CN102016073A - 诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种确定个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的方法，包括检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性，其中一种或多种多态性的存在表明该个体对他汀类药物引起的肌病的易感性发生了改变。

Description

诊断方法
技术领域
本发明涉及检测个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的诊断方法。
背景技术
他汀类药物是通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶从而减少肝脏产生的胆固醇来降低LDL(低密度脂蛋白)胆固醇而广泛使用的药物类别。大规模随机化证据表明他汀类药物治疗可通过每1mmol/L的LDL-胆固醇降低将心脏病发作、中风和再血管化的发生率降低约五分之一1。使用他汀类药物所实现的益处似乎主要与个体发生这些事件的绝对风险有关，以及与LDL胆固醇降低的绝对量有关。用更强的他汀类药物治疗获得的更多益处导致了使用更高剂量的他汀类药物的趋势。
在少数情况下，他汀类药物可导致伴随肌酸激酶的血液水平升高的肌肉疼痛或无力(即肌病)，在极少数病例中，这可导致肌肉溶解和肌红蛋白释放到循环中(即横纹肌溶解)并有肾衰竭和死亡的危险2。他汀类药物导致肌病的机制尚未知晓，但是它们似乎与血液中的他汀类药物的浓度有关。肌病的发生率在使用标准剂量的他汀类药物(例如每天20-40mg辛伐他汀)的患者中只有每年约1/10000，3但在使用更高剂量的他汀类药物(例如每天80mg辛伐他汀)的患者中这种危险增加(可能约10倍)4。同时使用某些可相互作用而使血浆他汀类药物水平上升的药物也增加肌病的发生率。例如，同时给予吉非贝齐已被发现使几种他汀类药物的他汀药物消除曲线下的面积(AUC)增加2-4倍并使发生肌病的风险增加很多倍。5，6同时使用环孢霉素和伊曲康唑以及其他抑制CYP3A4酶的药物已被证明可使血浆他汀类药物的暴露增加数倍，并已将它们与肌病联系起来。7，8这些清楚的关联已经导致在他汀类药物的标签上警告不得同时使用特定他汀类药物剂量和某些其他药物(尤其是吉非贝齐、环孢霉素和伊曲康唑)2。
这些相互作用被认为在他汀类药物与同时给予的药物共用相同的代谢途径时发生。吉非贝齐与他汀类药物的相互作用已被假定是经由UGT葡糖苷酸酶基因或经由几种CYP基因介导的。5，7几种他汀类药物(包括洛伐他汀、辛伐他汀和阿伐他汀)主要经由CYP3A4酶代谢，并且已经得出了如下结论：这些他汀类药物发生的大多数临床上重要的药物-药物相互作用都可归因于同时使用了作为CYP3A4的强效抑制剂或底物的试剂。7普伐他汀不经由CYP基因代谢，但其血浆水平可受到参与其转运消除的基因影响。尽管罗苏伐他汀代谢似乎不依赖CYP系统，然而已知其若干种临床上重要的药物相互作用。例如，当罗苏伐他汀与环孢霉素结合时，罗苏伐他汀的AUC增加7-11倍，并且已经表明环孢霉素对有机阴离子转运多肽C的抑制可降低罗苏伐他汀的肝摄取。9
已经研究了20多种基因对他汀类药物的药代动力学的影响。4，10对于这些基因中的5种(SLCO1B1，CYP3A5，CYP2C9，ABCG2，ABCC2)，至少一个小型研究已报道了它们与血浆他汀类药物水平的关联。SLCO1B1基因编码有机阴离子转运蛋白OATP1B1，已知该蛋白影响多种药物的肝摄取和胆汁排泄。体外研究表明大多数他汀类药物和他汀酸是SLCO1B1转运蛋白的底物，11尽管已经表明该蛋白对被认为主要通过被动注入吸收的亲脂性他汀类药物(例如辛伐他汀和洛伐他汀)的肝摄取的贡献较小。12本发明人进行的文献检索发现，已经发表了14篇关于SLCO1B1基因对他汀类药物(大部分涉及普伐他汀或罗苏伐他汀)药代动力学的影响的独立报告。虽然并非全部研究都得到了统计上显著的结果，并且之前还未对这些研究进行过联合分析，但是对他汀类药物药代动力学的典型影响与由吉非贝齐或强效CYP3A4抑制剂的同时使用所产生的若干倍增加相比要小得多。因此，尚不清楚他汀类药物血浆水平的这种不同是否与他汀类药物相关肌病的风险具有很大的相关性。
之前一些小型研究已经考虑了多种候选基因与可能的他汀类药物相关的肌肉副作用的直接相关性，所述候选基因例如参与某些他汀类药物代谢的CYP3A4，13涉及泛醌(辅酶Q10)缺乏的基因，14和编码有机阴离子转运多肽(OATP)的基因。11已有报道，肌病、肌痛或他汀类药物不耐性与6种基因各具有“名义”p值＜0.05(即在考虑到大量考虑过的候选基因和SNP之前)的关联。然而鉴于这些小型研究的小规模和多重比较，它们没有为任何与他汀类药物相关肌病的遗传关联提供良好的在先证据。此外，在这些研究中，肌病发病率上的明显区别可能被他汀类药物剂量以及共同使用的其他药物上的差异打乱。3具体而言，一个10名肌病患者和26名对照的研究15报道了服用普伐他汀或阿伐他汀的患者中的肌病和SLCO1BI*15单倍型(rs4149056C等位基因和rs2306283G等位基因)之间具有名义p值＜0.01的关联。这一小型研究包括对与不同基因中的152个SNP(以及一些单倍型对照)和与三种不同的他汀类药物(以及这些他汀类药物的不同组合)的关联的探索。在解释所述名义p值时需要考虑这种大量多重比较的影响：因为并非所有检验都是独立的，独立检验的有效数量在300到1000之间。因此，Bonferroni法的应用会使每个名义p值乘以至少300，导致0.01的名义p值完全无显著性。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种确定个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的方法，包括检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性，其中一种或多种多态性的存在表明该个体对他汀类药物引起的肌病的易感性发生了改变。
本发明的另一方面提供了一种降低个体在用他汀类药物治疗过程中发生肌病风险的方法，包括：
i)检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性；
ii)参照在步骤i)中所检测的是否存在所述一种或多种多态性，根据个体对他汀类药物引起的肌病的易感性将个体分类；和
iii)参照在步骤ii)中所确定的个体对他汀类药物引起的肌病的易感性，确定他汀类药物治疗的合适剂量。
优选地，所述一种或多种多态性选自SNP rs4149056和/或与rs4149056紧密连锁的多态性，包括但不限于SNP rs4363657、rs1871395、rs12317268、rs2900478、rs4149100、rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881和rs12366582。
在某些实施方案中，本发明的方法还可包括测定SLCO1B1基因中是否存在一种或多种其他多态性，所述多态性包括但不限于rs2306283、rs11045819和rs34671512。
优选地，本发明的方法包括测定个体的SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的基因型是纯合还是杂合的。
在某些实施方案中，本发明的方法包括测定是否存在与他汀类药物引起的肌病的危险增加相关联的一种或多种多态性的“高危”等位基因。
在某些实施方案中，本发明的方法包括测定是否存在与他汀类药物引起的肌病的危险降低相关联的一种或多种多态性的“低危”等位基因。
优选地，本发明的方法包括测定个体在rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的基因型是纯合还是杂合的。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或者另外地包括测定个体在下述位置的基因型是纯合的还是杂合的：rs1871395、rs12317268、rs7969341、rs11045885或rs12366582处的鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)；在rs4149081或rs12369881处的A或G；在rs4363657或rs11045879处的C或T；在rs2900478处的A或T；或者在rs4149100处的序列碱基缺失或A。
在某些实施方案中，本发明的方法还可包括测定个体在rs2306283处的G或A、在rs11045819处的A或C或者在rs34671512中的C或A的基因型是纯合还是杂合的。
优选地，所述检测步骤包括扩增至少编码SLCO1B1基因的核酸序列中包含所述一种或多种多态性的部分，以及识别由所述扩增的DNA所编码的所述多态性中至少一个等位基因中存在的核苷酸。
优选地，所述检测步骤包括扩增包含SNP rs4149056的SLCO1B1基因的外显子6，更优选地扩增包含SLCO1B1基因第521位上的核苷酸的核酸序列，并识别该位置上存在的核苷酸。
在其他实施方案中，所述检测步骤可替代地或另外地包括扩增至少SLCO1B1基因中包含SNP rs1871395或rs12317268的内含子8部分；至少SLCO1B1基因中包含SNP rs4363657、rs2900478或rs4149100的内含子11部分；或者至少SLCO1B1基因中包含SNP rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881或rs12366582的内含子14部分；以及识别由所述扩增的DNA所编码的所述一种或多种多态性的至少一个等位基因中存在的核苷酸。
在某些实施方案中，本发明的方法还可包括扩增至少SLCO1B1基因中包含SNP rs2306283或rs11045819的外显子5部分；或者至少SLCO1B1基因中包含SNP rs34671512的外显子15部分；以及识别由所述扩增的DNA所编码的所述一种或多种多态性的至少一个等位基因中存在的核苷酸。
优选地，本发明的方法包括使用适于扩增和/或识别在所述一种或多种多态性的至少一个等位基因中存在的核苷酸的合适引物进行聚合酶链式反应(PCR)的应用。
在某些实施方案中，所述扩增和识别可使用一种或多种等位基因特异性扩增引物在同一个步骤中进行。
在本发明方法的其他实施方案中，可使用一种或多种等位基因特异性探针来识别由测试核酸或所述扩增的DNA编码的所述一种或多种多态性的至少一个等位基因中存在的核苷酸。
本发明的另一方面提供了一种为需要用他汀类药物进行治疗的个体确定合适剂量的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的；和
ii)参照个体的基因型确定他汀类药物治疗的合适剂量，其中他汀类药物的标准剂量适于具有高危基因型的个体，而更高剂量适于具有低危基因型的个体。
本发明的另一方面提供了一种对需要用他汀类药物治疗的个体进行治疗的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的；
ii)根据在步骤i)中测定的在所述一种或多种多态性处的个体基因型将个体分类；和
iii)给予合适剂量的他汀类药物，其中他汀类药物的标准剂量适于具有杂合或纯合高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合低危基因型的个体。
优选地，本发明的方法包括为具体的个体确定合适的他汀类药物和该他汀类药物的合适剂量(即他汀类药物治疗方案)。优选地，本发明的方法包括测定个体在SNP rs4149056处的基因型，其中高危基因型被定义为CC或TC基因型，而低危基因型被定义为TT基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs1871395、rs12317268、rs7969341、rs11045885或rs12366582处的基因型，其中高危基因型被定义为GG或GA基因型，而低危基因型被定义为AA基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs4149081或rs12369881处的基因型，其中高危基因型被定义为AA或AG基因型，而低危基因型被定义为GG基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs4363657或rs11045879处的基因型，其中高危基因型被定义为CC或CT基因型，而低危基因型被定义为TT基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs2900478处的基因型，其中高危基因型被定义为AA或AT基因型，而低危基因型被定义为TT基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs4149100处的基因型，其中高危基因型被定义纯合缺失基因型或杂合缺失基因型，而低危基因型被定义为AA基因型。
本发明的另一方面提供了一种对需要用他汀类药物治疗的个体进行治疗的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因在SNP rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的个体基因型是杂合还是纯合的；
ii)根据在步骤i)中测定的个体在rs4149056处的个体基因型将个体分类；和
iii)给予合适剂量的他汀类药物，其中他汀类药物的标准剂量适于具有CC或TC基因型的个体而更高剂量适于具有TT基因型的个体。
本发明的可进一步包括为肌病危险增加的个体确定合适的他汀类药物治疗方案(即药物和剂量)，或者将一个剂量的他汀类药物给予肌病危险增加的个体，其中所述他汀类药物将与一种或多种其他降LDL治疗结合使用。
其他方面为需要用他汀类药物进行治疗的个体提供了治疗或确定合适的治疗方案(即药物和剂量)的类似方法，包括检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性这一步骤，其中所述一种或多种多态性可为与SNP rs4149056和/或与SNP rs4363657紧密连锁的SNP，包括但不限于rs1871395、rs12317268、rs2900478、rs4149100、rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881或rs12366582。
在一个实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、匹伐他汀和罗苏伐他汀。
在优选实施方案中，所述他汀类药物为辛伐他汀，其中标准剂量为每天20或40mg，更高剂量为每天80mg。
在优选实施方案中，本发明的方法可用于为需要用他汀类药物进行治疗的个体确定合适的剂量或他汀类药物治疗方案，其中所述个体例如通过同时使用减慢他汀类药物清除的药物例如胺碘酮、环孢霉素或吉非贝齐、或者通过由于遗传变异或疾病造成的他汀类药物的肝摄取或肾清除下降而具有增加的发生肌病的危险。
在另一方面，本发明提供一种用于筛查个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的体外诊断试剂盒，包含一种或多种用于检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性的试剂。
优选地，所述一种或多种试剂包括一种或多种等位基因特异性扩增引物或等位基因特异性探针。
优选地，所述一种或多种试剂包括能够测定个体的上述一种或多种多态性的基因型是杂合还是纯合的等位基因特异性扩增引物或等位基因特异性探针。
优选地，该试剂盒包含对SLCO1B1基因中一种或多种多态性的等位基因的扩增和/或检测的说明。
优选地，所述试剂盒包含参照个体的所述一种或多种多态性的基因型是杂合还是纯合而限定他汀类药物治疗的合适剂量的说明，其中他汀类药物的标准剂量适于具有杂合或纯合的高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合的低危基因型的个体。
附图说明
图1示出了在每天分配80mg辛伐他汀的85名高加索人肌病病例和90名高加索人对照的初始全基因组关联研究中分别测量的每个SNP的概率值。分析包括在Sentrix HumanHap300-Duo BeadChip(Illumina)上的318,237个SNP中的316,184个(99.4％)。水平线上方的结果的各SNP p值＜5x10-7(即有利地证明了关联)。箭头标示p值为4x10-9的SNP rs4363657(在对所测量的SNP的数量校正后具有高度显著性P＝0.001)。
图2示出了在全基因组关联研究中每个测量的SNP相对于给定级别的期望值的卡方分布值(分位数-分位数图)。实线和点线分别示出了在任何基因座上都无关联的零假设下的期望分布和95％置信区间(CI)。箭头标示了位于在染色体12上的SLCO1B1基因的内含子11内的SNP rs4363657。
图3示出了在不同类别的参与者中与SLCO1B1基因的rs4149056SNP关联的肌病的比值比(odds ratio)。黑方块表示每个子部分的比值比(面积与每个子部分中统计信息的量成比例)，水平线表示95％CI(当CI超出标度时以箭头终结)。未画阴影的菱形表示总的比值比及其95％CI。
图4示出了每天分配80mg辛伐他汀的参与者中由SLCO1B1rs4149056基因型引起的累积肌病风险估计值。
定义
本文所用的术语“标记物”是指染色体上具有可识别的物理位置的DNA区段。标记物可为基因或其他可识别的核酸序列，例如开放阅读框、内含子的一部分或基因间的基因组DNA区段。优选地，所述标记物为多态性位点，优选单核苷酸多态性。
“多态性位点”是指核酸序列中具有多态性的位置。一个多态性位点可小至一个碱基对。
术语“多态性”是指遗传变异，或者一个群体中在单个基因座上出现两种或多种遗传决定的可选序列。多态性位点的序列的每种形式都被称为所述多态性位点的“等位基因”。优选的多态性具有两个等位基因，其中次要等位基因在选定群体中出现的频率大于1％，更优选地大于5％或10％。在选定群体中最常出现的等位基因形式有时称为“野生型”形式。在选定群体中较少出现的等位基因形式有时称为“突变型”形式。二倍体生物体的等位基因形式可为纯合或杂合的。双等位基因多态性有两种形式。三等位基因多态性有三种形式。多态性的实例包括限制性片段长度多态性(RFLP)、数目可变的串联重复序列(VNTR)、单核苷酸多态性(SNP)、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列、简单序列重复序列和插入元件例如Alu。
术语“SNP”或“单核苷酸多态性”是在由单个核苷酸占据的多态性位点上出现的多态性。SNP位点的前后通常是高度保守的序列(例如，在不到群体1/100或1/1000的成员中有所变化的序列)。本文所用的“SNPs”是“SNP”的复数。最常见的SNP是双等位基因。最常见的SNP等位基因称为“主要”或“野生型”等位基因，所述SNP的另一种等位基因称为“次要”或“突变型”等位基因。SNP通常由于在多态性位点上一个核苷酸为另一个核苷酸所置换而产生。转换是指一个嘌呤为另一个嘌呤所替换，或者一个嘧啶为另一个嘧啶所替换。颠换是指一个嘌呤为一个嘧啶所替换，或一个嘧啶为一个嘌呤所替换。SNP也可因相对于参照等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入而产生。
SNP在世代之间中往往是进化稳定的，因此可用于研究整个群体中的特定遗传异常。如果SNP出现在蛋白编码区，其可导致变异——有时是缺陷——形式的蛋白的表达，所述形式的蛋白可导致遗传疾病的发生。因此这样的SNP可作为所述遗传疾病的有效指标。某些SNP可出现在非编码区，然而，仍可导致有差异或有缺陷的剪接，或者改变蛋白表达水平。因此SNP可用作诊断工具以识别具有某些疾病素因的个体，对患有疾病的个体就病症的遗传原因进行基因分型，以及促进基于所揭示的有关靶蛋白在发病过程中的作用的内容的药物开发。
“SNP位置”或“SNP基因座”是出现SNP的多态性位点。
本文所用的术语“连锁”是指在两个或更多个多态性位点处的等位基因的非随机性关联。术语“紧密连锁”是指相关系数平方值r2＞0.8的连锁不平衡的量度。
本文所用的术语“核酸”是指任何长度的单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并包括如下非限制性的实例：基因的编码和非编码序列、正义和反义序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多核苷酸、分离和纯化的天然DNA或RNA序列、合成RNA和DNA序列、核酸探针、引物以及它们的片段。多核苷酸这一指代可作相似的理解。
本文提供的多核苷酸的“片段”这一术语是指能够与目的靶标进行特异性杂交的连续核苷酸子序列，例如长度至少为10个核苷酸的序列。所述片段可包含一个多核苷酸的10个、优选15个核苷酸、优选地至少20个核苷酸、更优选地至少30个核苷酸、更优选地至少40个核苷酸、更优选地至少50个核苷酸、最优选地至少60个核苷酸的连续核苷酸。多核苷酸序列的片段可用作引物、探针，可存在于微阵列中，或者可用于基于多核苷酸的识别方法。
术语“寡核苷酸”是一般为5-100个连续碱基，并经常为5-10、5-20、10-20、10-50、15-50、15-100、20-50或20-100个连续碱基的核酸。长于约20个连续碱基的寡核苷酸可称为多核苷酸。多态性位点(多态性)可出现在寡核苷酸内的任何位置。
术语“引物”是指能够与模板杂交并用于引发与靶标互补的多核苷酸的聚合反应、通常具有游离3′OH基团的多核苷酸。
术语“探针”是指用于在基于杂交反应的测定中检测与所述探针互补的核苷酸序列的多核苷酸。所述探针可由如本文所定义的多核苷酸“片段”组成。
术语“在严格条件下杂交”及其语法上的同义语是指，在规定的温度和盐浓度条件下，多核苷酸分子与靶标多核苷酸分子(例如固定在DNA或RNA印迹物例如DNA印迹物或RNA印迹物上的靶标多核苷酸分子)杂交的能力。在严格杂交条件下杂交的能力可通过先在较不严格条件下杂交然后将严格度增加至所需的严格度而确定。
对于长度超过约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严格杂交条件为低于天然双链体的解链温度(Tm)不超过25-30℃(例如10℃)(通常参见Sambrook et al，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Ausubel et al，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing)。大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可通过公式Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+))来计算(Sambrook et.al，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy，1962，PNAS 84：1390)。长度大于约100个碱基的多核苷酸的典型严格杂交条件为例如如下杂交条件：在6X SSC、0.2％SDS的溶液中预洗；在65℃下，在6X SSC、0.2％SDS中杂交过夜；然后在65℃下，在1X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次30分钟，并在65℃下，在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次30分钟。
在一个实施方案中，严格条件为在42℃下使用50％甲酰胺、5xSSC、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖；在42℃下，在0.2x SSC中和在55℃下，在50％甲酰胺中洗涤；然后在55℃下，在含EDTA的0.1x SSC中洗涤。
对于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，严格杂交条件例如为低于Tm 5-10℃。长度小于100bp的多核苷酸分子的Tm平均降低约(500/寡核苷酸长度)℃。
当用于他汀类药物引起的肌病时，术语“易感性”或任何类似短语例如“倾向性”或“素因”是指，某些等位基因被发现与他汀类药物治疗引起的肌病有关，或者预示所述肌病。这些“高危”等位基因可为次要(或突变型)等位基因或者主要(或野生型)等位基因。因此，这些等位基因在有发生他汀类药物诱导的肌病的危险的个体中的频率或携带率与在不易感他汀类药物诱导的肌病的个体中的相比代表性过度(over-represented)。因此，术语“个体对他汀类药物诱导的肌病的易感性”是指：与群体中没有携带特定多态性等位基因或基因型(即等位基因或多态性模式)的成员相比，携带所述特定多态性等位基因或基因型的个体发生他汀类药物诱导的肌病的频率在统计学上更高或更低。
在一个多态性位点上带有一个或两个高危等位基因的个体被称为分别具有该特定多态性位点的杂合或纯合的“高危”基因型。不带有特定高危等位基因的个体被称为具有纯合的“低危”基因型。
本文所用的术语“肌病”是指伴随血清肌酸激酶浓度升高的任何肌肉症状例如疼痛、无力或压痛，包括肌痛、肌炎、肌病和横纹肌溶解。
本文所用的术语“生物学样品”是指源自待筛查患者的生物学样品。所述生物学样品可为可检测到选定标记物的表达的本领域所知的任何合适的样品。包括来自身体组织或体液的各种细胞和细胞群。待检测的合适体液的实例为血浆、血液、淋巴液和尿液。
本说明书和权利要求中所用的术语“包含”是指“至少部分地由……构成”，即当解释本说明书和权利要求中包括该术语的表述时，在每个表述中由该术语引出的所有特征都必须存在，但也可存在其他特征。相关术语例如“包括”和“含有”以类似的方式进行解释。
具体实施方式
本发明基于如下鉴定结果：SLCO1B1基因中的多态性，尤其是单核苷酸多态性(SNP)rs4149056或与rs4149056紧密连锁的一种或多种多态性——包括但不限于rs4363657——与肌病具有强关联(未校正的p＝4x10-9)。因此，个体对可归因于SLCO1B1基因中变异的他汀类药物诱导性疾病的易感性是由SLCO1B1基因中的多态性的联合作用所产生的累积危险性。
因此，本发明的第一个方面提供了一种确定个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的方法，包括检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性，其中一种或多种多态性的存在表明该个体对他汀类药物引起的肌病的易感性发生了改变。
本发明的另一方面提供了一种降低个体在用他汀类药物治疗过程中发生肌病风险的方法，包括：
i)检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性；
ii)参照在步骤i)中所检测的是否存在所述一种或多种多态性，根据个体对他汀类药物引起的肌病的易感性将个体分类；和
iii)参照在步骤ii)中所确定的个体对他汀类药物引起的肌病的易感性，确定他汀类药物治疗的合适剂量。
优选地，所述一种或多种多态性选自SNP rs4149056和/或与rs4149056紧密连锁的多态性，包括但不限于SNP rs4363657、rs1871395、rs12317268、rs2900478、rs4149100、rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881和rs12366582。
在某些实施方案中，本发明的方法还可包括测定SLCO1B1基因中是否存在一种或多种其他多态性，所述其他多态性包括但不限于rs2306283、rs11045819和rs3467151。另外的多态性包括rs11045818和rs2291075。
优选地，本发明的方法包括测定个体的SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的基因型是纯合还是杂合的。
在某些实施方案中，本发明的方法包括测定是否存在与他汀类药物引起的肌病的危险增加相关联的一种或多种多态性的“高危”等位基因。
在某些实施方案中，本发明的方法包括测定是否存在与他汀类药物引起的肌病的危险降低相关联的一种或多种多态性的“低危”等位基因。
在一个多态性位点上带有一个或两个高危等位基因的个体可分别被归类为具有该特定多态性位点的杂合或纯合的“高危”基因型。不带有特定高危等位基因的个体被归类为具有纯合的“低危”基因型。
优选地，本发明的方法包括测定个体在rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的基因型是纯合还是杂合的。
本发明的方法可替代地或者另外地包括测定个体在下述位置的基因型是纯合的还是杂合的：rs1871395、rs12317268、rs7969341、rs11045885或rs12366582处的鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)；在rs4149081或rs12369881处的A或G；在rs4363657或rs11045879处的C或T；在rs2900478处的A或T；或者在rs4149100处的缺失或A。
在某些实施方案中，本发明的方法还可包括测定个体在rs2306283处的G或A、在rs11045819处的A或C或者在rs34671512中的C或A的基因型是纯合还是杂合的。
所有等位基因编码被分别表示为正向(正义链)的突变型(次要)或野生型(主要)等位基因。
用于确定在生物学样品中是否存在特定等位基因的技术为本领域已知，包括但不限于，基于序列的基因突变检测技术例如扩增、核酸测序或核酸杂交。许多用于检测等位基因变异的现有方法在Nollau et al，Clin.Chem.43：1114-1120，1997以及在标准教科书例如“Laboratory Protocols for Mutation Detection”，Ed.by U.Landegren，Oxford University Press，1996和“PCR”，2nd Edition by Newton & Graham，BIOS Scientific Publishers Limited，1997中进行了综述。
在优选实施方案中，本发明包括分离包含一种或多种待检测多态性的核酸的步骤。
所测试的核酸可使用多种本领域中已知的技术从生物学样品中分离。例如，这种核酸可通过在分析前对所述核酸进行扩增而分离。扩增技术为本领域普通技术人员所知，包括但不限于克隆、聚合酶链式反应(PCR)、等位基因特异性聚合酶链式反应(PASA)、聚合酶链式连接、巢式聚合酶链式反应等。
将标记的多核苷酸探针与固定在固体基质例如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的多核苷酸杂交的技术也可用于筛查基因组或cDNA样品。类似地，探针可与小珠偶联并与靶序列杂交。分离可使用本领域已知的方案例如磁分离方法进行。示例的严格杂交和洗涤条件如上。
优选地，所述检测步骤包括扩增至少编码SLCO1B1基因的核酸序列中包含所述一种或多种多态性的部分，以及识别由所述扩增的DNA编码的所述多态性中至少一个等位基因中存在的核苷酸。优选地，所述检测步骤包括扩增包含SNP rs4149056的SLCO1B1基因的外显子6，更优选地扩增包含SLCO1B1基因第521位上的核苷酸的核酸序列，并识别在至少一个等位基因中的该位置上存在的核苷酸。
在其他实施方案中，所述检测步骤可替代地或者另外地包括扩增至少编码SLCO1B1基因的核酸序列中包含与SNP rs4149056紧密连锁的一种或多种多态性的部分，所述部分包括但不限于至少SLCO1B1基因中包含SNP rs1871395或rs12317268的内含子8部分；至少SLCO1B1基因中包含SNP rs4363657、rs2900478或rs4149100的内含子11部分；至少SLCO1B1基因中包含SNP rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881或rs12366582的内含子14部分；以及识别由所述扩增的DNA编码的所述一种或多种多态性的至少一个等位基因中存在的核苷酸。
在某些实施方案中，本发明还可包括扩增个体的生物学样品中的核酸序列的步骤，所述核酸序列包含一种或多种可提供关于肌病风险的独立信息的其他SNP，包括但不限于SLCO1B1基因中包含SNPrs2306283或rs11045819的外显子5；或至少SLCO1B1基因中包含SNP rs34671512的外显子15部分。
所述基本扩增方案的许多变化方案为本领域技术人员所熟知。基于PCR的检测方法可包括同时进行的多个标记物的多重扩增。例如，可选择PCR引物以产生大小不重复并可同时分析的PCR产物。或者，可用差异标记并由此可在同一反应中区别检测的引物扩增不同的遗传标记物。允许多个标记物的多重分析的其他技术也为本领域所知。
测试核酸或扩增产物中所述多态性的至少一个等位基因中存在的核苷酸可以多种方法检测或测定，所述方法包括但不限于大小分析、在反应产物中检测特异性标记的寡核苷酸引物、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交、等位基因特异性S1核酸外切酶检测、测序、核酸杂交等。例如，所述检测可包括对编码多态性的核酸进行测序以确定所存在的等位基因。或者，所述检测可包括将扩增步骤的产物与适合结合遗传多态性的一个等位基因的探针进行杂交的步骤。
优选地，所述杂交探针为被可检测地标记的探针。可检测标记例如放射性同位素、酶标记、荧光标记、化学发光标记和生物发光标记可用于帮助检测。标记探针的标记和显像可根据本领域已知的方法进行。
为方便起见，可将所述杂交探针固定在固相基质上，所述基质包括树脂(例如聚丙烯酰胺)、碳水化合物(例如琼脂糖)、塑料(例如聚碳酸酯)和乳胶小珠。
在本发明的一个优选实施方案中，能够与等位基因变异特异性杂交的若干种探针可附着在固相基质上。寡核苷酸可通过多种方法包括石印术而结合在固相基质上。例如芯片可容纳至少250,000个寡核苷酸(GeneChip，Affymetrix)。使用这些包含寡核苷酸的芯片——也称为“DNA探针阵列”——的突变检测分析在例如Cronin et al.(1996)Human Mutation 7：244以及Kozal et al.(1996)Nature Medicine2：753中进行了描述。在一个实施方案中，一个芯片包含一个基因的至少一个多态性区的全部等位基因变异。然后使所述固体基质与测试核酸接触并检测与所述特异性探针的杂交情况。因此，一个或多个基因的多种等位基因变异的特性可通过简单杂交实验识别。例如，在SLCO1B1基因中的SNP rs4149056处的核苷酸多态性和/或与rs4149056紧密连锁的一个或多个多态性或其他可能的多态性区域的等位基因变异可在一个杂交实验中确定。
用于对SLCO1B1基因的特定外显子和内含子进行扩增和测序的合适寡核苷酸示于下表4中并作为SEQ ID NO：1-51提供。
在某些实施方案中，所述检测可包括用适合与所述遗传多态性的一个等位基因结合的第一种探针探测所述测试核酸或扩增步骤产物，并优选地用第二种适合与所述遗传多态性的另一个等位基因结合的第二种探针探测的步骤。优选地，所述探针是为了与所述等位基因之一结合而设计的核酸序列。如果所述探针之一与所述扩增产物结合，那么受试者的该等位基因是纯合的。然而，如果两种探针都与所述扩增产物结合，那么受试者的每个等位基因都是杂合的。
本发明的另一方面提供一种为需要用他汀类药物进行治疗的个体确定合适剂量的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的；和
ii)参照个体的一种或多种多态性的基因型确定他汀类药物的合适剂量，其中他汀类药物的标准剂量适于具有杂合或纯合高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合低危基因型的个体。
本发明的另一方面提供一种对需要用他汀类药物治疗的个体进行治疗的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的；
ii)根据在步骤i)中测定的个体在一种或多种多态性处的基因型将个体分类；和
iii)给予合适剂量的他汀类药物，其中他汀类药物的标准剂量适于具有高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合低危基因型的个体。
优选地，本发明的方法包括为特定个体确定合适的他汀类药物和该他汀类药物的合适剂量(即他汀类药物治疗方案)。例如，英国卫生部门推荐日常使用更高的他汀药物剂量例如每天80mg的辛伐他汀，而不顾平均肌病危险的增加。所述他汀类药物治疗方案可能适用于不带有与他汀类药物诱导的肌病相联的SNP rs4149056的“高危”C等位基因的个体。对于带有所述“高危”C等位基因的个体，包含标准剂量的效力更大的他汀类药物的他汀类药物治疗方案可提供相似水平的LDL胆固醇降低，而不增加与较高的他汀类药物剂量关联的肌病危险。
在优选实施方案中，本发明的方法包括测定个体在SNP rs4149056处的基因型，其中高危基因型被定义为CC或TC基因型，而低危基因型被定义为TT基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs1871395、rs12317268、rs7969341、rs11045885或rs12366582处的基因型，其中高危基因型被定义为GG或GA基因型，而低危基因型被定义为AA基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs4149081或rs12369881处的基因型，其中高危基因型被定义为AA或AG基因型，而低危基因型被定义为GG基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs4363657或rs11045879处的基因型，其中高危基因型被定义为CC或CT基因型，而低危基因型被定义为TT基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs2900478处的基因型，其中高危基因型被定义为AA或AT基因型，而低危基因型被定义为TT基因型。
在其他实施方案中，本发明的方法可替代地或另外地包括测定个体在SNP rs4149100处的基因型，其中高危基因型被定义纯合缺失基因型或杂合缺失基因型，而低危基因型被定义为AA基因型。
本发明的另一方面提供一种对需要用他汀类药物治疗的个体进行治疗的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因在SNP rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的个体基因型是杂合还是纯合的；
ii)根据在步骤i)中测定的个体在rs4149056处的基因型将个体分类；和
iii)给予合适剂量的他汀类药物，其中他汀类药物的标准剂量适于具有CC或TC基因型的个体，而更高剂量适于具有TT基因型的个体。
本发明的还可包括为肌病危险增加的个体确定合适的他汀类药物治疗方案(即药物和剂量)，或者将一个剂量的他汀类药物给予肌病危险增加的个体，其中所述他汀类药物将与一种或多种其他降LDL治疗结合使用。
优选地使用试剂盒来实施本发明的方法。
因此，本发明的另一方面提供了一种用于筛查个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的体外诊断试剂盒，包含一种或多种用于检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性的试剂。
优选地，本发明的试剂盒包含用于检测是否存在与他汀类药物引起的肌病的危险增加相关联的一种或多种多态性的“高危”等位基因，和/或是否存在与他汀类药物引起的肌病的危险降低相关联的一种或多种多态性的“低危”等位基因。
优选地，所述试剂盒包含DNA采样试剂和——优选地——PCR扩增试剂。优选地，所述PCR扩增试剂包括Taq聚合酶。
优选地，所述一种或多种试剂包括一种或多种等位基因特异性扩增引物或等位基因特异性探针。
优选地，所述一种或多种试剂包括能够测定上面详述的一种或多种多态性、更优选地SNP rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的个体基因型是杂合还是纯合的等位基因特异性扩增引物或等位基因特异性探针。
所述试剂盒还将方便地包括对照试剂(阳性和/或阴性)和/或用于检测所述核酸的工具。最通常地，所述试剂盒是适于本领域已知测定法的形式，更通常是适于本领域已知的PCR、DNA杂交或RNA ELISA测定法的形式。
优选地，所述试剂盒包含用于探测扩增步骤产物以确定被测试个体的基因型的工具。所述试剂盒优选地包含适合与所述遗传多态性的一个等位基因结合的第一种探针，并优选地包含适合所述遗传多态性的另一个等位基因结合的第二种探针。优选地，所述探针是为了与一个等位基因结合而设计的核酸序列。优选地，所述探针是上面讨论的被可检测地标记的探针。
可使所述探针结合于上面讨论的固体基质，或者与使其与所述基质结合的试剂包装在一起。所述固体基质或基底可为小珠、平板、管、浸棒、条带或生物芯片的形式。可寻址定位的生物芯片或平板以及离散的微量滴定板是特别有用的。
所述试剂盒将由一个或多个容器构成，还可包括采样装置例如瓶、袋(例如静脉输液袋)、管形瓶、注射器和试管。其他组成可包括针头、稀释剂、洗涤试剂和缓冲剂。通常，所述试剂盒可包含至少一个装有可药用缓冲液例如磷酸盐缓冲液、林格氏液和葡萄糖溶液的容器。
优选地，所述试剂盒包含对SLCO1B1基因中一种或多种多态性的等位基因的扩增和/或检测的说明。
优选地，所述试剂盒包含参照所述一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的而限定他汀类药物治疗的合适剂量的说明，其中他汀类药物的标准剂量适于具有杂合或纯合的高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合的低危基因型的个体。
在优选实施方案中，本发明的方法包括从个体获得生物学样品的其他步骤。
本发明的方法可用于为需要用他汀类药物进行治疗的个体确定合适的他汀类药物治疗方案(即药物和剂量)，其中所述个体例如通过出于大量降低LDL胆固醇的需要而使用更高剂量的他汀类药物，同时使用减慢他汀类药物清除的药物例如胺碘酮、环孢霉素或吉非贝齐，或者通过由于遗传变异或疾病造成的他汀类药物的肝摄取或肾清除下降而具有增加的发生肌病的危险。在这些情况下，对SLCO1B1基因中变异的基因分型可表明某一他汀类药物的某一剂量由于使发生肌病的危险增加而不合适。例如，对于具有与肌病危险的增加相关联的那些SNP的杂合或纯合基因型的个体，不适合使用某一他汀类药物的高剂量治疗方案。因此这使得可对不同他汀类药物和/或他汀类药物剂量和/或其他降LDL胆固醇治疗剂的添加和/或其他干预手段进行选择，以在降低心血管病的危险同时使发生肌病的危险最小化。
因此对遗传变异的筛查应使得他汀类药物治疗的全部可能的好处可更安全地获得。对这些遗传变异的检测还可关系到由SLCO1B1转运的除他汀类药物以外的药物(例如口服降血糖药瑞格列奈)的作用。
在一个实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、匹伐他汀和罗苏伐他汀。在优选实施方案中，所述他汀类药物为辛伐他汀，其中标准剂量为每天20或40mg，更高剂量为每天80mg。
标准剂量可定义为使LDL胆固醇降低30-45％所需的他汀类药物的每日剂量。其他他汀类药物的标准剂量通常为：阿伐他汀约10-20mg、氟伐他汀40-80mg、洛伐他汀40mg、普伐他汀40mg、匹伐他汀2mg和罗苏伐他汀10mg。更高剂量可定义为他汀类药物的标准每日剂量的两倍或更高剂量。
在某些种族的患者群体中，预计使LDL胆固醇降低30-45％所需的每种他汀类药物的每日剂量——即“标准剂量”——会低于上述标准剂量。“更高剂量”也会相应地降低。例如，在美国进行的药代动力学研究表明，罗苏伐他汀在亚洲受试者(菲律宾人、中国人、日本人、韩国人、越南人或亚洲印度人)中的暴露中值为白种人(高加索人)对照组的约2倍。16在这些患者群体中，某一他汀类药物的“标准”和“更高”剂量可为上述的各他汀类药物每日剂量的一半或更低。
如上所述，本发明基于如下鉴定结果：SLCO1B1基因中的多态性，尤其是单核苷酸多态性(SNP)rs4149056或与rs4149056紧密连锁的一种或多种多态性——包括但不限于rs4363657——与肌病具有强关联(未校正的p＝4x10-9)。在rs4363657SNP变体处的变异不影响所述基因的编码，但所编码的蛋白为与SNP rs4363657几乎完全连锁的rs4149056(Val174Ala)SNP(r2＝0.97)所改变。
如在下面的实施例中详细描述的，对照中非编码rs4363657SNP的C等位基因的频率为0.13，并且每个C等位基因的肌病比值比为4.3(95％CI 2.5-7.2)，CC相对于TT纯合子的肌病比值比为17.4(4.8-62.9)。对照中编码rs4149056SNP(Val174Ala)的C等位基因的频率为0.13，并且每个C等位基因的肌病比值比为4.5(95％CI2.6-7.7)，CC相对于TT纯合子的肌病比值比为16.9(4.7-61.1)。
通过每天分配80mg辛伐他汀的参与者的rs4149056基因型估算的累积肌病危险示于图4。CC纯合子具有18％的肌病累积危险，而CT基因型关联的累积危险约为3％，并且TT纯合子只有0.6％的累积危险。这表明在第一年中肌病病例的63％和全部肌病病例的60％可归因于SLCO1B1基因中的rs4149056C变异。
还研究了改变了所编码蛋白的SLCO1B1基因中的其他变异。发现三种变异相对常见并且与rs4149056只存在中度连锁不平衡，表明它们提供独立信息。在考虑rs4149056的影响后，rs2306283和rs34671512功能性SNP的更常见变异与他汀类药物诱导的肌病的更高频率相关，所述更高的频率对于rs2306283是统计学上显著的，对于rs34671512则在具有统计学上显著性的临界线上。这些SLCO1B1的SNP中的一部分(包括但不限于rs4149056)还会改变他汀类药物治疗的降胆固醇作用。因此，个体对可归因于SLCO1B1基因中变异的他汀类药物诱导的疾病的易感性是由SLCO1B1基因中的多态性的联合作用所产生的累积危险。
如上面讨论的，一些小型研究先前已经考虑了多种候选基因与可能的他汀类药物相关的肌肉副作用的直接相关性，所述候选基因例如参与某些他汀类药物代谢的CYP3A4，13涉及泛醌(辅酶Q10)缺乏的基因，14和编码有机阴离子转运多肽(OATP)的基因。11已有报道，肌病、肌痛或他汀类药物不耐性与6种基因各具有“名义”p值＜0.05(即在考虑到大量考虑过的候选基因和SNP之前)的关联。在本申请所依据的“SEARCH”研究中，对于4种基因(ABCB1/MDR1、COQ2、HTR3B和HTR7)，发明人的大规模研究未能证实具有统计学置信度的推定关联，并且还存在基因组筛查(4中的补充表2、4和5)未能很好地覆盖的第5种基因CYP2D6。
通过对比，在所述“SEARCH”研究中服用高剂量辛伐他汀的患者中他汀类药物相关肌病的大量病例和来自相同群体的良好匹配的大量对照以及独立的大规模“心脏保护研究”(HPS)群体中的独立重复试验(如4中公布的，所述文献以引用的方式纳入本文中)，明确证明了单基因中的变异(在SLCO1B1中的rs4149056处)造成了大多数他汀类药物诱导的肌病病例。
在之前已公布的临床研究报告中，rs4149056基因型和他汀类药物药代动力学之间的关联已由本发明人总结(4中的补充表6)，并按照他汀类药物的类型示于下表1中。所述关联对于每种他汀类药物都分别是统计上显著的，除了氟伐他汀(对于它只有一个研究)之外。
表明SLCO1B1 rs4149056C等位基因使若干种不同的他汀药物的血浆浓度中度增加的先前研究证据支持如下推论：rs4149056不仅可影响辛伐他汀的肌病危险，而且还可影响若干其他他汀类药物的肌病危险。
Figure BPA00001251086400231
表1：他汀类药物浓度和SLCO1B1 rs4149056 SNP之间的关联的体内研究中他汀类药物类型的估算总结。
下文将借助以下实施例以非限制性方式对本发明进行举例说明。
实施例
在12,064名有心肌梗塞史的参与者中进行的“SEARCH”(额外降低胆固醇和高半胱氨酸的有效性的研究)试验旨在证明每天分配80mg辛伐他汀达约7年是否能比每天分配20mg辛伐他汀的标准方案更大程度地安全降低心血管病危险。
在对“SEARCH”中每天分配80mg辛伐他汀的6031名参与者平均随访约6年期间，出现了49个明确肌病病例，还有49名参与者被确定为患有初期肌病(见“方法”部分)。这98个明确或初期肌病病例的一多半是在随访的第一年出现的。他汀类药物导致肌病的机制尚未知晓，但是它们似乎与血液中的他汀类药物的浓度有关。在“SEARCH”中的临时安全分析揭示了在胺碘酮的使用和每天分配80mg辛伐他汀的参与者中的肌病之间存在一种很强但之前未发现的关联，肌病的相对危险度接近10。因此，向“SEARCH”中服用胺碘酮的全部参与者每天提供20mg辛伐他汀(不管他们原来的分配是多少)，并且现在胺碘酮与更高的辛伐他汀剂量的同时使用是禁忌的。据假设，在高剂量他汀类药物治疗时他汀类药物诱导的肌病与遗传变异尤其是影响他汀类药物血液水平的遗传变异之间可能存在相似的强关联。
方法
“SEARCH”中的参与者和样品
在“SEARCH”中，随机分配12,064个年龄在18-80岁之间的心肌梗塞幸存者每天接受80mg或20mg辛伐他汀。17筛查访问的排除标准包括：协调中心实验室测定的血液肌酸激酶(CK)水平高于正常值上限(ULN；250IU/L)的3倍，血液丙氨酸转氨酶(ALT)水平高于ULN的1.5倍，以及同时使用可增加肌病危险的药物(即非诺贝特、高剂量烟酸、环孢霉素、奈法唑酮、甲氨蝶呤和全身性唑类抗真菌剂或大环内酯抗生素)。随机化后，对参与者的随访被安排在第2、4、8和12个月，然后每6个月随访一次。搜集关于任何可能的心肌梗塞、心绞痛、中风、血管操作、肺栓塞、癌症的住院治疗或者其他严重的副作用的信息。此外，明确地搜集并记录任何新的无故肌肉疼痛或无力。每次随访时采集血样用于在中心实验室测定CK和ALT。
在平均6年的随访后，每天分配80mg辛伐他汀的6031名参与者中的49名发生了“明确的”肌病(定义为CK＞10倍ULN的肌肉症状)。另外49名参与者不管是否报告了肌肉症状，基于他们的安全全血分析(即CK＞3倍ULN并＞5倍筛查值，并且ALT＞1.7倍筛查值，但未观察到单纯的ALT升高)被认为具有“初期”肌病。当作出所述诊断时，全部这49名明确病例和49名初期病例中的48名都遵守了他们的每天分配80mg辛伐他汀的方案。相反，在每天分配20mg辛伐他汀的6033名参与者中，只确定了2个明确肌病病例和6个初期肌病病例。
全基因组关联研究被限制在诊断为明确或初期肌病同时每天服用80mg辛伐他汀并可采集到血沉棕黄层样品的96名参与者中。在其余被指定每天服用80mg辛伐他汀的参与者中选出了96名有血沉棕黄层样品的对照，他们的性别、年龄、估算的肾小球滤过率和基线时的胺碘酮使用都与上述96个病例匹配。不清楚这些病例和对照有关系；除一个病例外(其被排除在主体分析之外)，全部病例和对照都将他们自己归类为高加索人。
“SEARCH”中基因分型、测序和归因
将冷冻的血沉棕黄层从牛津的协调中心送至位于法国巴黎的法国基因型中心(CNG)。在CNG将DNA提取出来，通过荧光(Picogreen法)测量其浓度并通过凝胶和2种微卫星标记物的PCR扩增来检测其性质。从96个病例中的85个病例(90％)和在96对照中的90个对照(94％)中获得了足够基因分型的DNA。SNP基因分型用商业发布的Sentrix HumanHap300-Duo BeadChip(Illumina)18进行，其包括一个包含来源于International HapMap资源数据的318237个标签SNP的意图捕获基因组中常见变异(＞5％)的面板。19在全部病例和对照中都成功地获得了＞95％的SNP的基因型，因此没有病例或对照被排除在所述主体分析之外。使用多维标度法20以检测具有不同血统或其他异常值的个体：5个病例集中远离其余病例和对照，表明他们可能具有不同的血统(数据未示出)。考虑到参与者的数量较少以及假设关联的强度，所述参与者(除已知非高加索血统的那个以外)都被保留在主体分析中(但进行灵敏度分析时不包括所述5个病例)。
所述主体分析包括Illumina面板中的318237个SNP中的316184个(99.4％)，不包括1098个在任何样品中都未成功进行基因分型的SNP，139个在此人群中为单态的SNP，813个在＞10％的参与者中丢失的SNP和3个在对照中偏离哈代温伯格平衡(HWE p＜1.6x10-7；Bonferroni校正p＜0.05)的SNP。似乎没有必要对基因组对照校正这些SNP与肌病的关联，其中在检验统计中的超方差由群体子结构所致：21每种SNP的观察值与遵照其期望分布的给定级别的期望值进行比较的卡方分布值，并且在空SNP中所述316184个卡方检验统计的中值除以期望的卡方分布中值没有在统计上偏离1.0(见“结果”部分)。
全基因组分析之后，对具有充足DNA的83个病例和89名对照的SLCO1B1基因中的外显子重新测序：所述病例-对照分析还包括其他38个已基因分型的和141个推定21的具有非零次要等位基因频率的变异(使用HapMap CEU作为参照群体)。所述Illumina面板没有包括CYP3A4基因中的变异，所述基因可能与他汀类药物诱导的肌病有关，因此也在具有充足DNA的54个病例和62名对照中对其进行重新测序：确定的30个变异中有20个(67％)满足病例-对照分析的质量控制入选标准，还包括另外11个推定的SNP。使用由“PRIMER3”产生的PCR扩增子进行SLCO1B1和CYP3A4基因的重新测序以包括全部外显子和部分内含子(SLCO1B1的15个片段和CYP3A4的18个片段)。用于对SLCO1B1基因进行扩增和测序的寡核苷酸示于下表4中。使用1个单位的Taq DNA聚合酶(Abgene，Epsom，UK)和20ng的基因组DNA在8uL反应体积中进行PCR。使用Bio-gel
Figure BPA00001251086400261
P100 Gel(Bio-Rad Inc，Hercules，CA，USA)对PCR产物进行纯化并使用BigDye Terminator循环测序化学方法(Applied Biosystems，Palo Alto，CA，USA)进行测序。先使用SephadexTM G-50 Superfine (Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)对反应物进行纯化，然后再将产物放入ABI 3730 DNA分析仪中。遗传变异的检测用自建软件(Genalys程序，可在http://www.cng.fr上获得)进行。
心脏保护研究的重复实验
在1994年7月和1997年5月之间，随机分配总共20536名已患有闭塞性血管病或糖尿病的英国患者每天接受40mg辛伐他汀或安慰剂，作为所述心脏保护研究(HPS)的一部分22。在每次随访评估(在第4、8和12个月，然后每6个月一次)中，询问参与者有无出现任何新的无故肌肉疼痛或无力，并在每次随访中采集血液以在中心实验室测定CK和ALT。在平均5年随访中，在10269名每天分配40mg辛伐他汀的参与者中确定了24个肌病病例(10个明确病例加14个初期病例；23个在服用他汀类药物)并在10267名分配安慰剂的参与者中确定了12个病例(4个明确病例加8个初期病例；3个在服用他汀类药物)。使用从19856名(97％)参与者中提取的DNA，在16664名高加索人参与者中成功地对SLCO1B1中的rs4149056和rs2306283SNP进行了基因分型。然后评估了这些基因型对肌病危险和LDL胆固醇降低的影响。
统计分析和软件
肌病与基因型和病例-对照比值比的关联的标准d.f.(趋势)和2d.f.(基因型)检验使用SAS和PLINK(v.1.00)通过逻辑回归计算。23对于全基因组比较，小于5x10-7的每种不同SNP的未校正p值被认为是关联的有力证据，而5x10-5和5x10-7之间的未校正p值被认为提供了适中的证据(参见Wellcome Trust病例-对照联合报告中的原理24)。使用Haploview v4.0发布候选版225来估算已基因分型的SNP的连锁不平衡和图表关联结果。使用R(v2.6.1)27的haplo.stats(v1.3.1)package26中的工具估算单倍型频率和相关危险。物理位置参照人类基因组的NCBI 36版本，等位基因在参照人类基因组(NCBI 36版本)的正链中表达。使用Ensembl 46版和NCBI dbSNP 127版本和公布的报告11，28，29将SNP分为同义或不同义的，并确定它们在内含子或外显子中的位置。可归因于每天80mg辛伐他汀的肌病危险通过生命表分析进行估算，其中在死亡或在研究终止时要先检查辛伐他汀处方，然后才能认为肌病与基因型无关。基线时使用胺碘酮的参与者被排除在此分析之外，因为他们的辛伐他汀剂量在试验早期(主要在随访的第一年中)就因肌病的高危险而被减少。
结果
参与者的特征
如之前已在“SEARCH”研究30中观察到的，胺碘酮的同时使用增加了每天分配80mg辛伐他汀的参与者的肌病危险，在随访的第一年中相对危险为8.8(95％CI为4.2-18.4)。在试验早期检测到此关联后，对所有服用胺碘酮的参与者每天给予20mg辛伐他汀(而不管他们最初的分配)，这可解释随后观察到的低得多的相对危险。在年龄较大的参与者中，在女性参与者(她们由于要求以前得过心肌梗塞的试验准入标准而有年龄较大的趋势)中，在有证据表明肾功能受损的参与者中和在基线时服用钙离子通道抑制剂的参与者中，观察到每天服用80mg辛伐他汀的肌病危险有些许增加。
全基因组关联研究
全基因组关联研究包括85个疑似肌病病例和90名对照，他们所有人都在“SEARCH”中每天服用80mg辛伐他汀。单个SNP分析得到位于染色体12上的SLCO1B1基因的内含子11-12内的非编码rs4363657 SNP(在任何其他区中都没有SNP得到未校正的p＜10-5：图1)的肌病强关联性(未校正的p＝4×10-9，Bonferroni校正的p＜0.001)。对照中rs4363657 C等位基因的频率为0.13，每个C等位基因的肌病比值比为4.3(95％CI 2.5-7.2)，CC相对于TT纯合子的肌病比值比为17.4(4.8-62.9)。
几乎没有偏离Hardy-Weinberg平衡的证据。所述结果似乎未受到群体子结构或系统偏离的其他可能来源的实质影响：rs4363657的卡方分布值完全在分位数-分位数图的95％置信区间之外，而所有其他已基因分型的SNP的值都在此置信区间之内(图2)。
候选基因分型和单倍型分析
鉴于肌病与rs4363657的这种强关联，对SLCO1B1(+/-10kb)内的其他SNP通过重新测序进行了基因分型或者从已基因分型的SNP进行了推定。在这些SNP中，两种已基因分型的(和9种推定的)SNP与rs4363657几乎完全连锁不平衡(每种r2都＞0.95)。然而，在它们中间，只有外显子6中的rs4149056(Val174Ala)为“非同义的”(即改变了编码的蛋白)：对照中其C等位基因的频率为0.13，每个C等位基因的肌病比值比为4.5(2.6-7.7)，CC相对于TT纯合子的肌病比值比为16.9(4.7-61.1)(p＝2x10-9；4个缺少的结果被推定)。这些结果总括于下表2中。
Figure BPA00001251086400281
Figure BPA00001251086400291
表2：单核苷酸多态性与肌病强关联。
在SLCO1B1内发现了5种其他非同义变异，其中3种相对常见：rs2306283(对照中44％的G等位基因频率)、rs11045819(18％的A等位基因频率)和rs34671512(8％的C等位基因频率)。在rs4149056和这3种变异之间只存在中度连锁不平衡(每对r2＜0.20)。在rs4149056的单倍型中，rs2306283G等位基因和rs34671512C等位基因都与肌病的低危险具有临界显著的关联(p分别＝0.03和＝0.06)，因此可提供关于肌病危险独立信息，而rs11045819似乎不影响肌病危险。
rs4149056的子群发现结果
图3示出了与rs4149056关联的肌病的比值比与在明确和初期肌病病例中或在根据年龄、性别、估算的肾小球功能或基线时使用胺碘酮划分的子群中并无显著不同(尽管检测中等区别的能力有限)。如果是那样的话，那么这暗示着所述基因型和这些其他因素(尤其是胺碘酮的使用)对肌病危险的影响是乘法关系(例如rs4149056的杂合子的4倍增加和同时使用胺碘酮的10倍增加会产生肌病危险的40倍增加)。使用多维标度法以检测具有不同血统或其他异常值的个体20：排除似乎集中远离其余病例和对照的4名参与者只使rs4149056的p值从2.4x10-9变为2.0x10-9(并且未改变被认为具有强显著性的基因组区)。
可归因的肌病危险
对照是基于未患肌病而选择的，因此他们具有高危rs4149056等位基因的可能性较小。在考虑到这一选择偏倚后，C等位基因的群体频率被估算为0.146(与之前在高加索人中发现的0.14-0.22的范围一致28)。基于此频率，使用生命表分析以根据rs4149056基因型来估算每天服用80mg辛伐他汀的参与者中的累积肌病危险(表4)。CC纯合子具有18％累积危险，其主要出现在第一年中，而CT基因型与约3％的累积危险有关联。相比之下，服用80mg辛伐他汀的TT纯合子中的肌病累积危险只有0.6％。总的来说，这些肌病病例中超过60％可归因于SLCO1B1基因中的rs4149056C变异。这些数据总括于下表3中。
Figure BPA00001251086400301
Figure BPA00001251086400302
表3.基因型所致的肌病累积数量和百分比。
心脏保护研究的重复实验
在HPS22中的16664名已基因分型的参与者中，rs4149056和rs2306283变异与预处理LDL胆固醇水平的显著区别没有关联。随机化之前，所有这些参与者每天服用40mg辛伐他汀达4-6周，LDL胆固醇平均降低40.57％(SE 0.12)。当将这两种变异一起考虑时，对于每个rs4149056C等位基因，所述降低减小1.28％(0.25)(p＜0.0001)，对于每个rs2306283G等位基因，所述降低增大0.62％(0.18)(p＜0.0001)。在整个HPS中，在每天服用40mg辛伐他汀的参与者中有23个明确的或初期的肌病病例，而在未服用他汀类药物的配给安慰剂的参与者中有9个病例。因此，与所述“SEARCH”研究相比，在HPS中服用辛伐他汀的参与者中只有约一半的肌病病例可能是由他汀类药物引起的。即使如此，在HPS(限于高加索人)中在服用40mg辛伐他汀的21个肌病病例与16643名无肌病的已基因分型的对照的比较证实了rs4149056SNP与肌病关联(p＝0.004)，尽管每个C等位基因具有2.6(1.3-5.0)的极值更小的相对危险。这17000名无肌病的已基因分型的参与者还为“SEARCH”病例提供了其他对照人群，得到每个rs4149056C等位基因的4.7(3.5-6.4)的比值比和更强的3x10-28的p值。
与之前研究的比较
尚无之前公布的研究就遗传变异与他汀类药物诱导的肌病关联提供统计学上无可置疑的证据。在对10个肌病病例和26个对照中进行的8个候选基因的研究报道了与SLCO1B1SNP的关联，15但那些结果在对多重比较进行校正后在统计上并不可靠。在本研究中，没有发现与在任何其他之前已报道与肌病或与他汀类药物药代动力学关联的基因(4中的补充表2、4和5)中的SNP有显著关联。具体地，CYP3A4基因(其参与辛伐他汀消除13)中20个已基因分型的和11个推定的SNP与肌病没有明显关联(4中的补充表2b)。已有报道，遗传测试涉及的他汀类药物诱导的肌病病例的10％患有三种先天代谢肌病(McArdle氏病、肉毒碱棕榈酰基转移酶II缺乏症或肌腺苷酸脱氨酶缺乏症)之一或为其携带者。31然而，在本研究中，肌病与那些基因中的SNP没有明显关联。
讨论
“SEARCH”和心脏保护研究提供了非常有力的证据，证明SLCO1B1中的至少一种常见遗传变异实质地改变了发生他汀类药物诱导的肌病的危险。在每天服用20-40mg辛伐他汀(或标准剂量的其他他汀类药物)的患者中，患者每年的肌病发生率通常只为约1/10000，3并且这些基因变异对肌病的绝对危险的影响似乎较小(如本发明人在HPS参与者中获得的结果所表明的)。相比之下，每天80mg辛伐他汀或其他高剂量他汀类药物治疗方案，以及某些药物(例如环孢霉素、吉非贝齐以及如在“SEARCH”中所发现的胺碘酮30)的同时使用可使肌病的危险增加10倍31。因此，在具有rs4149056多态性的C等位基因并采用高剂量他汀类药物治疗方案的人中使用这些药物可产生特别高的绝对肌病危险(如图3中rs4149056基因型和胺碘酮使用的近似乘法效应所表明的)。
SLCO1B1编码有机阴离子转运多肽OATP1B1，其介导包括大多数他汀类药物和他汀酸在内的多种药物的肝摄取。若干小型临床研究已考察了rs4149056 SLCO1B1基因型和他汀类药物消除的药代动力学之间的关联(通常包括在单次常规剂量给药后的24小时中对他汀类药物血液水平的测量)。尽管不是全部所述研究都得到了统计学上显著的结果，然而收集的证据表明，在具有此多态性的C等位基因的人中他汀类药物水平更高。所述研究中的5项研究还检测了rs4149056和rs2306283的单倍型，并且，综合来看，所述研究表明rs2306283G变异与较低的他汀类药物浓度关联(数据未示出)，这与在“SEARCH”研究中观察到的较低的肌病危险一致。减慢肝摄取的遗传变异也可预期降低他汀类药物治疗方案的降胆固醇作用。我们从心脏保护研究的参与者获得的数据证实了这些变异的确在辛伐他汀产生的LDL胆固醇降低上造成了微小区别。22
由HapMap CEU样品估算Illumina HumanHap300-Duo面板对高加索人中的常见SNP提供约75％的基因组覆盖(r2≥0.8)。考虑到病例和对照的数量，本发明的全基因组关联研究只有约50％的能力来以5x10-7的“强显著性”p值对常见变异检测约4的比值比。因此，具有2-4倍高的肌病危险的变异的存在不能被此分析排除。之前被证明与肌病或他汀类药物的药代动力学有联系的基因可被看做“候选基因”，所述候选基因要求程度更低的未校正p值来提供关联的良好证据。4中的补充表5列出了约100种这类SNP，其为基因组筛查的约1/3000；因此对于这些候选基因，1.5x10-3(即5x10-7的3000倍)的p值可被认为是“显著”的。然而，对于在这些区域中所研究的SNP中的任一个，都没有达到所述p值。
总之，这一全基因组关联研究已经成功地识别了与辛伐他汀引起的肌病危险的实质改变关联的SLCO1B1基因中的常见遗传变异。这些发现似乎也适用于其他他汀类药物，因为肌病是一种类效应并且SLCO1B1多态性已被证明影响若干种他汀类药物的血液水平。此外，这些变异还可关系到由SLCO1B1转运的其他类别药物(例如口服降血糖药瑞格列奈)的作用。SLCO1B1多态性的基因分型提供了定制他汀类药物剂量和安全性监测的范围(尤其是在肌病绝对危险最大的治疗第一年中)，从而在将来更安全和更有效地实现他汀类药物治疗的益处。
Figure BPA00001251086400331
Figure BPA00001251086400341
Figure BPA00001251086400351
表4：用于对SLCO1B1基因重新测序的寡核苷酸
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Claims (16)

1.一种确定个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的方法，包括检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性，其中一种或多种多态性的存在表明该个体对他汀类药物引起的肌病的易感性发生了改变。
2.一种降低个体在用他汀类药物治疗过程中发生肌病风险的方法，包括：
i)检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性；
ii)参照在步骤i)中所检测的是否存在所述一种或多种多态性，根据个体对他汀类药物引起的肌病的易感性将个体分类；和
iii)参照在步骤ii)中所确定的个体对他汀类药物引起的肌病的易感性，确定他汀类药物治疗的合适剂量。
3.权利要求1或2的方法，其中所述一种或多种多态性选自SNP rs4149056和/或与rs4149056紧密连锁的多态性。
4.权利要求3的方法，其中所述方法包括测定：对于在rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)，所述个体具有纯合的还是杂合的基因型。
5.权利要求3的方法，其中所述一种或多种与rs4149056紧密连锁的多态性选自rs4363657、rs1871395、rs12317268、rs2900478、rs4149100、rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881和rs12366582。
6.一种为需要用他汀类药物进行治疗的个体确定合适剂量的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的；和
ii)参照所述一种或多种多态性的基因型确定他汀类药物治疗的合适剂量，其中他汀类药物的标准剂量适于具有杂合或纯合的高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合低危基因型的个体。
7.一种对需要用他汀类药物治疗的个体进行治疗的方法，包括：
i)测定个体的生物学样品中SLCO1B1基因中的一种或多种多态性的个体基因型是杂合还是纯合的；
ii)根据在步骤i)中测定的在所述一种或多种多态性处的个体基因型将个体分类；和
iii)给予一个剂量的他汀类药物，其中他汀类药物的标准剂量适于具有杂合或纯合高危基因型的个体，而更高剂量适于具有纯合低危基因型的个体。
8.权利要求6或7的方法，其中所述一种或多种多态性选自SNP rs4149056和/或与rs4149056紧密连锁的多态性。
9.权利要求8的方法，其中所述方法包括测定：对于在rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)，所述个体具有纯合的还是杂合的基因型。
10.权利要求8的方法，其中所述一种或多种与rs4149056紧密连锁的多态性选自rs4363657、rs1871395、rs12317268、rs2900478、rs4149100、rs4149081、rs11045879、rs7969341、rs11045885、rs12369881和rs12366582。
11.权利要求6-9任一项的方法，其中所述一种或多种多态性为SNP rs4149056，并且其中他汀类药物的标准剂量适于具有CC或TC基因型的个体，而更高剂量适于具有TT基因型的个体。
12.权利要求11的方法，其中所述他汀类药物为辛伐他汀，并且其中标准剂量为每天20或40mg，更高剂量为每天80mg。
13.权利要求6-12任一项的方法，其中所述个体由于同时使用减慢他汀类药物清除的药物或者由于因遗传变异或疾病造成的他汀类药物的肝摄取或肾清除下降而具有增加的发生肌病的危险。
14.一种用于筛查个体对他汀类药物引起的肌病的易感性的体外诊断试剂盒，包含一种或多种用于检测个体的生物学样品中的SLCO1B1基因中是否存在一种或多种多态性的试剂。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述一种或多种试剂包括能够测定个体在SNP rs4149056处的胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的基因型是杂合还是纯合的等位基因特异性扩增引物和/或等位基因特异性探针。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述试剂盒包含使用说明，所述说明参照所述个体的rs4149056基因型限定他汀类药物治疗的合适剂量，其中他汀类药物的标准剂量适于具有CC或TC基因型的个体，而更高剂量适于具有TT基因型的个体。
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