFAT1c转染的来自单个群体的U2OS细胞的胞内NFAT1c易位和细胞相关人TNFα之间的相关性(相关系数0.9975)。如上所述，在INCell分析仪光学成像系统上获得结果。

9.在INCell 1000分析仪上用ELISPOT测定对来自洛诺霉素 +PMA刺激的EGFP-NFATc1转染的U2OS细胞的细胞相关分析物和 EGFP易位的人TNF进行的联合测定

9.1试剂

1.抗TNF抗体(Sigma)

2.ELISPOT板(Millipore HTS，货号MSIPS4510)

3.洛诺霉素或卡巴胆碱(Sigma)

4.生物素化的抗TNF抗体(R&D SYSTEMS)

9.2方法

1.用第一抗体包被ELISPOT板(Millipore HTS，货号MSIPS4510)。

3.用100μl无菌PBS中(10μg/ml)的(例如)抗TNF抗体包被板，4℃孵育过夜。

4.将以下对照孔纳入到测定中

5.无细胞

6.无第一抗体

7.不用检测试剂刺激

8.滗出第一抗体溶液

9.每孔用150μl无菌PBS洗掉未结合的抗体；滗出洗涤液并重复。

10.每孔用150μl细胞培养基(RPMI-1640，10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺)在37℃封闭膜至少2小时。从ELISPO板滗出封闭培养基。

11.制备细胞(表达EGFP-NFATc1融合蛋白的细胞系(GE Healthcare))。用无菌PBS洗涤细胞，并以细胞培养基将细胞重悬为终浓度2.5X 10⁵个细胞/ml。

12.每孔用100μl细胞培养基覆盖细胞。

13.用检测试剂(例如洛诺霉素+PMA)刺激细胞。

14.总体积为200μl。

15.孵育60分钟。加入Hoescht染色液到终浓度为1μM。

16.用测试培养基洗涤细胞。

17.在InCell 100中用核运输分析模块进行细胞分析。

18.将细胞在37℃、5％CO₂及95％湿度于测定培养基中再孵育18至48小时。

19.滗出细胞。

20.用PBS/0.01％吐温-20洗涤板6次。可以使用挤压瓶来确保合适洗涤。

21.用PBS/0.5％BSA将生物素化的抗TNF抗体稀释至2μg/ml。通过0.45μM过滤器过滤。每孔加100μl。

22.在37℃、5％CO₂和95％湿度中孵育2小时。

23.用PBS/0.01％吐温20洗涤6次。

24.用无菌PBS以1∶1000制备链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物。

25.每孔加100μl链霉亲和素碱性磷酸酶。室温孵育45分钟。

26.滗出链霉亲和素，用PBS/0.01％吐温20洗涤3次，接着用PBS洗涤3次。

27.每孔加100μl的BCIP/NBT加底物。孵育5分钟。

28.流水冲洗并长时间洗涤终止斑点显色。洗涤时去除对底板的板密封，继续冲洗。

29.用吸附纸吸干板以去除多余的液体并吸干孔背面。这将确保底物完全从膜上除去。

30.使板在黑暗中干燥过夜。

31.用INCell分析仪1000成像系统用亮视野设置来分析板。

10.卡巴胆碱-刺激的CHO-M1 NFAT-NTR与NFAT1c-NTR细胞内报告基因测定及人整联蛋白5α(细胞相关分析物)测量的联合测定

10.1试剂

卡巴胆碱(Sigma)

CytoCy5S(GE Healthcare)

Hoechst细胞核染料(Invitrogen)

兔抗仓鼠整联蛋白5抗体(Antibodies OnLineABIN219718)

荧光素标记的抗兔IgG(GE Healthcare)

10.2方法

1.在含有2mM L-谷氨酰胺和10％FCS(无选择剂)的完全Ham氏F12培养基中以每毫升2.5x10⁵个细胞制备CHO-M1NFAT-NTR细胞。将200μl(5x10⁴个细胞)分配到96孔微孔板的各个孔中。让板在37℃孵育过夜。

2.过夜孵育后去除培养基，用200μl PBS洗涤细胞单层。

3.将90μl测定培养基中的激动剂(例如卡巴胆碱)加到合适孔中，加90μl测定培养基到对照孔。让板在37℃孵育16小时。

4.孵育16小时后，分配10μl测定培养基中的10μM CytoCy5S(终浓度通常为0.5μM-1μM)。

5.在37℃再孵育2小时。

6.加入10μl酚红/无血清培养基中的25μM Hoechst细胞核染料。室温孵育30分钟。

7.让板成像。用适合CytoCy5S的滤光器(激发光滤光器620/60nm；发射光滤光器700/75nm)。在InCell Analyzer 1000上用目标强度算法进行成像测定。

8.在37℃、5％CO₂孵育细胞过夜。

9.将细胞与检测试剂再接触18小时，在用检测试剂刺激后测量细胞相关的整联蛋白α5。在用检测试剂刺激后，滗出上清液，用PBS洗涤细胞3次。用兔抗仓鼠整联蛋白5抗体和荧光染料标记的抗兔IgG(全分子)荧光素缀合物(GE Healthcare，N1034)定位细胞相关整联蛋白。

10.用兔抗体孵育60分钟后，洗涤细胞三次，加入染料-标记的抗兔IgG。与荧光标记的第二抗体孵育60分钟后，用PBS洗涤细胞3次，在INcell 1000分析仪(GE Healthcare)上检测荧光，用10x物镜、合适的滤光器装置和分光镜、500毫秒曝光。用目标强度算法分析结果(INcell Investigator软件)。

Claims

1.用于在单个活细胞群中测量至少一种细胞内事件及细胞相关分析物的方法，其中所述至少一种细胞内事件和所述细胞相关分析物是在所述细胞中运行的协同生物化学过程的各个组分，所述方法包括以下步骤：

a)提供含有单个活细胞群的样品；

b)让所述单个细胞群中的至少一个活细胞与引起或怀疑引起所述至少一个细胞产生细胞相关分析物的检测试剂接触；

c)在所述至少一个细胞中测量物理性质的变化，作为至少一种细胞内事件的度量；

d)洗涤所述细胞以去除细胞外液体；

e)测量所述细胞相关分析物的存在、含量或活性；和

f)将所述至少一个细胞中的所述至少一种细胞内事件的变化与所述细胞相关分析物的存在、含量或活性相联系。

2.权利要求1的方法，其中在步骤a)中所述细胞群体的每一个细胞包含第一报告基因构建体，所述报告基因构建体包含编码第一可检测报告分子的核酸序列，所述核酸序列与表达控制元件可操作地连接并在其控制下；其中所述接触步骤b)在允许所述第一报告基因构建体表达的条件下进行。

3.权利要求2的方法，其中所述第一报基因构建体包含编码荧光蛋白的核酸序列。

4.权利要求3的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)或GFP功能类似物。

5.权利要求2的方法，其中所述第一报告基因构建体包含编码酶的核酸序列。

6.权利要求5的方法，其中所述酶选自荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和硝基还原酶。

7.权利要求1的方法，其中所述细胞内事件为离子浓度增加和/或基因表达增加。

8.权利要求1的方法，其中在步骤c)中通过细胞发出的荧光变化来测量所述至少一种细胞内事件。

9.权利要求1的方法，其中在步骤c)中通过光学成像方法来测量所述至少一种细胞内事件。

10.权利要求1的方法，其中通过免疫化学方法测量所述细胞相关分析物的存在、含量或活性。

11.权利要求1的方法，其中通过光学成像方法来测量所述细胞相关分析物的存在、含量或活性。

12.权利要求1-12中任一项的细胞，其中所述细胞群由真核细胞组成。

13.权利要求12的细胞，其中所述细胞选自哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述检测试剂为选自以下的化学实体：药品、食用色素、激素、毒素、烷化试剂、氧化剂和致癌物质。

15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述检测试剂为选自以下的物理因子：电磁辐射(例如UV、X-射线、微波)、β-辐射和热。

16.权利要求1的方法，所述方法进一步包括：

a)在所述检测试剂存在下实施权利要求1-15中任一项的方法；和

b)将所述至少一种细胞内事件的变化及所述细胞相关分析物的存在、含量或活性的变化，与不存在检测试剂时所述至少一种细胞内事件及所述细胞相关分析物的存在、含量或活性中的每一种的对照值进行比较。

17.权利要求16的方法，其中所述对照值以电子形式存储在数据库或其它电子格式中。