CN102016047B - 生产含二硫键的蛋白质的宿主细胞和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，所述细胞具有降低的细胞质还原酶活性，例如降低的TrxA活性，以及编码异源葡萄球菌氧化酶的核酸。本发明还提供了使用本发明的宿主细胞生产含二硫键的蛋白质的方法，以及使用本发明的宿主细胞改进蛋白质折叠的方法。

Description

生产含二硫键的蛋白质的宿主细胞和方法

发明领域

本发明提供了遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，所述细胞具有降低的细胞质还原酶活性，例如降低的TrxA活性，以及编码异源氧化酶，例如葡萄球菌氧化酶的核酸。本发明还提供了使用本发明的宿主细胞生产含二硫键的蛋白质的方法，以及使用本发明的宿主细胞改进此类含二硫键的蛋白质折叠的方法。

背景

二硫键对自然界发现的大量蛋白质的正确折叠、结构完整性和活性是关键的。在缺少将其半胱氨酸连接至二硫键的正确氧化条件下，这些蛋白质将既不完全稳定，也无生物学活性。重要的是，具有生物药学重要性的许多真核生物蛋白含有多个二硫键。其中包括人胰岛素、胰岛素样生长因子、人生长激素、脑衍生神经营养因子、神经生长因子、脂肪酶、Bowman-Birk蛋白酶抑制剂和抗体片段。

二硫键的形成可以自发产生，但该过程是非常缓慢和非特异的。出于上述理由，进化出了催化二硫键在体内形成(氧化)的酶。这类酶属于硫醇-二硫化物氧化还原酶(TDOR)类。该类酶也含有断裂(还原)或异构化二硫键的酶。细胞质的TDOR通常发挥还原酶的功能，而其胞质外的等同酶则是氧化酶或异构酶(Dorenbos等人，(2005)p.237-269.In S.G.Pandalai(编著)，Recent Res.Devel.Microbiology 9.Research Signpost，Kerala，India；Ritz等人，Annu.Rev.Microbiol.55：21-48.，2001；Tan等人，Chembiochem.5：1479-1487，2004)。酶依赖性的二硫键形成实际上是为何使用细菌细胞工厂仍然难以大量生产含此类键的蛋白质的主要原因。在细菌细胞工厂中，过量生产的蛋白质缓慢和/或非特异的氧化可以导致这类蛋白质缓慢和/或错误的折叠，使其易于被蛋白水解降解，并可能使其失活，除非在体外进一步加工这类蛋白质成为正确折叠的或活性产物。

以前对枯草芽孢杆菌中二硫键形成的研究显示，该生物含有至少4种具有推测的氧化酶活性的TDOR。这类蛋白质称为Bdb(芽孢杆菌二硫键)蛋白，注释为BdbA-D。bdbA和bdbB基因位于SPβ原噬菌体区域，因此只存在于测序的枯草芽孢杆菌菌株168中。已经鉴别了BdbB、BdbC和BdbD的生物学功能，但未鉴别BdbA的生物学功能。发现Bdb的功能是模块化的，即不同的Bdb蛋白可以合作执行不同的功能(Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999)。整合膜蛋白BdbB与BdbC共享了高度的序列相似性，且对编码分泌性SPβ的羊毛硫抗生素sublancin 168的折叠是非常重要的，所述羊毛硫抗生素sublancin 168含有两个二硫键(Bolhuis等人，J.Biol.Chem.274：24531-24538，1999；Dorenbos等人，J.Biol.Chem.277：16682-16688，2002；Stein，Mol.Microbiol.56：845-857，2005)。相反，BdbC和BdbD对类纤毛蛋白(pseudopilin)ComGC的生物发生是非常重要的，且对于该过程，BdbB是非必需的(Meima，J.Biol.Chem.277：6994-7001，2002)。ComGC是枯草芽孢杆菌的DNA摄入机器的重要因子，与其折叠成蛋白酶抗性构象所需要的TDOR一致，ComGC含有一个关键性的分子内二硫键(Chung等人，Mol.Microbiol.29：905-913，1998)。枯草芽孢杆菌的分泌性异源蛋白质的折叠也需要BdbC和BdbD，即大肠杆菌的碱性磷酸酶PhoA(Bolhuis等人，J.Biol.Chem.274：24531-24538，1999；Darmon等人，Appl.Environ.Microbiol 72：6876-6885，2006；Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999.2007；Meima等人，J.Biol.Chem.277：6994-7001，2002)。该TDOR需求涉及以下事实，即大肠杆菌PhoA含有2个二硫键，它们对该蛋白质的酶促活性和稳定性都是不可或缺的(Sone等人，J.Biol.Chem.272：6174-6178，1997)。综上所述，上述以前的观察结果表明，组合的BdbA-D蛋白提供了含有同源和异源二硫键的蛋白质在枯草芽孢杆菌中折叠的基本机制。

芽孢杆菌生物还含有硫氧还蛋白，这是小的、热稳定的、独特的TDOR，它们涉及多种不同的过程，范围涵盖从酶激活到线粒体依赖性细胞凋亡(Tanaka等人，EMBO J.21：1695-1703，2002)。在催化过程中，其CxxC活性位点的半胱氨酸残基经历了可逆的氧化-还原反应。在细菌细胞质中，硫氧还蛋白通常以还原态存在，从而防止细胞质蛋白形成二硫键。

已报道，在枯草芽孢杆菌的氧化途径中，BdbB和BdbC作为氧化还原对而协作(Sarvas等人，Biochim.Biophys.Acta 1694：311-327，2004)。因此，假设BdbD作为含半胱氨酸的分泌性蛋白质的主要氧化酶发挥作用，从而有利于二硫键的形成。之后，可以由醌还原酶同源物BdbC再氧化已还原的BdbD。为了在下一次催化反应中成为再氧化的，BdbC然后在电子传递链中将它的电子供给至醌。该系统类似大肠杆菌的DsbA和DsbB氧化还原对(Inaba等人，Cell 127：789-801，2006；Regeimbal等人，J.Biol.Chem.277：32706-32713，2002；Rietsch & Beckwith.Annu.Rev.Genet.32：163-184，1998)。虽然存在四种Bdb蛋白，但是枯草芽孢杆菌的总氧化能力是相当有限的。在增加巯基氧化能力的尝试中，已尝试了过表达单个或Bdb蛋白的组合。然而，并未获得具有二硫键的蛋白质的显著提高的产量(Darmon等人，Appl.Environ.Microbiol.72：6876-6885，2006；Dorenbos等人，J.Biol.Chem.277：16682-16688，2002；Meima等人，J.Biol.Chem.277：6994-7001，2002)。

另外，已经报道宿主细胞(例如，细菌)表现出相对低下的生产具有二硫键蛋白质的性能(Braun等人，Curr.Opin.Biotechnol.10：376-381，1999；Anfinsen，Science 181：223-230，1973；Westers等人，Biochim.Biophys.Acta1694：299-310，2004)。

发明概述

本发明通常涉及增加宿主细胞(例如，枯草芽孢杆菌)的巯基氧化能力的策略。

为了增加宿主细胞内氧化酶的水平，本发明提供了有降低水平的具有还原酶活性的TDOR的宿主细胞，所述TDOR例如硫氧还蛋白(例如，主要的细胞质二硫键还原酶TrxA)。本文给出的数据证实，该硫氧还蛋白活性的降低导致了分泌性大肠杆菌PhoA(一种含二硫键的蛋白质)产量的增加，而对不合二硫键的蛋白质的产量没有影响。此外，通过引入编码葡萄球菌DsbA多肽的核酸，可以提高含二硫键的蛋白质的产量，已知所述多肽是最强的细菌巯基氧化酶之一(Dumoulin等人，Arch.Microbiol.184：117-128，2005)。本发明还提供了通过向这些宿主细胞的生长培养基中添加氧化还原活性的化合物，增加含二硫键的蛋白质的产量。

本文描述的数据显示了开发用于增加在芽孢杆菌中含二硫键的蛋白质的产量的方法。增加的产量可以通过以下方式实现：(1)缺失芽孢杆菌宿主细胞中的TrxA多肽；和/或(2)在芽孢杆菌宿主细胞中共表达葡萄球菌巯基氧化酶(例如，DsbA多肽)和待生产的含二硫键的蛋白质；和/或(3)使用补充了氧化还原活性的化合物的生长培养基，例如半胱氨酸；和(4)上述三种方法的组合。通过组合使用上述三种方法以从大肠杆菌优化分泌含二硫键的PhoA蛋白获得了概念性证据。这导致生长培养基中活性PhoA蛋白的量增加约3.5倍。

本文给出的数据证实，金黄色葡萄球菌(S.aureus)的强氧化酶DsbA和大肠杆菌PhoA的共表达显示出导致增加的活性PhoA分泌。特别是，在枯草芽孢杆菌中与金黄色葡萄球菌或肉葡萄球菌的DsbA蛋白共表达，获得了较高水平的活性胞外PhoA蛋白。此外，与特定肉葡萄球菌DsbA的共表达导致较低的PhoA降解和增加的原-PhoA加工中间物的积累。这表明葡萄球菌DsbA蛋白的存在有利于PhoA更有效的折叠，最可能是通过增加巯基氧化作用。在这一方面，金黄色葡萄球菌和肉葡萄球菌的DsbA似乎同样有效，但使用肉葡萄球菌DsbA具有明显的优点，即它来自具有GRAS状态的食品级生物，如枯草芽孢杆菌。因此，对于生物技术应用中的芽孢杆菌细胞工厂的改善，来自非致病性葡萄球菌的DsbA是优选的巯基氧化酶。

本发明提供了遗传修饰的宿主细胞，例如芽孢杆菌宿主细胞，可用于生产含二硫键的蛋白质，其中宿主细胞(i)具有这样的遗传修饰，所述遗传修饰降低或缺失了宿主细胞的细胞质还原酶的活性或细胞表达，和/或ii)包含编码异源氧化酶(例如葡萄球菌氧化酶)或其保留了氧化酶活性的突变体的核酸。可以进一步修饰此类遗传修饰的宿主细胞，使其包括编码含二硫键的异源蛋白质的核酸。本发明的遗传修饰的宿主细胞可以是任何类型。然而，优选的宿主细胞是芽孢杆菌宿主细胞，例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或Bacillus alodurans。在一个实施方案中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌。遗传修饰的宿主细胞包含降低细胞质还原酶活性的遗传修饰。该遗传修饰可以是在编码细胞质还原酶的基因中或在表达控制区(例如，启动子)中的缺失突变、取代突变或插入突变。本发明还提供了宿主细胞，其中遗传修饰是插入诱导型启动子来控制基因表达。在一些实施方案中，细胞质还原酶活性的降低是细胞质还原酶多肽表达降低(即，缺失)的结果，而在其他实施方案中，活性的降低是表达失活的细胞质还原酶多肽的结果，或者是细胞质还原酶增加的降解的结果，或者是细胞质还原酶抑制剂增加的表达的结果。细胞质还原酶可以是宿主细胞中有活性的任何细胞质还原酶。在示例性的实施方案中，细胞质还原酶是巯基-二硫键还原酶，例如，TrxA、TrxC、YbdE、YdbP、YdfQ、YkuV、YosR、YtpP、YusE、BdbA、ResA、StoA、SpoIVH或YneN。在另一个实施方案中，细胞质还原酶是谷氧还蛋白，例如GrxA、GrxB或GrxC，或谷胱甘肽氧化还原酶，例如Gor。在一些实施方案中，宿主细胞的具有降低活性的细胞质还原酶是TrxA多肽，包括来自其它细菌的同源物，或其保留了还原酶活性的突变体。TrxA多肽可以包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或表1列举的任何氨基酸序列；由SEQ ID NO：1的核酸序列或表1列举的任何核酸序列编码的氨基酸序列；与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与表1列举的任何氨基酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：1的核酸序列或与表1列举的任何核酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，和由在严谨条件下与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞表达的异源氧化酶是葡萄球菌氧化酶。优选的葡萄球菌氧化酶来自非致病性葡萄球菌细菌，例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)。编码异源氧化酶的核酸序列可以是质粒或表达载体，其通过转化、转染或感染引入到宿主细胞中。在一些实施方案中，异源氧化酶是葡萄球菌的DsbA多肽，包括来自其它细菌的同源物，或保留了还原酶活性的突变体。DsbA多肽可以包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或表2列举的任何氨基酸序列；由SEQ ID NO：3的核酸序列或表2列举的任何核酸序列编码的氨基酸序列；与SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与表2列举的任何氨基酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：3的核酸序列或与表2列举的任何核酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，和由在严谨条件下与SEQ ID NO：3的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。

本发明还提供了上述遗传修饰的宿主细胞的培养物。在一个实施方案中，培养物生长在含有氧化还原活性化合物的培养基中。在示例性的实施方案中，氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇(mycothiol)。

本发明还提供了遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，例如枯草芽孢杆菌，其包含降低宿主细胞中TrxA多肽活性的遗传修饰，其中TrxA多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和编码异源非致病性葡萄球菌DsbA多肽的核酸序列，其中DsbA多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

本发明还提供了生产含二硫键的蛋白质的方法，包括在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长任一种上述本发明的遗传修饰的宿主细胞，其中遗传修饰的宿主细胞生产含二硫键的蛋白质并将蛋白质分泌到培养基中，并任选地，从培养基中分离此类含二硫键的蛋白质。在示例性的实施方案中，氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。在一些实施方案中，宿主细胞不分泌蛋白质，从细胞中分离蛋白质。

本发明还提供了在芽孢杆菌宿主细胞(例如，枯草芽孢杆菌)中生产含二硫键的蛋白质的方法，包括遗传修饰宿主细胞以降低宿主细胞中细胞质还原酶的活性，将编码异源葡萄球菌氧化酶，或其保留氧化酶活性的突变体的核酸序列引入宿主细胞中，其中氧化酶来自非致病性葡萄球菌细菌，和在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长宿主细胞，其中宿主细胞生产含二硫键的蛋白质并将蛋白质分泌到培养基中。可以用本发明的任何宿主细胞进行这些方法。在一些实施方案中，宿主细胞不分泌蛋白质，从细胞中分离蛋白质。在一些实施方案中，在遗传修饰的宿主细胞中活性降低了的细胞质还原酶是TrxA细胞质还原酶的活性，包括来自其它细菌的同源物，或保留了还原酶活性的突变体。TrxA多肽可以包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸序列或表1列举的任何氨基酸序列；由SEQID NO：1的核酸序列或表1列举的任何核酸序列编码的氨基酸序列；与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与表1列举的任何氨基酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：1的核酸序列，或与表1列举的任何核酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，和由在严谨条件下与SEQID NO：1的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。通过在细胞质还原酶基因中突变导致细胞质还原酶活性降低。例如，缺失突变、取代突变和插入突变是在细胞质还原酶基因中产生的、导致还原酶活性降低的突变的实例。在一些实施方案中，由诱导型启动子控制降低的还原酶活性。在一些实施方案中，将异源葡萄球菌氧化酶，或其保留了氧化酶活性的突变体，通过用包含编码氧化酶的核酸序列的质粒转化宿主细胞而引入宿主细胞中。优选地，葡萄球菌氧化酶来自非致病性葡萄球菌的细菌，例如，肉葡萄球菌。氧化酶可以是任何氧化酶，例如BdbA、DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DipZ、DsbE、CcmG、DsbG、BdbB、BdbC或BdbD。在一些实施方案中，异源氧化酶是葡萄球菌的DsbA多肽，包括来自其它细菌的同源物，或保留了还原酶活性的突变体。DsbA多肽可以包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或表2列举的任何氨基酸序列；由SEQ ID NO：3的核酸序列或表2列举的任何核酸序列编码的氨基酸序列；与SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与表2列举的任何氨基酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：3的核酸序列，或与表2列举的任何核酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，和由在严谨条件下与SEQ ID NO：3的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。可以执行上述方法，其中宿主细胞生长在含有氧化还原化合物的培养基中。在示例性的实施方案中，氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。在一个实施方案中，本发明提供了在遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞中生产含二硫键的蛋白质的方法，所述芽孢杆菌宿主细胞表现出(a)在宿主细胞中TrxA多肽的表达降低，其中TrxA多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和/或(b)在宿主细胞中异源的葡萄球菌DsbA多肽的增加的表达，其中DsbA多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，此类方法包括在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长宿主细胞，并任选地从培养基中分离含二硫键的蛋白质，其中宿主细胞生产含二硫键的蛋白质并将蛋白质分泌到培养基中。此类方法包括改进重组蛋白折叠，或增加活性重组蛋白产量的方法，例如，至少约2倍、3倍、4倍、5倍或更高的产量。在一些实施方案中，宿主细胞不分泌蛋白质，从细胞中分离蛋白质。

本发明还提供了改进重组蛋白折叠，或增加活性重组蛋白产量的方法。此类方法可以包括上述的方法，其中活性重组蛋白是含二硫键的蛋白质，而遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞(例如，如上文所述)生长在允许含二硫键的蛋白质表达并改进正确折叠的条件下。然后，可以任选的从培养基中分离所述蛋白质。该方面的方法可以包括：在允许活性含二硫键的蛋白质表达并提高其产量的条件下，在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，例如，枯草芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞(i)表现出降低的细胞质还原酶活性，和/或(ii)表现出异源葡萄球菌氧化酶或其保留了氧化酶活性的突变体的增加的表达，和/或(iii)分泌异源的含二硫键的蛋白质；以及任选的，从培养基中分离所述蛋白质。可以用本发明的任何宿主细胞实施该方法。可以通过检测活性重组含二硫键的蛋白质的更高产量(例如，更高的mg活性蛋白质/升细胞培养物，或更高的重组蛋白质活性/升细胞培养物)，来确定正确蛋白质折叠的改进，例如，相对于未修饰的宿主细胞在未补充氧化还原活性化合物的培养基中的产量，至少约2倍、3倍、4倍、5倍或更高的产量。在一些实施方案中，具有降低活性的宿主细胞的细胞质还原酶是TrxA多肽，包括来自其它细菌的同源物，或其保留了还原酶活性的突变体。TrxA多肽可以包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或表1列举的任何氨基酸序列；由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的氨基酸序列，或表1列举的任何核酸序列；与SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与表1列举的任何氨基酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：1的核酸序列，或与表1列举的任何核酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，和由在严谨条件下与SEQ IDNO：1的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。通过在细胞质还原酶基因中突变导致细胞质还原酶活性的降低。例如，缺失突变、取代突变和插入突变是在细胞质还原酶基因中产生的以导致还原酶活性降低的突变的实例。在一些实施方案中，由诱导型启动子控制降低的还原酶活性。在一些实施方案中，将异源葡萄球菌氧化酶，或其保留了氧化酶活性的突变体通过用包含编码氧化酶的基因的质粒转化宿主细胞而引入宿主细胞中。优选地，葡萄球菌氧化酶来自非致病性葡萄球菌细菌，例如，肉葡萄球菌。氧化酶可以是任何氧化酶，例如BdbA、DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DipZ、DsbE、CcmG、DsbG、BdbB、BdbC或BdbD。在一些实施方案中，异源氧化酶是葡萄球菌的DsbA多肽，包括来自其它细菌的同源物，或其保留了还原酶活性的突变体。DsbA多肽可以包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：4的氨基酸序列，或表2列举的任何氨基酸序列；由SEQ ID NO：3的核酸序列，或表2列举的任何核酸序列编码的氨基酸序列；与SEQ IDNO：4的氨基酸序列，或与表2列举的任何氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；由与SEQ ID NO：3的核酸序列，或与表2列举的任何核酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列，和由在严谨条件下与SEQ ID NO：3的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。可以实施上述方法，其中宿主细胞生长在含有氧化还原活性化合物的培养基中。在示例性的实施方案中，氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。

附图简述

图1描述了枯草芽孢杆菌的硫氧还蛋白样蛋白质之间的序列关系。蛋白质之间的箭头表示使用其它蛋白质作为查询序列，对箭头指示的蛋白质的BlastP的阳性鉴定。指示了具有跨膜(TM)片段的蛋白质。

图2描述了通过碱性磷酸酶活性测定，测量的枯草芽孢杆菌ItrxA的PhoA的BdbC-依赖性分泌。

图3描述了通过碱性磷酸酶活性测定，测量改造的枯草芽孢杆菌菌株的大肠杆菌PhoA产量增加。用pPSPhoA5转化枯草芽孢杆菌ItrxA、X-SadsbA、ItrxA X-SadsbA、X-ScdsbA和ItrxA X-SadsbA菌株，或亲本菌株168(PhoA)，进行大肠杆菌PhoA生产。所有菌株和亲本菌株168(168)在含有0.5％木糖(白色条形)和额外的100mg/ml胱氨酸(灰色条形)或半胱氨酸(黑色条形)的LB培养基中生长过夜。

详述

本发明提供了遗传修饰的宿主细胞，和使用这类宿主细胞生产含二硫键的蛋白质，以及改进重组蛋白质折叠的方法。本发明的宿主细胞包含降低细胞质还原酶活性，并表达异源的氧化酶多肽的遗传修饰。本发明的宿主细胞还可以包含异源的含二硫键的蛋白质。本发明还提供了通过向宿主细胞的生物培养基中添加氧化还原活性化合物，实现生产活性含二硫键的蛋白质的改进方法。

在前述研究中，探讨了膜结合的TDOR在大肠杆菌PhoA分泌中的角色，该分析证实BdbC和BdbD对防止跨膜转运的PhoA的降解是重要的(Bolhuis等人，J.Biol.Chem.274：24531-24538，1999；Meima等人，J.Biol.Chem.277：6994-7001，2002)。这些研究还揭示，尽管有BdbCD的PhoA折叠活性，仍有大量的转运的PhoA被降解了(Darmon等人，Appl.Environ.Microbiol.72：6876-6885，2006；Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)。这可能是由于枯草芽孢杆菌形成二硫键的有限能力(Sarvas等人，Biochim.Biophys.Acta 1694：311-327，2004)。当时，研究不包括细胞质TDOR，因为通常认为它们发挥巯基还原酶而非巯基氧化酶的功能，可以有利于PhoA的折叠。本文描述的数据证实了如何可以增加枯草芽孢杆菌的巯基氧化能力。降低细胞质TDOR的细胞水平可以降低巯基还原能力，同时增加氧化能力。显著地，在测试的枯草芽孢杆菌的10种硫氧还蛋白样蛋白质中，只有1种显著影响PhoA的分泌。这是基本的硫氧还蛋白TrxA。然而，该数据不能排除其他硫氧还蛋白样蛋白质在本发明中的作用。本文提供的数据表明，TrxA对抗分泌性活性PhoA的生产，最可能是由于它在细胞质中通常的巯基还原酶功能。

本文描述的数据证实枯草芽孢杆菌中缺失TrxA导致约1.5-2倍增加的胞外水平的大肠杆菌PhoA。该TrxA缺失的影响似乎对含二硫键的蛋白质PhoA是特异的，因为在上述条件下，不合二硫键的AmyQ和所有其他可以通过1D或2D PAGE检测的分泌性枯草芽孢杆菌蛋白质的分泌都不受影响(参见实施例2)。实际上，增加的PhoA水平与PhoA降解产物的消失和培养基中不完全加工的原-PhoA的出现是同时发生的。这表明TrxA缺失时改进了PhoA折叠。之前DNA阵列分析的结果显示，TrxA缺失不影响枯草芽孢杆菌的主要分泌机器组分或蛋白酶的任何已知基因的表达(Smits等人，J.Bacteriol.187：3921-3930，2005)。综上所述，这些发现表明TrxA影响特异性涉及PhoA分泌的分泌机器组分的活性(但不影响它们的量)。确实，TrxA显示出具有对细胞质外巯基-二硫键氧化还原酶BdbD的氧化还原状态的重要影响，因为TrxA缺失导致氧化的BdbD分子的增加的细胞水平。这些观察结果表明作为TrxA缺失的结果，细胞质还原能力减小，导致增加水平的氧化的BdbD分子。因此，TrxA缺失具有bdbC突变相反的影响，导致强烈降低的PhoA折叠(Bolhuis等人，J.Biol.Chem.274：24531-24538，1999)，和与此同时，显著增加的还原BdbD水平。值得一提的是，TrxA-缺失的细胞增加的PhoA分泌仍然依赖于BdbC的存在。因此，似乎是TrxA缺失细胞中增加的氧化BdbD分子水平增加了细胞氧化输出蛋白质(例如，PhoA)的能力。由于PhoA含有2个二硫键，而AmyQ和枯草芽孢杆菌大部分已知的分泌蛋白不含二硫键，数据表明TrxA-缺失细胞的改善的PhoA分泌可归因于PhoA中增加的转运后二硫键形成，而非增加的前-PhoA跨膜转运。

本发明提供了遗传修饰的宿主细胞，其包含相对于在相应的未修饰宿主细胞中此类细胞质还原酶的活性，降低或抑制宿主细胞中细胞质还原酶活性的遗传修饰。可以通过降低或抑制宿主细胞中任何细胞质还原酶来实施本发明。可以如本文所示通过细胞质还原酶降低的表达，或者如本文所示通过细胞质还原酶降低的活性，来检测降低的活性。

术语“还原酶”指在其环境下还原分子的酶。还原酶通过传递电子从而在还原底物时成为更氧化的状态而发挥作用。在一些实施方案中，细胞质还原酶是巯基-二硫键还原酶、硫氧还蛋白或硫氧还蛋白样蛋白质，例如TrxA、TrxC、YbdE、YdbP、YdfQ、YkuV、YosR、YtpP、YusE、BdbA、ResA、StaA、SpoIVH或YneN，或特定宿主细胞中的等同蛋白质。在另一个实施方案中，细胞质还原酶是谷氧还蛋白，例如GrxA、GrxB或GrxC，或是谷胱甘肽氧化还原酶，例如Gor，或特定宿主细胞中的等同蛋白质。

在一些实施方案中，细胞质还原酶是芽孢杆菌TrxA蛋白质，例如表1列举的那些蛋白质，或来自其它原核或真核细胞的同源物，或其保留了还原酶活性的突变体。

在一些实施方案中，细胞质还原酶是枯草芽孢杆菌TrxA多肽，其具有GenBank检索号P14949所述的氨基酸序列(MAIVKATDQSFSAETSEGVVLADFWAPWCGPCKMIAPVLEELDQEMGDKLKIVKIDVDENQETAGKYGVMSIPTLLVLKDGEVVETSVGFKPKEALQELVNKHL；SEQ ID NO：2)，或具有由GenBank检索号X99275所述的核酸序列(GATTCTTAATCGCAAGAGCGCCGGAGCTTCATGCCGGCGCTCTTTTTCAGGTTTTAAAACAGCTCCGGCAGGGCATGGTAAAGTACATGACAGTGAAGAGGAGATGTGATCTTATGCTTCGTACCATTTTAATGATTATTGGGGCAATTGTAGTGATCGGGGCCATTATCAGATTTGTGTTTTAAAAAAAGAGCATATCCCATTCAACCATATAAAAATGAGTAAACCGGCTGTGATCAGGAAAAAATAATTTGTAAGCATTAAAATAGCGTGAACGAATGGGAGATGCTATACTAAAAATCATCATTTCACATTGGAGGAATTCAATAATGGCTATCGTAAAAGCAACTGATC；SEQ ID NO：1)编码的氨基酸序列。通过鉴定GenBank中的同源多肽可以鉴定其它的同源物，例如，使用SEQ ID NO：3作为杂交探针鉴定宿主细胞核酸文库中的同源核酸。通过在已知的TrxA序列中产生突变(插入、缺失或取代)，可以产生突变体。在一些实施方案中，例如在催化区之外产生了保守取代。考虑约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的突变体。

表1：

本发明还提供了遗传修饰的宿主细胞，所述细胞包括编码异源氧化酶的核酸序列。术语“氧化酶”指在其环境下氧化分子的酶。氧化酶通过接受电子从而在氧化底物时成为更还原的状态而发挥作用。术语“异源的”指在正常(未修饰)或野生型的条件下(例如亲本宿主细胞)，在宿主细胞中不生产的蛋白质。异源氧化酶可来自不同于宿主细胞的任何物种或菌株。备选地，异源氧化酶可以来自与宿主细胞相同的物种或菌株，但由引入宿主细胞的核酸序列表达。在示例性实施方案中，异源氧化酶可以是葡萄球菌氧化酶。在一些实施方案中，异源氧化酶将是来自非致病性葡萄球菌细菌的葡萄球菌氧化酶，例如肉葡萄球菌或木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。

在一些实施方案中，氧化酶是BdbA、DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DipZ、DsbE、CcmG、DsbG、BdbB、BdbC、BdbD。在一个实施方案中，氧化酶是葡萄球菌DsbA蛋白或葡萄球菌DsbA样蛋白，例如在表2中列举的那些蛋白质，或来自其它原核或真核细胞的同源物，或其保留了氧化酶活性的突变体。

在一些实施方案中，氧化酶是肉葡萄球菌DsbA，具有SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列(MKKLALLVCIGIIAAVLQGCSQKDPDLNSKNGKIRVVEFADYKCPYCKKVEDNIMPKLEKDYIDKGKVDYQMVNVAFLGKDSIIGSRAGHAVKNIAPKQYLDFQKKIFAVQPDTEDHKKPWINEKLLDKLIDGLKISNKQKADIKKDYKTKNSKSWKDAEKDKAFAKKKNIDTVPVVFVDGTKLDDPYHFKEYKDLLEK；SEQ ID NO：4)，或具有由SEQ ID NO：3所述核酸序列编码的氨基酸序列(ATGAAAAAATTAGCATTATTAGTTTGCATTGGTATTATCGCTGCTGTATTACAAGGATGTTCACAAAAAGACCCTGATTTAAATAGTAAAAATGGAAAAATCAGAGTTGTAGAATTTGCTGATTATAAATGTCCGTACTGTAAAAAAGTAGAAGATAATATCATGCCGAAATTAGAAAAAGATTATATTGATAAAGGCAAAGTGGATTATCAAATGGTTAATGTGGCTTTTTTAGGTAAAGATTCTATTATTGGTTCACGTGCAGGTCATGCGGTAAAAAATATTGCACCTAAACAATATTTAGATTTTCAAAAGAAAATTTTTGCTGTACAACCTGATACAGAAGACCATAAGAAACCTTGGATTAATGAAAAACTGTTAGACAAGTTAATCGATGGATTAAAAATCTCTAATAAACAAAAGGCAGATATTAAAAAAGACTATAAAACAAAAAACAGTAAATCTTGGAAAGATGCTGAAAAAGATAAAGCATTTGCTAAAAAGAAAAATATTGATACTGTACCTGTAGTTTTTGTGGATGGTACCAAATTGGATGATCCGTATCATTTTAAAGAATATAAAGATTTACTAGAAAAATAA；SEQ ID NO：3)，或其保留了氧化酶活性的突变体。

通过鉴定GenBank中的同源多肽可以鉴定其它的同源物，例如，使用SEQ ID NO：3作为杂交探针鉴定宿主细胞核酸文库中的同源核酸。通过在已知的氧化酶序列中产生突变(插入、缺失或取代)，可以产生突变体。在一些实施方案中，产生了保守取代，例如在催化区之外。考虑约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的突变体。

表2

重要的是注意到单个酶根据细胞条件，可以既表现出还原活性，又表现出氧化活性。因此，在一些条件下发挥还原酶作用的蛋白质，在不同条件下可以发挥氧化酶的作用。

本发明的细胞质还原酶多核苷酸或氧化酶多核苷酸还包括与上述多核苷酸基本等同的核苷酸序列。根据本发明的多核苷酸可以具有，例如与本文所述的核酸序列至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更典型地至少约90％、91％、92％、93％或94％，甚至更典型地至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中多核苷酸编码相应具有还原酶活性或氧化酶活性的多肽。

本发明的细胞质还原酶或氧化酶多核苷酸包括在严谨条件下与本文所述的核苷酸序列杂交的核酸序列片段或其互补序列，所述片段大于约5个核苷酸，或约7个核苷酸，或大于9个核苷酸，或大于17个核苷酸。例如，考虑15、17、或20个或更多个核苷酸的选择性片段(即，所述片段与本发明的任一种多核苷酸特异性杂交)。

术语“严谨的”用于指本领域通常理解为严谨的条件。严谨的条件可以包括高严谨条件(即，在0.5M NaHPO₄、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mMEDTA的条件下，65℃下与结合滤膜的DNA杂交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中68℃进行洗涤)和中严谨条件(即，在0.2xSSC/0.1％SDS中42℃进行洗涤)。例如，考虑到脱氧寡核苷酸的杂交，额外的示例性严谨杂交条件包括在37℃(用于14-碱基的寡核苷酸)、48℃(用于17-碱基的寡核苷酸)、55℃(用于20-碱基的寡核苷酸)和60℃(用于23-碱基的寡核苷酸)下，在6xSSC/0.05％焦磷酸钠中洗涤。

落入本发明范围内的序列不限于这些特异性序列，也包括其保留了想要的生物学活性的突变体。术语“突变体”包括等位基因和种变体、来自其它真核或原核细胞的同源物，以及实质上的等同物。可以通过将上文提供的序列、其代表性的片段或者与上述序列至少90％同一性或至少95％同一性的核苷酸序列，与来自同一物种的另一分离物的序列相比较，常规地确定等位基因变体和物种变体。此外，为了顾及密码子可变性，本发明包括了编码与本文公开的特定可读框(ORF)相同的氨基酸序列的核酸分子。换言之，在ORF的编码区中，清楚地考虑了将一种密码子用另一种编码相同氨基酸的密码子取代。

本发明还提供了公开的多核苷酸和蛋白质的种及宿主细胞菌株同源物(或直向同源物)。可以通过制备合适的探针或引物，从本文提供的序列中分离和鉴定种或菌株的同源物，并从想要的种中筛选合适的核酸源。

本发明的还原酶和氧化酶多肽包括但不限于这样的多肽，其包含：上述氨基酸序列，或由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列，或相应的全长或成熟蛋白质。本发明还提供了上述氨基酸序列的生物学活性变体，或相应的全长或成熟蛋白质，及其保留了生物学活性的“实质上的等同物”(例如，具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、86％、87％、88％、89％、至少约90％、91％、92％、93％、94％，典型地至少约95％、96％、97％，更典型地至少约98％，或最典型地至少约99％的氨基酸同一性)。与上述多肽相比，由等位基因变体编码的多肽可以具有相似的、增加的或降低的活性。

宿主细胞

本发明提供了遗传修饰的宿主细胞及其用于生产含二硫键蛋白质的方法。术语“宿主细胞”用于指这样的细胞，所述细胞已经用核酸序列转化、转染或感染，或者能够被转化、转染或感染，然后表达选定的目标基因，以重组地生产目标蛋白质。该术语包括亲本细胞的后代，只要存在选定的基因或遗传修饰，则不论后代在形态上或遗传组成上是否与原始亲本相同。

可以用任何能够表达异源多肽并能够进行遗传修饰的宿主生物实施本发明。宿主生物优选的是单细胞宿主生物，然而本发明也涵盖了多细胞生物，条件是所述生物可以如本文所述进行修饰并在其中表达目标多肽。出于澄清的目的，在本文中可通篇使用术语“宿主细胞”，但应该理解，除非由于技术理由不可实施，则宿主生物可以代替宿主细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如细菌细胞。宿主细胞可以是革兰氏阳性细菌细胞，例如芽孢杆菌，或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。宿主生物可以是好氧或厌氧生物。在一些实施方案中，宿主生物是具有有利于表达多肽的特征的生物，例如比其它类型的细胞具有较少蛋白酶的宿主细胞。用于该目的的合适细菌包括古细菌和真细菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。有用的细菌的其它实例包括埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)和副球菌属(Paracoccus)。有用的细菌的其它实例包括棒杆菌属(Corynebacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和链霉菌属(Streptomyces)物种，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)。合适的大肠杆菌宿主包括大肠杆菌DHB4、大肠杆菌BL-21(它的lon(Phillips等人，J.Bacteriol.159：283，1984)和ompT蛋白酶都是缺陷的)、大肠杆菌AD494、大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)、大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)。其它菌株包括大肠杆菌B834，该菌株是甲硫氨酸缺陷的，因而能够用³⁵S-甲硫氨酸或硒代甲硫氨酸高比活的标记靶蛋白(Leahy等人，Science 258：987，1992)。其它目标菌株包括BLR菌株和K-12菌株HMS174和NovaBlue，其是recA衍生物，改善了质粒单体产量，并可以帮助稳定含重复序列的靶质粒。

合适的芽孢杆菌菌株包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、克劳氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌或耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)。革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌是用于在生物技术工业中生产分泌性蛋白质的优选生物。它的普及性主要是基于枯草芽孢杆菌缺少外膜的事实，所述外膜将多种蛋白质保留在革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的周质中。因此，大部分的跨细胞膜转运的枯草芽孢杆菌蛋白直接进入了生长培养基。此外，缺少外膜暗示用枯草芽孢杆菌生产的蛋白质是不含脂多糖(内毒素)的。使用枯草芽孢杆菌作为蛋白质生产宿主的其它优势是它的高遗传顺应性、可获得在几乎所有的～4100种基因中具有突变的菌株、具有用于基因表达的菌株和载体的工具箱，以及该细菌通常认为是安全的的事实(Braun等人，Curr.Opin.Biotechnol.10：376-381，1999；Kobayashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A100：4678-4683，2003；Kunst等人，Nature 390：249-256，1997；Zeigler等人，In E.Goldman and L.Green(ed.)，Practical Handbook of Microbiology.CRC Press，Boca Raton，FL，2008)。

在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如酵母或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC No.CCL61)、CHO DHFR-细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：4216-4220(1980))、人胚肾细胞(HEK)293或293T细胞(ATCC No.CRL1573)，或3T3细胞(ATCC No.CCL92)。用于转化、培养、扩增、筛选和产物生产和纯化的合适哺乳动物宿主细胞和方法的选择是本领域已知的。其它合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC No.CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC No.CRL1651)，以及CV-1细胞系(ATCC No.CCL70)。其它示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化的细胞系。正常的二倍体细胞、源自原代组织体外培养的细胞株，以及原代外植体也是合适的。候选细胞可以是在选择基因中基因型缺陷的，或者可以含有显性作用的选择基因。其它合适的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞、源自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系，其都可从ATCC获得。上述各细胞系都是蛋白质表达领域的技术人员已知且可获得的。

本领域技术人员已知的许多酵母细胞菌株也可作为表达本发明多肽的宿主细胞。示例性的酵母细胞包括例如酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。真菌，例如曲霉，也可作为表达本发明多肽的宿主细胞。

此外，当需要时，本发明的方法中可以利用昆虫细胞系统。此类系统描述在例如Kitts等人，Biotechniques，14：810-817(1993)；Lucklow，Curr.Opin.Biotechnol.，4：564-572(1993)；和Lucklow等人，(J.Virol.，67：4566-4579(1993)中。示例性的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。

本发明还提供了本发明的遗传修饰的宿主细胞的培养物。宿主细胞的“培养物”是在包括选择培养基或分化培养基的营养培养基中进行的宿主细胞的菌落或生长。术语“培养物”包括原代细胞及其后代和源自它们的培养物，不考虑转移数。还可以理解，由于故意或非故意的突变，所有的宿主细胞后代的DNA含量可以不完全相同。包括了在原始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

营养培养基可以是固体或半固体琼脂或液体培养基。示例性的营养培养基包括Luria Bertani(LB)培养基、血琼脂、巧克力琼脂、Thayer-Martin琼脂(TM)、Bile Esculin琼脂(BEA)、胱氨酸-乳糖-电解质缺陷琼脂(CLED)、Hektoen Enteric(HE)、MacConkey琼脂(MAC)、甘露醇盐琼脂(MSA)、Mueller Hinton琼脂、琼脂、苯乙醇琼脂(PEA)，和木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂(XLD)。通常，使用本领域的标准技术在培养箱中生长宿主细胞的培养物，例如，如Sambrook等人，(1989).Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，和Ausubel等人编著Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishers Inc.and Wiley and Sons，NY(1994)中描述的。

可以在摇瓶中生长本发明的培养物，并生产重组蛋白，例如Qui等人，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64：4891中描述的。备选地，可以在发酵罐中生长本发明的培养物，并生产重组蛋白，例如Qui等人，同上。

遗传修饰

本发明提供了具有降低的细胞质还原酶活性的遗传修饰的宿主细胞。术语“降低的活性”指在宿主的细胞质中还原酶活性的降低或缺失或完全消除。与相应的野生型或未修饰的宿主细胞(例如，未修饰的芽孢杆菌宿主细胞)中的活性相比，可以测定降低的活性。可以通过降低还原酶多肽的表达、降低编码细胞质还原酶氨基酸序列的基因的转录、降低或抑制编码还原酶氨基酸序列的RNA的翻译，或失活或抑制细胞质还原酶多肽，来实现降低的细胞质还原酶活性。可以通过降低或缺失特定还原酶的活性直接地实施还原酶活性的降低，或者通过改变特定还原酶上游或下游的还原酶途径间接地实施还原酶活性的降低。本文描述的测定法提供了测量遗传修饰的宿主细胞的还原酶活性的指导，例如，如本文实施例2描述的，用4-乙酰氨基-4’-马来酰亚胺-二苯乙烯-2，2’-二磺酸(AMS)标记细胞提取物的测定法。

通过功能性缺失或失活编码还原酶的基因，可以实现降低或缺失宿主细胞的内源性还原酶活性。在一个实施方案中，可以使用质粒破坏细胞质还原酶基因，所述质粒在染色体的特定位点整合到宿主细胞的染色体中。在另一个实施方案中，向还原酶编码序列中引入至少一个突变，从而调整还原酶的活性，例如引入点突变失活活性。在细胞质还原酶基因中的突变或破坏可以是插入、删除或取代突变。可以使用位点定向诱变、PCR扩增或其它合适的方法，通过插入来创造突变，其中引物具有想要的点突变(参见Sambrook等人，见上文；和Ausubel等人，见上文，关于诱变技术的描述)。

核酸序列中的修饰可以导致相对于天然存在的或野生型序列，氨基酸序列的保守的和/或非保守的修饰。对氨基酸序列保守的修饰将产生与天然存在的多肽具有相似的功能和化学特征的变体或突变多肽。相反，可以通过选择氨基酸序列中的取代来实现对多肽的功能和/或化学特征的实质性修饰，所述取代对维持(a)取代区域中分子骨架的结构，例如片层或螺旋构象；(b)分子在靶位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积的影响显著不同。

例如，“保守的氨基酸取代”可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对所述位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。此外，还可以用丙氨酸取代多肽中的任何天然残基，如之前已描述的“丙氨酸扫描诱变”。

保守的氨基酸取代还涵盖了非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非在生物系统中合成而掺入。这些包括肽模拟物，和氨基酸部分的其它反向或倒置形式。本领域技术人员可以理解，可以化学合成以及通过重组方式产生本文描述的核酸和多肽分子。

基于共同的侧链性质，天然存在的残基可分为以下几类：

1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

3)酸性：Asp、Glu；

4)碱性：His、Lys、Arg；

5)影响链方向的残基：Gly、Pro；和

6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

例如，非保守的取代可涉及上述类别之一的成员对另一类别成员的替换。此类取代的残基可引入与非人的IL-17受体样多肽直向同源物同源的多肽区域中，或引入分子的非同源区域中。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于每种氨基酸的疏水性和电荷特征赋予其亲水指数，它们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

氨基酸亲水指数对蛋白质产生相互作用的生物学功能的重要性是本领域理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知可以用其它具有相似亲水指数或分数的氨基酸取代一些氨基酸，且仍保留相似的生物学活性。基于亲水指数进行改变时，取代氨基酸的亲水指数在±2以内是优选的，在±1以内是特别优选的，在±0.5以内是更特别优选的。

本领域也可以理解，基于疏水性可以有效进行相似氨基酸的取代，特别是其中产生的生物学功能等同蛋白质或肽是计划在免疫学实施方案中使用的，如在本案下。蛋白质的最大局部平均亲水性由其邻近氨基酸的亲水性控制，与蛋白质的免疫原性和抗原性相关，即，与蛋白质的生物学性质相关。

赋予氨基酸残基以下疏水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。基于相似的疏水性值进行改变时，取代氨基酸的疏水性值在±2以内是优选的，在±1以内是特别优选的，在±0.5以内是更特别优选的。基于疏水性也可以从一级氨基酸序列中鉴定出表位。这些区域也称为“表位核心区”。

当需要此类取代时，本领域技术人员可以确定想要的氨基酸取代(不论保守或非保守的)。例如，氨基酸取代可用于鉴定多肽的重要残基。

下表3中给出了示例性的氨基酸取代。

表3：氨基酸取代

本领域技术人员可以使用普遍已知的技术确定多肽的合适变体。为了鉴定分子中可以改变而不破坏活性的合适区域，本领域技术人员可以以认为对活性不重要的区域作为目标。例如，当已知有来自同一物种或来自其它物种的具有相似活性的相似多肽时，本领域技术人员可以比较多肽与所述相似多肽的氨基酸序列。在此类比较下，可以鉴定在相似多肽间保守的分子残基和部分。可以理解，在相对于此类相似多肽不保守的多肽区域中进行改变，将较不可能对多肽的生物学活性和/或结构产生不利影响。本领域技术人员也可以理解，即使在相对保守的区域中，也可以用化学相似的氨基酸取代天然存在的残基，而保留活性(保守氨基酸残基取代)。因此，即使是对生物学活性或结构重要的的区域也可进行保守氨基酸取代，而不会破坏生物学活性或对多肽结构产生不利影响。

此外，本领域技术人员可以回顾结构-功能研究，鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基。根据此类比较，可以预测多肽中氨基酸残基的重要性，所述残基对应相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员还可以相对于相似多肽的结构，分析三维结构和氨基酸序列。根据上述信息，本领域技术人员可以预测IL-17受体样多肽的氨基酸残基与其三维结构的比对。大量科学出版物已关注于从氨基酸序列分析预测二级结构，并鉴定表位。参见Chou等人，Biochemistry，13(2)：222-245，1974；Chou等人，Biochemistry，113(2)：211-222，1974；Chou等人，Adv.Enzymol.Relat.Ateas Mol.Biol.，47：45-148，1978；Chou等人，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276和Chou等人，Biophys.J.，26：367-384，1979。此外，目前可使用计算机程序帮助预测蛋白质的抗原部分和表位核心区。实例包括基于Jameson-Wolf分析的程序(Jameson等人，Comput.Appl.Biosci.，4(1)：181-186，1998和Wolf等人，Comput.Appl.Biosci.，4(1)：187-191，1988)、

程序(Brutlag等人，CABS，6：237-245，1990，和Weinberger等人，Science，228：740-742，1985)，和其它用于蛋白质三级结构预测的新程序(Fetrow等人，Biotechnology，11：479-483，1993)。

可以通过在宿主细胞中引入或表达反义核酸来抑制转录和翻译。备选地，可以通过将宿主细胞与干扰这些过程的有机小分子接触来抑制这些过程。此外，还可以通过调控一种或多种蛋白质的表达，来降低或消除宿主细胞中还原酶的表达，所述蛋白质通过作用在还原酶基因调控的上游，控制还原酶在宿主细胞中的表达。例如，可以通过降低还原酶表达所必需的因子的表达或活性，来减少还原酶的表达。备选地，可以通过使用这样的构建体来降低或消除还原酶表达，所述构建体允许降解还原酶的蛋白酶的表达或激活。例如，这可以通过在还原酶中插入蛋白酶敏感位点来实施(参见例如，Ehrman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13111，1997)。

在其他实施方案中，可以使用诱导型启动子降低或消除宿主细胞中的还原酶活性，所述启动子允许在想要的时刻开启或关闭宿主细胞中的所述活性。此外，可以以可逆的方式诱导或抑制所述活性。本发明提供了具有可诱导的还原酶活性的宿主细胞。在一些实施方案中，通过首先缺失所述宿主细胞的内源还原酶活性，然后提供宿主细胞与诱导型启动子序列有效连接的编码还原酶蛋白的重组核酸，来获得具有可诱导的还原酶活性的宿主细胞。“诱导型”启动子是当与转录因子或诱导物结合时，以增加或降低的速率指导转录的启动子。可以通过将宿主暴露给“诱导物”或从宿主细胞培养基中去除诱导物，来控制宿主细胞内转录因子的合成或结合启动子的能力。因此，为了调控诱导型启动子的表达，从宿主细胞培养基中添加或去除诱导物。

“诱导物”是化学或物理试剂，当被给予一群细胞时，将增加特定基因的转录量。这些通常是小分子，其影响对特定操纵子或基因群是特异的，可包括糖、磷酸、醇、金属离子、激素、热、冷等。常用的诱导物是异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，因为它是不可代谢的诱导物。如本文示例(参见实施例2)，特别合适的启动子序列包括IPTG诱导型启动子序列，例如PSPAC。额外示例性的诱导型启动子是阿拉伯糖启动子，其中核酸仅在存在L-阿拉伯糖的条件下表达；由乳糖诱导的taclI启动子；由培养基中的低磷酸盐浓度诱导的pho基因启动子；UV-敏感的诱导型启动子；温度敏感的诱导型启动子和抗生素诱导型启动子，等等。通过将该关键基因置于质粒的IPTG依赖性PSPAC启动子的转录控制之下，构建了条件trxA突变宿主细胞株(ItrxA)。

在另一个实施方案中，根据本发明的方法或宿主细胞包括通过可抑制系统调控还原酶活性的宿主细胞。可抑制和可诱导的系统之间的主要差别是当效应分子与抑制子结合时产生的结果。使用诱导型系统，效应分子(即，诱导物)与阻抑物的结合极大降低了阻抑物对操纵基因的亲和力，阻抑物被释放并且转录继续。Lac操纵子是可诱导系统的实例。使用可抑制的系统，效应分子与阻抑物的结合极大增加了阻抑物对操纵基因的亲和力，阻抑物结合并且终止转录。因此，对于trp操纵子，由于阻抑物结合在操纵基因，向宿主细胞环境中添加色氨酸(效应分子)关闭了该系统。

在其他实施方案中，宿主细胞可以表达异源氧化酶多肽的直向同源物或同源物，其中变体(直向同源物或同源物)保留了想要的氧化酶活性。本文描述了确定变体是否保留了想要的氧化酶活性的指导。

鉴定与目标多肽相同的氨基酸序列的方法是本领域已知的。设计了一些确定同一性和/或相似性的方法，产生测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法描述在公众可获得的计算机程序中。确定两条序列间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.，12：387，1984；Genetics ComputerGroup，University of Wisconsin，Madison，WI)；BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410，1990)。BLASTX程序可从国立生物技术信息中心(NCBI)和其它来源获得(BLAST Manual，Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等人，见上文)。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

一些比对两条氨基酸序列的比对方案可导致两条序列仅短区域的匹配，而该小的比对区可具有非常高的序列同一性，即使两条全长序列之间并无显著的关系。因此，在优选的实施方案中，选定的比对方法(GAP程序)可导致在靶多肽的至少50个连续氨基酸区域的比对。

例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，WI)，比对了序列百分比同一性待确定的两条多肽各自氨基酸的最佳匹配(“匹配范围”由算法确定)。空位开放罚分(按3X对角项平均来计算；“对角项平均”是所使用的比较矩阵的对角项的均值；“对角项”是由特定比较矩阵分配给每个完美的氨基酸匹配的分数或数值)和空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10)，以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62与算法协同使用。算法还使用标准的比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，附录3(1978)；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919，1992)。

用于测量还原酶和氧化酶活性的测定

为了确定相对于相应未修饰的宿主细胞中的此类还原酶活性，遗传修饰的宿主细胞是否具有减少的、降低的或缺失的还原酶活性，可将修饰的和未修饰的宿主细胞进行测量所表达的还原酶的相对量或相对活性的测定，如通过合适底物的减少来测量。可以通过例如Western印迹、Western印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、高效液相层析(HPLC)分离、免疫沉淀，和/或活性测定如DNA结合凝胶迁移测定和碱性磷酸酶测定，来测量所表达的还原酶的相对量。

氧化还原反应测定的底物依赖于待分析的特定酶，本领域技术人员可以理解哪种底物对测定是合适的。例如，用于细胞质还原酶TrxA的底物是AccB、AhpC、AhpF、ArsC、CysH、MsrA、NrdEF、PdhD、OdhB、Spx、YdfQ，用于氧化酶DsbA的底物是大肠杆菌PhoA。

在一个示例性的测定法中，在非还原条件下由SDS-PAGE分离之前，可以通过用4-乙酰氨基-4’-马来酰亚胺-二苯乙烯-2，2’-二磺酸(AMS)标记，监测纯化蛋白质或在复杂样品(例如，细胞提取物)中的蛋白质的氧化还原状态。AMS只共价地结合还原的蛋白质分子中游离的巯基，从而使还原的蛋白质具有比氧化的蛋白质更高的质量，得到测量还原酶速率的方法。可以使用本领域的标准技术测量AMS标记的量，例如使用2100生物分析仪(Agilent Technologies)的蛋白质50检测芯片。

此外，可以用多种方法测定蛋白质的氧化还原电位，所述氧化还原电位是蛋白质是否进一步还原或氧化的度量，所述方法例如通过使用Nernst方程从还原氧化反应的平衡常数计算，涉及具有已知氧化还原电位的参照。常用的参照是确定的谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物(GSH/GSSG)缓冲液或通过合适的还原酶偶联的NADPH/NADP+(Gilbert Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.63：69，1990)。另一种方法叙述在Krause等人，J.Biol.Chem.299：9494，1991中。在Aslund等人，J.Biol.Chem.272：30780，1997和Mossner等人Prot.Sci.7：1233，1998中描述了测定蛋白质(例如硫氧还蛋白超家族的成员及其变体)氧化还原电位的一种方法。简而言之，描述在Aslund等人中用于得到E°′的该成对平衡方法是基于精确的测定平衡常数，K₁₂用于不同对氧化还原活性蛋白质之间的可逆巯基-二硫键交换反应。然后，通过与已知标准的平衡来获得标准状态的氧化还原电位，例如Trx″PDI″或Trx，其氧化还原电位分别通过与NADPH偶联(E°′＝-315mV)独立地测定(Krause等人，J.Biol.Chem.266：9494，1991)。

在一些情况下，蛋白质的氧化还原电位是与其pK值连接的。例如，在DsbA的情况下，已经证实了氧化还原电位与活性位点的亲核巯基的pKa值之间的线性相关性(Krause等人，J.Biol.Chem.266：9494，1991)。活性位点基序(CX1X2C)的主要功能是调控亲核巯基的pKa值，从而调控蛋白质还原形式相对于氧化形式的稳定性。因此，在DsbA的情况下，3.5的极低pKa值(Nelson等人，Biochemistry 33：5974，1994)是它的高度氧化性质的主要因素。因此，通过选择具有低pKa值的变体，可以鉴定具有氧化性质的蛋白质，例如硫氧还蛋白变体或突变体。可以通过本领域已知的方法测定pKa，并描述在例如Nelson等人，见上文中。

测量酶还原活性的其它测定，包括如描述在Holmgren等人(J.Biol.Chem.254，3664，1979)中的β-羟基乙烯二硫化物(HED)还原测定，描述在Luthman和Holmgren J.Biol.Chem.257：6686，1979和Moessner等人，J.Biol.Chem.274：25254，1999中的对胰岛素二硫化物的体外还原作用的分光光度计监测。此外，通过监测10μg核糖核苷酸还原酶将[³H]CDP转化为[³H]dCDP，可以如描述在Thelander等人，Methods Enzymol.51：227，1978和Holmgren J.Biol.Chem.254：9113，1979中的，以核糖核苷酸还原酶活性测量酶的还原能力。可用于测定酶还原能力的其它底物包括硫辛酸和氧化的DTT，如描述在Moessner等人，J.Biol.Chem.274：25254，1999中。

在体外评估二硫键异构化的测定法是本领域中标准的。一个示例性的测定法是测量酶异构化牛胰腺胰岛素抑制剂(BPTI)的错误氧化形式的能力，如Zapun等人，Biochemistry 34：5075，1995中描述的。用于测定酶催化二硫键形成的能力的其它测定法描述在Zapun和CreightonBiochemistry 33：5202，1994，以及Jonda等人，EMBO J.18：3271，1999中。通常，将酶和还原的底物一起孵育，并测定还原和氧化底物的量，例如，通过HPLC或质谱法。示例性的底物包括核糖核酸酶或水蛭素。

生产重组含二硫键的蛋白质

本发明提供了通过生长遗传修饰的宿主细胞生产含二硫键的蛋白质的方法，其中宿主细胞将蛋白质分泌到培养基中。术语“二硫键形成”指在存在于1个或2个多肽的2个半胱氨酸之间形成共价键的过程。通过在酶活性位点半胱氨酸和靶蛋白的半胱氨酸之间的巯基-二硫键交换，介导二硫键的氧化。由称为二硫键形成的催化剂的酶来催化二硫键形成。

遗传修饰的宿主细胞可以包含编码含二硫键的蛋白质的核酸序列。本发明考虑了生产任意含二硫键的蛋白质，包括但不限于人胰岛素、胰岛素样生长因子、人生长激素、脑衍生神经营养因子、神经生长因子、脂肪酶、Bowman-Birk蛋白酶抑制剂和抗体片段。可以按照根据下文所述说明进行重组表达技术来生产含二硫键的蛋白质。例如，通过向合适的载体中插入编码含二硫键的蛋白质的氨基酸序列的核酸序列，本领域技术人员可以容易地生产大量想要的核苷酸序列。备选地，可以向表达载体中插入编码含二硫键的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸。通过将表达载体引入到本发明的遗传修饰的宿主细胞中，可以大量生产所编码的含二硫键的蛋白质。

使用标准的连接技术，可以将编码含二硫键的蛋白质的氨基酸序列的核酸分子插入到合适的表达载体中。关于表达载体的综述，参见Meth.Enz.，v.185，D.V.Goeddel编著，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)。使用标准的转化、转染或感染方法，将载体或核酸插入到遗传修饰的宿主细胞中。“转染”指宿主细胞摄入表达载体，不论实际上是否表达任何编码序列。示例性的转染方法包括CaCl₂和电穿孔。“转化”指将DNA引入生物中，作为染色体外元件或通过染色体整合体，使DNA是可复制的。根据所使用的宿主细胞，使用适合此类细胞的标准技术进行转化。示例性的转化方法包括电穿孔并且使用氯化钙的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一个示例性的转化使用聚乙二醇/DMSO，如Chung和Miller，Nucleic Acids Res.，16：3580，1988中所述。

通常选择在所使用的特定宿主细胞中有功能的载体(即，载体与宿主细胞机器是相容的，使得可以发生基因的扩增和/或基因的表达)。一种类型的载体是质粒。通常，质粒载体含有复制子和源自与宿主细胞相容的物种的控制序列。载体通常携带了复制位点，以及能够提供在转化细胞中表型选择的标记序列。示例性质粒pBR322，是源自大肠杆菌物种的质粒(参见例如，Bolivar等人，Gene，2：95，1977)，pBR322含有氨苄青霉素和四环霉素抗性的基因，pBR322质粒或其他的微生物质粒或噬菌体。备选地，可以修饰质粒以含有启动子，所述启动子可被微生物生物用于表达选择标记基因。

在一些实施方案中，培养基含有氧化还原活性化合物。术语“氧化还原”指氧化/还原反应，这是分子的氧化状态发生改变的化学反应。术语“氧化还原活性化合物”是易于或能够被还原或氧化的化合物。示例性的氧化还原活性化合物包括半胱氨酸、胱氨酸、胱胺、谷胱甘肽(GSH)、二硫代双GSH、2-巯基乙醇(βME)、二巯基-β(ME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、二噻烷DTT、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺、氯化铜或分支硫醇。

可以使用本领域已知的标准方法评估由本发明的遗传修饰的宿主细胞生产的重组蛋白的量。此类方法包括但不限于：Western印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、高效液相层析(HPLC)分离、免疫沉淀，和/或活性测定，如DNA结合凝胶迁移测定和碱性磷酸酶测定。

在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞将分泌重组蛋白到培养基中。然而，如果宿主细胞不分泌重组蛋白，则重组蛋白将存在于细胞质和/或细胞核(对于真核宿主细胞)中，或在胞质溶胶中(对于细菌宿主细胞)。通常机械破坏或用去污剂破坏宿主细胞，以释放胞内内容物到缓冲液中。然后，从培养基或细胞裂解物中纯化或分离重组蛋白。

备选地，对于位于宿主细胞细胞质和/或细胞核(对于真核宿主细胞)中，或在胞质溶胶中(对于细菌宿主细胞)的重组蛋白，可以使用本领域技术人员已知的任何标准技术从宿主细胞中提取胞内物质(包括革兰氏阴性细菌的包含体)。例如，可以通过弗氏压碎器(French press)、匀浆和/或超声然后离心，来裂解宿主细胞，释放细胞周质/细胞质的内容物。

如果重组蛋白在胞质溶胶中形成了包含体，则包含体通常可结合内侧和/或外侧细胞膜，从而主要发现在离心后的细胞沉淀物质中。然后，可以在存在还原剂(例如在碱性pH下的二硫苏糖醇，或在酸性pH下的三羧基乙基膦)的条件下，用极端pH，或用离液试剂处理细胞沉淀材料，所述离液试剂为例如去污剂、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物，来释放、破碎和溶解包含体。然后，可以使用凝胶电泳、免疫沉淀等分析处于溶解形式的重组蛋白。如果需要分离重组蛋白，则可以使用标准方法完成分离，例如本文和Marston等人，Meth.Enz.，182：264-275(1990)中描述的。

如果表达重组蛋白时没有显著程度地形成包含体，则将发现蛋白质主要在细胞匀浆离心后的上清液中。利用例如本文描述的方法，可以从上清液中进一步分离或纯化蛋白质。

可以使用多种技术实现重组蛋白从溶液中的纯化。如果已合成多肽使其在羧基或氨基端含有标签，例如六组氨酸(hexaHis)或其他小肽(如FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或myc(Invitrogen，Carlsbad，CA))，则它可以在一步过程中基本纯化，所述过程是将溶液穿过亲和柱，其中柱基质的对标签具有高亲和力。

例如，多聚组氨酸以高亲和力和特异性结合镍，因此，可以使用镍亲和柱(例如

镍柱)纯化多聚His标记的重组蛋白。参见例如，Ausubel等人编著，Current Protocols in Molecular Biology，Section 10.11.8，JohnWiley & Sons，New York(1993)。此外，可以通过使用单克隆抗体纯化重组蛋白，所述抗体能够特异的识别并结合重组多肽。

因此，用于纯化的合适方法包括但不限于：亲和层析、免疫亲和层析、离子交换层析、分子筛层析、高效液相层析(HPLC)、电泳(包括天然凝胶电泳)然后凝胶洗脱，和制备性等电聚焦。在一些情况下，可以结合使用两种或多种纯化技术实现提高的纯度。

改善重组蛋白的蛋白质折叠的方法

本发明提供了改善重组蛋白的蛋白质折叠的方法，包括在允许含二硫键的蛋白质表达并改进正确折叠的条件下，生长本发明的遗传修饰的宿主细胞。可以使用上述常规生产重组蛋白的方法实施这些方法。是由于促进了二硫键的形成，本发明的遗传修饰的宿主细胞能够生产具有改善的蛋白质折叠的蛋白质。

在改善重组蛋白折叠的方法中，宿主细胞应该在允许活性含二硫键的蛋白质表达并提高产率的条件下生长在含有氧化还原活性化合物的培养基中。可以通过检测含二硫键的活性重组蛋白的较高产量(例如，更高的mg活性蛋白质/升细胞培养物，或更高的重组蛋白质活性/升细胞培养物)，来确定正确的蛋白质折叠的改善。为了测试条件是否改善了活性蛋白质的产量，可以将生长在改进条件下的修饰的宿主细胞生产的活性重组蛋白的水平，与生长在正常或未修饰条件下的未修饰宿主细胞生产的重组蛋白的水平相比较。例如，至少约2倍、3倍、4倍、5倍或更高产量的活性重组蛋白是想要的，该增加是相对于未修饰的宿主细胞在未补充氧化还原活性化合物的培养基中的产量。活性重组蛋白可以表示为μg/ml或mg/升的由修饰的宿主细胞培养物生产的活性重组蛋白。

确定细菌细胞质中正确的二硫键形成的程度的方法是本领域中标准的。在一个示例性的方法中，用编码通常含至少一个二硫键的多肽(“测试”多肽)的基因转化细菌。示例性的测试多肽或蛋白质是通常由细胞分泌的，或者是膜蛋白。为了用于本文描述的测定，通过缺失或突变信号序列来修饰这些多肽，使蛋白质不输出到细胞的细胞质之外。测试可以包括表达复杂的多肽，例如具有多个二硫键的蛋白质。此外，当未正确形成二硫键时，测试多肽可缺少生物学活性。因此，当这些蛋白质在野生型细菌的细胞质中表达时，不形成二硫键，而这些蛋白质是无活性的。

此外，可以通过测定宿主细胞细胞质的氧化还原电位，分析遗传修饰的宿主细胞生产含二硫键的蛋白质的能力。目前有多种不同的方法来测量细胞的氧化还原状态，例如在Gilbert等人，Adv.Enzymol.Rel.Areas Mol.Biol.63：69，1990；Holmgren和Fgestedt J.Biol.Chem.257：6926，1982；和Hwang等人，Science 257：1496，1992中描述的。

为了检测由本发明的遗传修饰的宿主细胞生产的重组蛋白的物理性质，可以用例如放射性同位素标记宿主细胞新合成的所有多肽。可用于标记宿主细胞内合成的多肽的常用放射性同位素包括氚(³H)、碳-14(¹⁴C)、硫-35(³⁵S)等。

改善的蛋白质折叠的特征是，水平至少2倍高于、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少100高于，或更高倍数高于野生型细胞、未修饰或部分修饰的细胞(即，仅有一些修饰例如无义突变或插入基因的细胞)中生产的正确折叠的蛋白质。

实施例

实施例1

枯草芽孢杆菌中潜在的还原性TDOR的目录(Inventory)

作为为了更有效分泌含二硫键的蛋白质而增加枯草芽孢杆菌的氧化能力的第一种方法，分析了该生物的潜在的还原系统。假设缺失相应的基因或降低其表达可以使枯草芽孢杆菌还原性降低。这又可以改善具有二硫键的蛋白质的折叠。出于该目的，可以先验地排除从其他生物已知的三种可能的系统：第一、枯草芽孢杆菌缺少在革兰氏阴性细菌和真核细胞中合成谷胱甘肽所需酶的同源物；第二、枯草芽孢杆菌缺少还原剂分支硫醇，分支硫醇可见于链霉菌物质和真菌的细胞质中(Newton等人，J.Bacteriol.178：1990-1995，1996)；第三、枯草芽孢杆菌缺少如大肠杆菌中发现的涉及异构化途径的蛋白质。

将枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的硫氧还蛋白的氨基酸序列用于在枯草芽孢杆菌序列数据库SubtiList(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)中进行BlastP搜索，使用Altschul等人(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)描述的算法。使用低于或等于10^-3的任意E值来限制用于进一步分析的序列数。在第一轮运行后，使用枯草芽孢杆菌TrxA或大肠杆菌TrxA或TrxC作为查询序列，然后将找到的序列作为用于在SubtiList数据库中进行BlastP搜索的查询序列。使用ClustalX 1.81(Thompson等人，Nucleic AcidsRes.25：4876-4882，1996)实施多比对。使用具有成对和多重比对参数的多种蛋白质权重矩阵。用PAM350矩阵(空位开放＝10)为成对(空位延伸＝0.1)和多重(空位延伸＝0.2)比对参数都获得了最佳比对(由最低的评分值定义)。使用Nielsen等人(Int.J.Neural Syst.8：581-599，1997)描述的算法，分析可能的信号肽酶I切割位点的存在。使用Krogh等人(J.Mol.Biol.305：567-580，2001)描述的算法，分析可能的跨膜片段的存在。

上述内容将分析集中在硫氧还蛋白和硫氧还蛋白样蛋白质上。BlastP搜索揭示，枯草芽孢杆菌168基因组编码12种硫氧还蛋白(样)的蛋白质。这包括四种膜蛋白(BdbA、ResA、StoA/SpoIVH和YneN)和8种预测的细胞质蛋白，它们与已知的硫氧还蛋白和/或ResA非常相似(Erlendsson等人，J.Bacteriol 186：6230-6238，2004；Zhang等人，J.Biol.Chem.281：8296-8304，2006)。图1概括了如此鉴定的硫氧还蛋白样蛋白之间的氨基酸序列关系。枯草芽孢杆菌TrxA(共104个残基)和枯草芽孢杆菌TrxA样蛋白之间的序列相似性水平范围在61％同一性加77个残基序列的保守残基(YosR-TrxA)与41％同一性加102个残基序列的保守残基(StoA-TrxA)之间。

实施例2

TrxA的细胞水平决定PhoA分泌的水平

为了测试上述潜在的TDOR对含二硫键的蛋白质的分泌的可能影响，用质粒pPSPhoA5转化单个的trxA、ybdE、ydbP、ydfQ、ykuV、StoA(ykvV或spoIVH)、yneN、ytpP和yusE突变体，以及缺少携带bdbA和yosR基因的SPβ原噬菌体的菌株。

构建突变体

如前述实施DNA技术(Kouwen，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)。如下构建或获得潜在的细胞质TDOR突变菌株。之前已构建了缺失关键的trxA基因(Scharf等人，J.Bacteriol.180：1869-1877，1998)的枯草芽孢杆菌168衍生菌株ItrxA(Smits等人，J.Bacteriol.187：3921-3930，2005)。在ItrxA菌株中，由于单交换(Campbell型)整合pMutin2mcs载体在trxA基因前，将trxA基因置于IPTG-诱导型Pspac启动子的控制下。当在存在25μMIPTG的条件下生长时，Pspac是活性的，但未完全诱导。通过用bdbC::Km^r突变体的染色体DNA转化ItrxA菌株，然后选择IPTG依赖且Km抗性的转化体，获得ItrxA bdbC菌株。

如下构建枯草芽孢杆菌yusE。使用分别含有EcoRI和BamHI限制性酶切位点的引物ggggaattcataagacagccgatgtggtc(SEQ ID NO：9)和gggggatccgtagaatagctcggcgaatg(SEQ ID NO：10)扩增1384-bp的DNA片段，其起自yusG基因，终于yusD基因。然后，用EcoRI和BamHI切割片段，连接到EcoRI-BamHI-切割的pUC18中。用BamHI和XhoII从质粒pDG1727中切出Sp抗性盒，用于取代pUC18具有的yusE拷贝的内部BclI片段。获得的质粒pUSE-Spec用于转化枯草芽孢杆菌168。如PCR显示，由于双交换重组事件的结果，所有测试的Sp-抗性转化体的yusE基因都被pUSE-Spec的Sp抗性盒破坏了。

为了构建枯草芽孢杆菌ykuV，使用分别含有BamHI和SalI限制性酶切位点的引物gggggatcccggcaaagtaagtcttgagg(SEQ ID NO：11)和ggggtcgacattgttctaaccgcaagcgc(SEQ ID NO：12)扩增1516-bp的DNA片段，其起自ykuU基因，终于rok基因。用BamHI和SalI切割扩增的片段，连接到BamHI-SalI-切割的pUC18中。用EcoRI和BsaWI从质粒pDG1727中切出Sp抗性盒，用于取代pUC18具有的ykuV拷贝的内在MunI-NgoMIV片段。获得的质粒pKUV-Spec用于转化枯草芽孢杆菌168。如PCR显示，由于双交换重组事件的结果，所有测试的Sp-抗性转化体的ykuV基因(枯草芽孢杆菌ykuV)都被pKUV-Spec的Sp抗性盒破坏了。

如下构建枯草芽孢杆菌ytpP。使用分别含有KpnI和PstI限制性酶切位点的引物gggggtacccattgccgtgttccactgtt(SEQ ID NO：13)和gggctgcagggcaaccgtatcctctttga(SEQ ID NO：14)扩增1386-bp的DNA片段，其起自ytoP基因，终于ytpQ基因。然后，用KpnI和PstI切割扩增的片段，连接到KpnI-PstI-切割的pUC18中。用HincII和StuI从质粒pDG1727中切出Sp抗性盒，克隆到ytpP基因中间唯一的BsaAI限制性酶切位点上。获得的质粒pTPP-Spec用于转化枯草芽孢杆菌168。如PCR显示，由于双交换重组事件的结果，所有测试的Sp-抗性转化体的ytpP基因(枯草芽孢杆菌ytpP)都被pTPP-Spec的Sp抗性盒破坏了。

从BSFA或HAFAN菌株保藏中心获得单一的ybdE、ydbP、ydfQ、StoA(ykvV)、yneN和yusE突变体，以及缺少携带bdbA和yosR基因的SPβ原噬菌体的菌株(Kobayashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A100：4678-4683，2003)。通过PCR验证质粒或抗生素抗性标记物的正确的染色体整合。

为了过表达来自肉葡萄球菌的氧化TDOR DsbA，使用了pXTC表达系统(Darmon等人，Appl.Environ.Microbiol 72：6876-6885，2006；Kouwen，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)。如下构建pXTC-ScdsbA，它携带了肉葡萄球菌的dsbA，其与枯草芽孢杆菌的mntA的核糖体结合位点和信号序列融合，并处于xylA启动子(P_xylA)的转录控制下。在第一轮PCR中，使用引物

pXTC_MntA_F(GGGGGACTAGTAAGAGGAGGAGAAATATGAGACAA；SEQ ID NO：5)和

pXTC_MntA_Scar_R(TTTTTGTGAGCATCCCGTTAAAGCAAAGGTCGC；SEQ ID NO：6)扩增92bp的片段，所述片段含有枯草芽孢杆菌的mntA的核糖体结合位点和信号序列。第二轮PCR的566bp片段获自用引物pXTC_Scar_F(ttaacgggatgcTCACAAAAAGACCCTGATTTA；SEQ IDNO：7)和

pXTC_Scar_R(GGGGGGGATCCTTATTTTTCTAGTAAATCTTTATATTCTT；SEQ ID NO：8)扩增肉葡萄球菌的dsbA基因。获得的两种PCR产物具有21个核苷酸的重叠。利用该重叠，可以不添加引物，在10轮PCR循环中将两种不同的片段融合。然后，用引物pXTC_MntA_F和pXTC_Scar_R在另外20轮PCR循环中PCR扩增融合的产物。将获得的637bp的产物克隆到pTOPO中。在序列验证后，从该质粒中用BamHI和SpeI切出融合的dsbA基因，并连接到质粒pXTC的相同限制性酶切位点中P_xylA的下游，获得质粒pXTC-ScdsbA。

使用质粒pXTC-ScdsbA，通过双交换重组将P_xylA ScdsbA盒与pXTC的Tc抗性标记(后文称为XTC-ScdsbA盒)一起整合到枯草芽孢杆菌168和枯草芽孢杆菌ItrxA的amyE基因座中。选择四环素抗性，并在含淀粉的平板上筛选AmyE-阴性表型，使我们能分别获得菌株枯草芽孢杆菌X-ScdsbA和枯草芽孢杆菌ItrxA X-ScdsbA。

实验结果

质粒pPSPhoA5具有在猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)的脂肪酶的前原区和成熟的大肠杆菌PhoA蛋白之间的融合，如Darmon等人(Appl.Environ.Microbiol 72：6876-6885，2006)所述。大肠杆菌PhoA是枯草芽孢杆菌中的TDOR活性的敏感报告子，因为该蛋白质含有两个二硫键，需要氧化型TDOR用于折叠成蛋白酶抗性的构象。特别在缺少BdbC和/或BdbD的条件下，未折叠的PhoA在枯草芽孢杆菌细胞壁和生长培养基的高蛋白水解环境中是易于降解的(Sarvas等人，Biochim.Biophys.Acta1694：311-327，2004)。这基本上提供了体内的蛋白酶保护测定，用于探测氧化型TDOR活性对分泌的PhoA的折叠效率。有趣的是，缺少完整的bdbA、ybdE、ydbP、ydfQ、ykuV、stoA、yneN、yosR、ytpP或yusE基因的菌株在大肠杆菌活性PhoA的分泌中都不受到显著影响。

然而，预料之外的是，缺失TrxA导致升高的PhoA分泌水平。使用Smits等人(J.Bacteriol.187：3921-3930，2005)描述的条件性trxA突变体菌株(ItrxA)可观察到该现象，因为TrxA对枯草芽孢杆菌的生长和活力是关键的(Kobayashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：11857-11862，1997；Scharf等人，J.Bacteriol.180：1869-1877)。在该菌株中，用IPTG依赖性P_spac启动子取代了trxA启动子区域(P_trxA)。枯草芽孢杆菌ItrxA在平板或培养液中的生长是严格的IPTG-依赖性的，不同于亲本菌株168。当枯草芽孢杆菌ItrxA的细胞生长在LB培养基中时，在25μM和更高的IPTG浓度下观察到野生型的生长速率。

为了研究细胞质TrxA水平对PhoA分泌的重要性，进一步分析了用质粒pPSPhoA5转化的ItrxA突变体菌株。通过如Darmon等人(Appl.Environ.Microbiol 72：6876-6885，2006)中所述的碱性磷酸酶活性测定和Western印迹，确定PhoA分泌到生长培养基中的水平。出于该目的，细胞生长在补充了25、100或500μM IPTG的LB培养基中。结果显示，当生长在存在25μM IPTG(图2)中时，ItrxA菌株分泌了至少1.5倍高于亲本菌株168的活性PhoA。在这些条件下，Western印迹几乎不能检测到细胞TrxA。当枯草芽孢杆菌ItrxA生长在存在500μM IPTG(图2)中时，PhoA的分泌与亲本菌株中观察到的水平相似，其与细胞TrxA的野生型水平一致。相比，亲本菌株168的PhoA分泌是不依赖生长培养基中的IPTG浓度的，生长培养基中缺少或存在IPTG(25μM至500μM)对该菌株中的TrxA水平没有可检测的影响。这些观察结果表明，在测试的IPTG浓度范围内，由ItrxA突变体分泌的活性PhoA的量与细胞中的TrxA的量成反比。

用质粒pKTH10转化时(所述质粒编码缺少二硫键的解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶AmyQ)，ItrxA突变体(25μM IPTG)和亲本菌株168的生长培养基中含有相当量的AmyQ。后一观察结果提示，ItrxA突变体菌株改善的PhoA分泌通常不是由于改善的蛋白质合成或分泌，而是由于改善的转运后折叠，导致成熟PhoA蛋白的蛋白酶抗性。该观点得到了这样的观察结果的验证，即，生长在存在25μM IPTG条件下的ItrxA突变体菌株的胞外蛋白质组与亲本菌株168的胞外蛋白质组是不可区分的(图2D)。

观察到由生长在存在25μM IPTG条件下的ItrxA突变体菌株对活性PhoA分泌的改善提出了以下问题：该增加是否仍然需要BdbC的活性。为了回答该问题，构建了含pPSPhoA5的ItrxA bdbC双突变菌株。重要的是，该双突变体表现出IPTG依赖性的生长，显示bdbC突变不抑制ItrxA突变。如图2所示，不论存在或缺少ItrxA突变，PhoA分泌仍然是强烈的BdbC-依赖性的。此外，当生长培养基中存在不同量的IPTG时，ItrxA bdbC体变体的PhoA分泌并不改变。这些发现提示，在TrxA缺失的条件下，PhoA折叠也需要BdbCD巯基氧化途径。

实施例3

TrxA和BdbC的细胞水平影响BdbD的氧化还原状态

为了测试TrxA的存在或缺少是否具有对BdbCD巯基氧化途径活性的影响，基本如Kobayashi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A100：4678-4683，2003)所述，用巯基-特异性交联试剂4-乙酰氨基-4’-马来酰亚胺-二苯乙烯-2，2’-二磺酸(AMS；Molecular Probes)验证BdbD的氧化还原状态。由于AMS的分子量，该试剂与了蛋白质中还原的半胱氨酸残基的交联将显著降低该蛋白质在SDS-PAGE期间的迁移率(Kobayashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100：4678-4683，2003)。BdbD仅含有2个半胱氨酸残基，是CxxC活性位点的一部分。为了研究BdbD的氧化还原状态，使用过夜培养来制备ItrxA菌株(25μM IPTG)、bdbC单突变体、ItrxA bdbC双突变体，或亲本菌株168的新鲜裂解液。

在LB培养基中生长细胞，并离心收集。在存在或缺少15mM AMS的条件下制备裂解液，通过将细胞沉淀重悬浮在25mM Tris-HCl，10mMEDTA，0.5M甘油，0.25mg/ml溶菌酶(pH 8.0)，和15mM AMS中进行制备。在37℃孵育30分钟后，将样品与缺少还原剂的SDS-PAGE上样缓冲液混合。在细胞裂解过程中的共标记足以区分不同氧化还原状态的BdbD。值得注意的是，AMS只共价结合还原的BdbD分子中的游离巯基。煮沸样品7分钟，通过非还原SDS-PAGE分离结合或未结合AMS的BdbD分子。最后，通过使用特异性多克隆抗体的Western印迹和免疫检测，将不同的BdbD种类显色。使用ChemiGenius XE²生物成像系统和GeneTools分析软件包(Synoptics)，确定结合或未结合AMS的BdbD种类的相对量。所有的实验都重复至少4次。

亲本菌株168的略少于50％的BdbD分子被AMS标记。相反，在ItrxA菌株中，被AMS标记的BdbD分子显著较少，而在bdbC或ItrxA bdbC突变菌株中被AMS标记的BdbD分子显著较多。引人注意的是，在指数生长的枯草芽孢杆菌168、ItrxA和bdbC的细胞中，这些相对差异似乎更加明显。这些观察结果表明，与亲本菌株相比，ItrxA菌株中显著更多的BdbD分子是氧化的，相反，bdbC突变导致较少数量的氧化BdbD分子。此外，用在缺少AMS的条件下制备的菌株裂解液的对照实验表明，BdbD作为一条带迁移。综上所述，这些发现表明细胞质TrxA的水平以BdbC-依赖性的方式影响BdbD的氧化还原状态。

实施例4

DsbA的表达增加PhoA分泌

增加枯草芽孢杆菌巯基氧化能力的备选潜在方法是诱导已知巯基氧化酶的过表达。然而，到目前为止，增加BdbC和BdbD水平的尝试尚未成功。因此，研究了表达异源性氧化酶的可能性。

先前的研究已证实，枯草芽孢杆菌BdbD的同源物——金黄色葡萄球菌的主要氧化酶DsbA(本文中称为SaDsbA)能够补偿在活性PhoA分泌中BdbC和BdbD的缺失(Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)。此外，当亲本菌株168中表达SaDsbA时，观察到约1.5-2.0倍的大肠杆菌PhoA分泌增加，与上面TrxA缺失时观察到的增加相似(参见实施例2)。

然而，由于已知金黄色葡萄球菌是一种危险的病原体(Massey等人，Nat.Rev.Microbiol.4：953-958，2006；Sibbald等人，Microbiol.Mol.Biol.Rev.70：755-788，2006)，因此SaDsbA用于生物技术目的的应用潜力是有限的。出于该理由，实施从金黄色葡萄球菌的非病原性近亲中搜索DsbA蛋白。dsbA基因的最佳来源是肉葡萄球菌，其在奶酪和干香肠发酵中被广泛用作引酵物。因此，该生物具有通常认为安全(Generaly Recognized AsSafe(GRAS))状态。因此，含有源自该葡萄球菌物种的基因的枯草芽孢杆菌菌株因此应该可以更普遍的被工业应用接受。

通过BlastP搜索肉葡萄球菌菌株TM300的已测序的基因组，鉴定出金黄色葡萄球菌DsbA的肉葡萄球菌同源物(本文中称为“ScDsbA”，SEQID NO：4)(51％相同的氨基酸)。类似于SaDsbA，ScDsbA蛋白与枯草芽孢杆菌BdbD同源(36％相同的氨基酸)。为了在枯草芽孢杆菌中表达ScDsbA，使用Kouwen等人(Mol.Microbiol.64：984-999，2007)描述的木糖诱导型pXTC表达系统表达金黄色葡萄球菌SaDsbA。出于该目的，将编码成熟ScDsbA脂蛋白的序列与枯草芽孢杆菌mntA基因的核糖体结合位点和信号序列融合，所述mntA基因编码该生物中丰富表达的脂蛋白(Antelmann等人，Genome Res.11：1484-1502，2001)。当将含有该杂合ScdsbA基因的XTC-ScdsbA盒整合到枯草芽孢杆菌168染色体中时，获得了细胞相关的ScDsbA的木糖诱导型表达(含有该盒的菌株现称为X-ScdsbA)。

针对SaDsbA的抗体用于ScDsbA的免疫检测。这些抗体与ScDsbA交叉反应。如预期，ScDsbA的细胞水平依赖于生长培养基中添加的木糖的量。当用1.0％或更多的木糖诱导X-ScdsbA细胞时，观察到最高水平的细胞ScDsbA，而当细胞生长在缺少木糖的条件下时，没有可检测的ScDsbA。

为了评估ScDsbA表达对胞外活性大肠杆菌PhoA积累的影响，用质粒pPSPhoA5转化枯草芽孢杆菌菌株X-ScdsbA。为了比较，平行的测定了都用质粒pPSPhoA5转化的菌株X-SadsbA、ItrxA(25μM IPTG)以及组合菌株X-ScdsbA ItrxA和X-ScdsbA ItrxA。结果表明，与亲本菌株相比，ScDsbA的表达导致增加的活性PhoA分泌(图3，白色条形)。ScDsbA表达增加胞外PhoA水平的程度与SaDsbA表达时增加的程度相当，表明当在枯草芽孢杆菌中表达时，这些蛋白质是功能上可互换的。此外，表达ScDsbA或SaDsbA，以及缺失TrxA导致胞外PhoA水平可比较的增加约1.5-2.0倍。显著地，当TrxA缺失与ScDsbA或SaDsbA表达相组合时，实现了更高水平的活性胞外PhoA，特别是在组合的X-ScdsbA ItrxA菌株中(图5A，白色条形)。

在不同的生长培养基样品中的PhoA活性水平与在各样品中检测到的成熟PhoA蛋白的水平相关良好，如Western印迹所示。与表达PhoA的亲本菌株相比，在所有的测试突变体菌株中都观察到PhoA的显著较少的胞外降解产物。在缺失TrxA的ItrxA菌株中观察到最低量的PhoA降解产物。此外，在含有ItrxA突变的菌株中，未加工形式的原-PhoA蛋白是可见的，对于X-SadsbA和X-ScdsbA菌株，也存在较低程度的上述情况。在缺失TrxA的X-ScdsbA ItrxA菌株的培养基级分中观察到最高量的PhoA蛋白。综上所述，这些结果证实，细胞质TrxA和/或胞外TDOR水平的调控导致分泌型活性PhoA的升高的水平。

实施例5

氧化还原活性培养基化合物有利于优化水平的分泌型PhoA

已报道葡萄球菌DsbA促进大肠杆菌PhoA胞外积累的活性依赖于生长培养基中氧化还原活性化合物。这是通过在具有或缺少半胱氨酸/胱氨酸的合成培养基中生长产生DsbA的枯草芽孢杆菌显示的(Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)。因此，研究了当细胞生长在富LB培养基中时，添加过量的氧化还原活性化合物(例如，半胱氨酸或胱氨酸)是否可以提高该DsbA活性。出于该目的，在存在100μg/ml添加的胱氨酸(即，氧化型半胱氨酸)或半胱氨酸的条件下，以平行培养物的形式生长所有的TrxA缺失-和/或DsbA-表达的菌株。向ItrxA X-ScdsbA菌株中添加胱氨酸或半胱氨酸导致强烈增加的胞外积累的PhoA水平。当添加半胱氨酸时，该增加是最显著的。此外，对于X-ScdsbA菌株也观察到了该阳性趋势，但是刺激的程度低于ItrxA X-ScdsbA菌株。对于其它菌株，向生长培养基中添加半胱氨酸或胱氨酸未导致统计学显著增加的胞外PhoA水平。Western印迹验证了PhoA活性数据，表明所有观察到的活性的增加与增加的PhoA蛋白质水平是相关的。特别是，即使在亲本菌株168中，添加半胱氨酸也导致了降低的PhoA降解产物积累。

为了研究生长培养基中的胱氨酸或半胱氨酸是否将影响已知的TDOR(所述TDOR影响活性PhoA的分泌)，研究了DsbA、BdbD和TrxA的细胞水平。这些蛋白的水平不受添加的胱氨酸或半胱氨酸的存在或缺乏的影响。

向表达肉葡萄球菌DsbA的菌株的培养基中添加半胱氨酸或胱氨酸导致增加的胞外活性PhoA水平，这一观察结果与目前记载的金黄色葡萄球菌DsbA活性的半胱氨酸依赖性(Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)是一致的。很可能的是，这涉及如下事实：所有的(已测序的)葡萄球菌缺少催化期间用于DsbA再氧化的BdbC-样醌还原酶的(Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999，2007)。当细胞生长在LB培养基中时，DsbA活性对氧化还原活性培养基化合物的需要是不明显的，因为该生长培养基已经含有了此类组分。然而，我们目前使用肉葡萄球菌DsbA的发现表明，对于该巯基氧化酶的最优活性，氧化还原活性组分只以有限的量存在。应该注意到，向培养基中添加半胱氨酸或胱氨酸都具有相似的效果。这很可能是由于这样的事实，在存在分子氧的条件下，半胱氨酸易于氧化成胱氨酸。事实上，添加半胱氨酸似乎比添加胱氨酸本身更有效，这可以通过胱氨酸的低溶解性来解释。此外，Smits等人(J.Bacteriol.187：3921-3930，2005)近期的研究提示，TrxA-缺失的细胞是半胱氨酸营养缺陷型的，因为半胱氨酸合成和摄入的基因以显著升高的水平表达，且向生长培养基中添加半胱氨酸可以逆转严重的TrxA-缺失细胞的生长抑制。在这些条件下，半胱氨酸实际上可以发挥保护多种细胞质蛋白免受不可逆巯基氧化的作用(Hochgrafe等人，J.Biol.Chem.282：25981-25985，2007；Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 104：8743-8748，2007)。因此，为了增加表达肉葡萄球菌DsbA的菌株的氧化电位，半胱氨酸相对于胱氨酸是优选的。

Claims (26)

1.遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其包含i)降低宿主细胞中TrxA多肽活性的遗传修饰，和ii)编码来自肉葡萄球菌的异源的DsbA多肽的核酸序列，其中所述DsbA多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

2.权利要求1的宿主细胞，其中所述TrxA多肽由选自以下的氨基酸序列组成：

i)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，

ii)由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的氨基酸序列。

3.权利要求1-2任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。

4.权利要求1-2任一项的宿主细胞，其中所述遗传修饰是缺失突变、取代突变或插入突变。

5.权利要求1-2任一项的宿主细胞，其中所述遗传修饰是插入诱导型启动子以控制基因表达。

6.权利要求1-2任一项的宿主细胞，其中TrxA多肽的表达被降低。

7.权利要求1-6任一项的宿主细胞的培养物。

8.权利要求7的培养物，其中所述培养物生长在含有氧化还原活性化合物的培养基中，其中所述氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。

9.遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其包含：

i)降低宿主细胞中TrxA多肽活性的遗传修饰，其中TrxA多肽由SEQID NO：2的氨基酸序列组成，和

ii)编码异源非致病性葡萄球菌DsbA多肽的核酸序列，其中DsbA多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

10.权利要求1-2或权利要求9任一项的宿主细胞，还包含编码含二硫键的蛋白质的核酸序列。

11.生产含二硫键的蛋白质的方法，其包括在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长权利要求10的宿主细胞，其中该宿主细胞生产含二硫键的蛋白质并将蛋白质分泌到培养基中，其中所述氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。

12.在芽孢杆菌宿主细胞中生产含二硫键的蛋白质的方法，包括

i)降低宿主细胞中TrxA多肽的活性，

ii)将编码来自肉葡萄球菌的异源的DsbA多肽的核酸序列引入宿主细胞中，其中所述DsbA多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，和

iii)在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长宿主细胞，其中宿主细胞产生含二硫键的蛋白质并将蛋白质分泌到培养基中，其中所述氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。

13.权利要求12的方法，其中所述TrxA多肽选自

i)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，

ii)由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的氨基酸序列。

14.权利要求12-13任一项的方法，其中通过用包含编码DsbA多肽的核酸序列的质粒转化宿主细胞来引入DsbA多肽。

15.权利要求12-13任一项的方法，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。

16.权利要求12-13任一项的方法，其中TrxA多肽活性的降低由TrxA基因的突变引起。

17.权利要求16的方法，其中所述突变是缺失突变、取代突变或插入突变。

18.权利要求12-13任一项的方法，其中所述降低的TrxA多肽活性由诱导型启动子控制。

19.在芽孢杆菌宿主细胞中生产含二硫键的蛋白质的方法，包括

i)降低宿主细胞中TrxA多肽的表达，其中TrxA多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，

ii)向宿主细胞引入异源葡萄球菌DsbA多肽的表达，其中DsbA多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，和

iii)在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长宿主细胞，其中所述宿主细胞产生含二硫键的蛋白质并将蛋白质分泌到培养基中，其中所述氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇。

20.改善重组蛋白质的蛋白质折叠的方法，包括：

a)在允许含二硫键的蛋白质表达并提高正确折叠的条件下，在含有氧化还原活性化合物的培养基中生长遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述氧化还原活性化合物选自半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇(BME)、1，4-二硫苏糖醇(DTT)、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、N-乙基马来酰亚胺或分支硫醇，其中所述宿主细胞(i)表现出降低的TrxA多肽活性，(ii)表现出来自肉葡萄球菌的DsbA多肽的增加的表达，其中所述DsbA多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，和(iii)分泌异源的含二硫键的蛋白质；以及

b)任选地，从培养基中分离所述蛋白质。

21.权利要求20的方法，其中所述TrxA多肽选自

i)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，

ii)由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的氨基酸序列。

22.权利要求20-21任一项的方法，其中通过用包含编码DsbA多肽的基因的质粒转化宿主细胞来引入所述DsbA多肽。

23.权利要求20-21任一项的方法，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。

24.权利要求20-21任一项的方法，其中TrxA多肽活性的降低由TrxA基因的突变引起。

25.权利要求24的方法，其中所述突变是缺失突变、取代突变或插入突变。

26.权利要求20-21任一项的方法，其中所述降低的TrxA多肽活性由诱导型启动子控制。

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