CN102008725B - 人UTP14a蛋白表达抑制剂在制备细胞增殖抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人UTP14a蛋白表达抑制剂在制备细胞增殖抑制剂中的应用。p53蛋白通过激活或抑制下游基因的表达，引起细胞周期停滞、DNA的损伤后修复和细胞凋亡等。本发明发现人UTP14a蛋白的表达下调可引起p53蛋白水平的升高，即人UTP14a蛋白表达抑制剂可以促进细胞中p53蛋白水平升高，从而抑制细胞增殖。本发明有助于对于细胞增殖和凋亡的研究，对抗癌药物的开发具有深远影响。
Description
技术领域
本发明涉及人UTP14a蛋白表达抑制剂在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
背景技术
核仁(nucleolus)是一个高度致密、动态的亚细胞结构。核仁的主要功能是为核糖体生物发生提供场所，核糖体生物发生包括三个重要的步骤：1)核糖体RNA转录；2)核糖体RNA的加工；3)核糖体大、小亚基的组装。哺乳动物细胞中，47S的rRNA前体在核仁由RNA polymerase I转录生成。47S的rRNA前体含有三个转录区以及四个转录间隔区。三个转录区包括18S、5.8S、28S rRNA序列。四个转录间隔区包括：5’外部转录间隔区(5’external transcribe spacer，5’ETS)，位于18S rRNA序列的上游；两个内部转录间隔区(internal transcribe spacer，ITS1，ITS2)，分别位于5.8S rRNA序列的两侧；以及较短的3’外部转录间隔序列(3’external transcribe spacer，3’ETS)位于28S rRNA的下游。47S rRNA前体在核酸内切酶作用下经过剪切加工生成成熟的18S、5.8S和28S rRNA。5S rRNA由RNA polymerase III转录，在核浆转录完成后被转运至核仁。在真核生物中18S rRNA和34种核糖体小亚基蛋白组装成40S小亚基，28SrRNA、5S rRNA、5.8S rRNA和49种核糖体大亚基蛋白组成60S大亚基。
rRNA的加工过程包括rRNA的修饰与剪切。rRNA的修饰与剪切主要由小核仁核糖核蛋白体颗粒(small nucleolar ribonucleoprotein particals，snoRNPs)来完成。snoRNPs由小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)和相关蛋白结合而成，通过其snoRNA与核糖体RNA前体碱基配对介导核糖体RNA前体的修饰和剪切。
在18S rRNA的剪切加工过程中U3 snoRNA起重要作用。U3 snoRNA在真核细胞中普遍存在，生化与基因分析显示U3 snoRNA主要通过与核糖体RNA前体通过碱基配对来介导核糖体RNA前体的剪切。U3 snoRNA和40余种蛋白组成核糖核蛋白体复合物(U3snoRNPs，U3 snoRNA particle)发挥剪切加工作用。在酵母中U3 snoRNPs所含的40余种蛋白包括：四种与U3 snoRNA结合的核心蛋白：fibrillarin，Nop58p，Nop56p，Snu13p(在哺乳动物中是15.5kDa蛋白)；六种与U3 snoRNA特异结合的蛋白：Sof1，Mpp10，Imp3，Imp4，Dhr1，Rrp9；五种核糖体蛋白Rps4，Rps6，Rps7，Rps14和Rps28；还包括参与18S rRNA加工的蛋白Rrp5和一些与U3 snoRNA结合的蛋白。这些与U3 snoRNA结合的蛋白命名为UTP(U three protein)。目前在酵母中发现的有Utp1-17，18，20-22。小亚基加工体(small subunit processome，SSU)是U3 snoRNP中的一组蛋白，它们是与U3 snoRNA结合的核仁蛋白，参与18S rRNA加工。Bernstein等制定了鉴定SSU组分的标准：(1)定位于核仁；(2)与U3 snoRNA结合；(3)参与18S rRNA的加工。在脊椎动物，参与5.8和28S rRNA前体的剪切生成过程的是U8 snoRNPs，U8 snoRNPs由U8 snoRNA与相关蛋白结合而成。
核糖体生物发生是细胞的一个重要生命过程，与细胞生长和增殖等正常生命活动的维持密切相关，因此受到严密的调控。当核糖体生物发生发生异常时，会引起p53的改变。在正常细胞中p53以低水平无活性形式存在，p53的稳定性与活性调控的主要机制包括调控p53的亚细胞定位、p53的降解调控和p53的翻译后修饰。在大多数应激情况下p53主要通过翻译后修饰快速活化并维持其稳定性。蛋白酶体-泛素系统是p53主要的降解方式。Mdm2是p53的E3泛素连接酶，介导p53泛素依赖蛋白酶体依赖的降解。Mdm2结合p53后，促进p53蛋白在26S的蛋白酶体中降解。Mdm2也是p53下游的靶基因产物，p53反馈调节Mdm2的转录。Mdm2结合p53的N端转录活性区后，p53的转录活性被阻断，Mdm2的表达水平也会随之减少。p53与Mdm2的这种相互作用形成了自身反馈环来维持Mdm2和p53的正常水平。当核糖体RNA的转录和加工受到干扰时，核糖体蛋白如RPL11，RPL23，RPL5，RPS7等与Mdm2特异结合，使Mdm2对p53的泛素连接酶活性受到抑制，p53的活性和稳定性增加。这一通路又被称为RP-Mdm2-p53信号途径。在这一通路中起中心作用的是p53蛋白。
在应激反应中p53蛋白稳定性增加、水平增高并通过翻译后修饰及四聚化变成能结合DNA的活性形式，聚集于细胞核。作为一种特异的转录因子p53在细胞核中激活p21Wafl/Cipl15，16和其它一些生长停滞基因产物如GADD45(growth arrest and DNA damageinduction gene 45)的转录表达，p21和GADD45能够引起细胞周期停滞并刺激DNA修复。如果DNA损伤无法修复，由p53诱导促凋亡相关基因表达使细胞发生程序性死亡。因此p53通过激活或抑制下游基因的表达，引起细胞周期停滞、DNA的损伤后修复和/或细胞凋亡等。
发明内容
本发明的目的是提供人UTP14a(hUTP14a)蛋白表达抑制剂在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
本发明提供了人UTP14a蛋白表达抑制剂的如下应用：
(1)在制备细胞增殖抑制剂中的应用；
(2)在制备促进细胞中p53蛋白表达的产品中的应用；所述p53蛋白如序列表的序列3所示；
所述人UTP14a蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
所述人UTP14a蛋白表达抑制剂可为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种。
所述细胞可为U2OS细胞或HeLa细胞。
本发明还保护一种细胞增殖抑制剂，为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种。
所述细胞可为U2OS细胞或HeLa细胞。
本发明还保护一种促进细胞中p53蛋白水平升高的产品，为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种。
所述细胞可为U2OS细胞或HeLa细胞。
本发明在MCF-7细胞中干扰hUTP14a后通过流式细胞计数对细胞周期进行了分析，结果发现hUTP14a表达减少后S期细胞减少，而G2/M的细胞数无明显变化。该结果提示hUTP14a干扰后引起的p53增多抑制了细胞周期从G1期向S期转变。
小亚基加工体(SSU)参与rRNA前体在A0，A1，A2位点的剪切最后形成18S rRNA。在剪切加工过程中，U3 snoRNA与rRNA前体通过碱基配对介导U3 snoRNPs与rRNA前体的相互作用。本发明中发现hUTP14a和1A6/DRIM(UTP20)在细胞核仁内存在共定位，hUTP14a与U3 snoRNA相互作用，是U3 snoRNPs的组分之一，阻断hUTP14a蛋白的表达可减少18S rRNA的生成，hUTP14a可与1A6/DRIM(UTP20)结合。以上结果说明，hUTP14a是SSU加工体组成成分之一，参与18S rRNA的加工。
rDNA的转录和rRNA前体的加工是核糖体生物发生的关键步骤。核糖体生物发生包括三个重要的步骤：①核糖体RNA和核糖体蛋白的协调表达；②核糖体RNA的加工；③40S和60S核糖体亚基的组装。40S和60S核糖体亚基从核仁被转运至核浆，最终转运至胞浆并在胞浆中组装成80S核糖体并为蛋白质的合成提供场所。三个步骤中任何一个受到干扰都会引起核仁应激，触发一些核糖体蛋白(如RPL11，RPL23，RPL5，RPS7等)与Mdm2特异结合，使Mdm2对p53的泛素连接酶活性受到抑制，p53的活性和稳定性增加。这一通路又被称为RP-Mdm2-p53信号途径。p53的半衰期很短，正常情况下保持在低水平，在细胞内外的应急信号作用下p53能够被诱导活化而稳定在较高的蛋白水平。应急情况下p53蛋白水平增高并从胞浆转移至胞核，在细胞核中主要作为一种序列特异的转录因子发挥功能，激活p21Wafl/Cipl15，16和其它一些生长停滞基因产物如GADD45(GADD45，growth arrest and DNA damage induction gene 45)的转录表达，p21和GADD45能够引起细胞周期停滞并刺激DNA修复。如果DNA损伤无法修复，由p53诱导促凋亡相关基因表达启动细胞发生程序性死亡。因此p53通过激活或抑制下游基因的表达，引起细胞周期停滞、DNA的损伤后修复和细胞凋亡等。本发明发现，hUTP14a的表达下调可引起p53蛋白水平的升高，hUTP14a过表达能引起内源p53水平的降低，在翻译途径被阻断后，hUTP14a过表达使p53的半衰期缩短。以上结果说明，hUTP14a可促进p53蛋白的降解。
p53蛋白的降解分为蛋白酶体非依赖和蛋白酶体依赖两种降解途径。蛋白酶体非依赖的降解途径较少见主要指钙离子依赖的calpain蛋白酶剪切途径。蛋白酶体依赖的p53蛋白降解可被蛋白酶体抑制剂阻断，并且蛋白酶体依赖的p53蛋白降解途径又根据是否依赖于泛素分为泛素非依赖的蛋白媒体途径和泛素依赖的蛋白媒体途径。当DNA损伤应激反应时，细胞p53蛋白的水平主要通过泛素依赖的蛋白酶体降解途径来调控。泛素依赖的蛋白媒体途径中E3泛素连接酶起着重要的作用。p53蛋白的E3泛素连接酶最常见的是HECT-domain，RING-finger两种类型。HECT-domain型的E3泛素连接酶较常见的有ARF-bp1、E6AP(HPVE6相关蛋白)。RING-finger类型的E3泛素连接酶有Mdm2、pirh2、COP1、SCF等。Mdm2是p53最重要的特异内源E3连接酶。并且Mdm2依赖泛素依赖的蛋白酶体途径是p53蛋白最主要的降解途径。本发明中，在U2OS细胞中转染hUTP14a后，用MG132阻断蛋白酶体对蛋白质降解后对p53蛋白水平进行进行分析。结果显示MG132处理后，hUTP14a不再降解p53蛋白，这一结果说明hUTP14a通过蛋白酶体途径降解p53蛋白。p53、Flag-hUTP14a质粒共转染不表达p53蛋白的H1299细胞，转染后用抗p53蛋白单克隆抗体进行免疫沉淀实验，在p53蛋白的免疫沉淀中检测到hUTP14a，说明hUTP14a与p53蛋白在细胞内结合。用大肠杆菌中诱导表达的GST-p53融合蛋白与体外转录翻译的Flag-hUTP14a蛋白进行的GST pull-down实验说明hUTP14a与p53蛋白直接结合。对p53蛋白进行修饰的蛋白与p53存在直接结合。发明人发现hUTP14a通过242-267和646-771氨基酸序列与p53蛋白的C端和M段结合。
本发明有助于对于细胞增殖和凋亡的研究，对抗癌药物的开发具有深远影响。
附图说明
图1为人类UTP14a与小鼠和酵母同源物的比较。
图2为Western blot对hUTP14a多克隆抗体的鉴定。
图3为用hUTP14a多克隆抗体检测UTP14a在多种细胞的细胞核和细胞浆中的表达。
图4为人UTP14a在细胞内的定位。
图5为人UTP14a siRNA通过抑制人UTP14a抑制p53蛋白的降解。
图6为人UTP14a与p53结合。
图7为人UTP14a siRNA抑制细胞增殖。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。Hela细胞购自CCL-2TM。U2OS细胞购自
HTB-96TM。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
siRNA寡核苷酸片段由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下：
siRNA-NC：5’-ACUACCGUUGUUAUAGGUG-3’(序列表的序列4)；
siRNA-A-1：5’-AAUCCGCUAGUUCUUCCUG-3’(序列表的序列5)；
siRNA-A-2：5’-UUAAUGAGAACCGGCGUC-3’(序列表的序列6)；
siRNA-A-3：5’-UGUGGAUCCGUUCAAUCU-3’(序列表的序列7)。
10×PBS(pH7.4)：80g NaCl，14.4g Na2HPO4，2g KCl，2.4g KH2PO4，溶于1000ml去离子水中；10×PBS(pH7.4)稀释至10倍体积即为PBS。
细胞总蛋白裂解液(EBC250)：0.5％NP-40，250mM NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，1mM PMSF，1mM NaF，1mM Na3VO4，2μg/ml亮肽素(leupeptin)，2μg/ml蛋白酶抑制剂(aprotinin)。
细胞浆蛋白裂解液：10mM HEPES(pH7.9)，1.5mM MgCl2，10mM KCl，0.5mM DTT，0.5mM PMSF，0.2mM pefa。
细胞核蛋白提取液：50mM Tris-HCl(pH7.4-8.0)，450mM NaCl，，1％ NP-40，20％glycerol，2mM DTT，1mM PMSF，0.2mM Na3VO4，5mM β-glycerophosphate。
实施例1、hUTP14a蛋白的发现和生物信息学分析
在对核仁蛋白1A6/DRIM(Xing X.，Du，X.，Lu，Z.，Ning，T.，Su，X.，Ke，Y.Characterization of the promoter of 1A6/DRIM，a novel cancer-related gene andidentification of its transcriptional activator.Gene 2005，344：161-169)进行研究时，发明人以1A6/DRIM为诱饵蛋白，通过酵母双杂交得到了与1A6/DRIM相互作用的蛋白hUTP14a(Human U three protein 14a)。
hUTP14a蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示。hUTP14a蛋白定位于人类染色体Xq25，cDNA全长2316bp，编码长为771个氨基酸残基的蛋白产物。利用Clustal X软件将UTP14a蛋白与数据库所有的蛋白质序列进行比对，结果显示UTP14a蛋白与小鼠、酵母Utp14a同源(比对见图1)。
实施例2、相关重组质粒的制备
一、重组质粒pCI-neo-Flag(含有Flag的重组质粒)的制备
1、合成DNA片段pCI-Flag-pl3-F和DNA片段pCI-Flag-pl3-R，将DNA片段pCI-Flag-pl3-F和DNA片段pCI-Flag-pl3-R通过复性形成双链DNA。
pCI-Flag-pl3-F：5’-CTAGACCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATTCAAGCTTGGGCCCGGTACCGCTAGCGC-3’；
pCI-Flag-pl3-R：5’-GGCCGCGCTAGCGGTACCGGGCCCAAGCTTGAATTCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGT-3’。
2、用限制性内切酶NheI和NotI双酶切步骤1的双链DNA，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶NheI和NotI双酶切质粒pCI-neo(Promega公司)，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pCI-neo-Flag。
二、重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a(含有Flag和hUTP14a的重组质粒)的制备
1、以HeLa细胞的总RNA为模板，用F-1和R-2316组成的引物对进行RT-PCR扩增，得到PCR扩增产物(UTP 14a全长cDNA)
F-1：5’-ATCG GAATTC CTCGAG atg act gcg aac cgg ctt-3’
R-2316：5’-ATCG GGTACC-atc tac aga gca ttt ctt cag-3’
2、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切重组质粒pCI-neo-Flag，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a。
三、重组质粒pCI-neo-UTP14a(含有hUTP14a的重组质粒)的制备
1、以HeLa细胞的总RNA为模板，用F-1和R-2316组成的引物对进行RT-PCR扩增，得到PCR扩增产物(UTP14a全长cDNA)
F-1：5’-ATCG GAATTC CTCGAG atg act gcg aac cgg ctt-3’
R-2316：5’-ATCG GGTACC-atc tac aga gca ttt ctt cag-3’
2、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切质粒pCI-neo，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pCI-neo-UTP14a。
实施例3、hUTP14a多克隆抗体的制备、纯化和特异性鉴定
一、hUTP14a多克隆抗体的制备、纯化
利用DNAstar软件，对UTP14a蛋白的全长一级结构进行分析，选择具有较高的亲水性和抗原性、同时表面暴露性较强的多肽作为抗原，三条抗原多肽的氨基酸序列如下：
P1：DGKNRRKLAERSEASLK；针对自氨基末端第54-70位氨基酸残基；
P2：QQSERTPNNRPDAPKEKKKKEQM；针对自氨基末端第536-558位氨基酸残基；
P3：QRNPKRITTRHKKQLKKC；针对自氨基末端第751-768位氨基酸残基。
分别将上述三条多肽与血蓝蛋白(KLH)偶联，得到三种偶联物；将三种偶联物等摩尔混合后免疫新西兰兔(购自北京大学医学部动物中心)。
三种偶联物混合(均为100ug)，用PBS稀释至1ml后与等量的弗氏佐剂充分混合，进行初次免疫(于两足蹠部各0.25ml进行皮下注射，其余0.5ml后背部多点皮下注射)；之后每2周加强免疫1次，采用使用同等剂量的多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合后全部后背皮下多点注射(Manabu Nakayama，Reiko Kikuno and Osamu Ohara.Protein-Protein Interactions Between Large Proteins：Two-Hybrid ScreeningUsing a Functionally Classified Library Composed of Long cDNAs.Genome Res.，2002，12：1773-1784)。第2次加强免疫后14天取兔耳源静脉血样通过ELISA检测效价，至效价达1∶105(体积比)以上后将免疫兔处死，心脏取血获得血清。
将血清用PBS稀释后进行亲和层析，亲和层析的具体参数：亲和层析柱是将三条抗原多肽(P1、P2和P3)偶联的Sepharose 4B亲和层析柱上得到的；将血清上样于亲和层析柱，4℃孵育过夜；PBS冲洗柱料后使用pH2.4、0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱抗体，收集洗脱液；将洗脱液用pH2.4的0.1mol/L的Tris-HCl(pH9.0)中和并透析至PBS中，获得抗体1(Ab1)。抗体1作为hUTP14a多克隆抗体，进行后续试验。用BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)检测抗体1的浓度。
二、hUTP14a多克隆抗体的特异性鉴定
为鉴定hUTP14a多克隆抗体的特异性，在Hela细胞中分别转染重组质粒pCI-neo-UTP14a和重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a，同时用重组质粒pCI-neo-Flag作为对照。转染24小时后收取细胞核蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后转至PVDF膜，用抗Flag抗体M2(Sigma，F3165)和hUTP14a多克隆抗体进行Western blot分析。如图2A所示，Flag-hUTP14a蛋白由于Flag的存在比内源的hUTP14a略大。hUTP14a的多克隆抗体可以同时识别外源的hUTP14a蛋白、Flag-hUTP14a蛋白和内源的hUTP14a蛋白。抗Flag抗体M2仅特异识别外源表达的Flag-hUTP14a(图2B)。这一实验结果表明：制备的hUTP14a多克隆抗体可以特异的识别hUTP14a蛋白，同时正确的克隆了编码hUTP14a的质粒。
实施例4、UTP14a在多种细胞系的表达及在细胞内的定位
为明确UTP14a在多种细胞系的表达情况，提取十二种细胞系的细胞核蛋白和细胞浆蛋白，经SDS-PAGE电泳分离、转膜后，分别用Topoimerase I多克隆抗体、Rho A单克隆抗体和hUTP14a多克隆抗体进行Western blot分析。如图3所示：细胞核蛋白Topoimerase I仅在细胞核蛋白中检测到，而细胞浆蛋白Rho A仅在细胞浆蛋白中检测到，说明细胞核和细胞浆之间没有互相污染；hUTP14a在这十二种细胞都有表达且只存在于细胞核蛋白中。这说明hUTP14a在各细胞系广泛表达，且主要定位于细胞核。
利用抗hUTP14a多克隆抗体和抗1A6/DRIM单克隆抗体进行双色荧光免疫染色，在激光共聚焦显微镜下进行观察。1A6/DRIM显示为红色，hUTP14a显示为绿色，同时用DAPI染核，为蓝色。图4A显示hUTP14a与1A6/DRIM共同定位于细胞核仁内。
为进一步验证hUTP14a在细胞内的定位，将GFP-UTP14a转染细胞，DAPI染核后荧光显微镜下观察，图4B显示GFP-UTP14a与内源UTP14a呈现同样的定位。为进一步确定正确克隆了编码hUTP14a的质粒，将重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a转染Hela细胞，转染24小时后固定，用兔抗核仁素(nucleolin)抗体和鼠抗Flag抗体M2进行双色荧光免疫染色，在激光共聚焦显微镜下进行观察。核仁素用FITC标记的羊抗兔IgG检测，显示为绿色，Flag-hUTP14a用TRITC标记的羊抗鼠IgG检测，显示为红色；用DAPI染核，为蓝色。图4C显示，Flag-hUTP14a(红色)与核仁素(绿色)在细胞核仁内存在共定位。
实施例5、UTP14a的表达引起p53蛋白通过蛋白酶体降解
一、抑制hUTP14a的表达引起细胞内p53的水平升高
(一)siRNA转染细胞
将siRNA(siRNA-A-1、siRNA-A-2、siRNA-A-3或siRNA-NC)转染HeLa细胞，具体步骤如下：
1、将生长状态良好的细胞接种至35cm2培养瓶中，至细胞密度达80％左右。
2、将siRNA溶于140ul DEPC水中，使终浓度约为20uM；然后95℃ 4min，70℃10min，室温放置30min使其复性。
3、在无血清培养基中，通过脂质体(LipofectamineTM 2000，购自Invitrogen公司)将siRNA转染细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
4、6h后，换上含有10％(体积百分含量)FCS的培养基。
(二)鉴定试验
转染细胞72小时后，通过Western blot分析hUTP14a的表达情况和p53蛋白水平。
1、分析hUTP14a的表达情况
(1)提取细胞核蛋白
①细胞用冷的PBS洗两次，再加1ml冷的PBS刮取细胞入1.5ml EP管，12,000rpm离心15秒，取沉淀。
②沉淀中加入约3倍体积的细胞浆蛋白裂解液重悬细胞，12,000rpm振荡10秒钟，冰上放置10分钟。
③12,000rpm离心15秒，取沉淀(上清为细胞浆提取物)。
④向沉淀中加入约3倍体积的细胞核蛋白提取液重悬细胞，2,000rpm振荡10秒钟，冰上放置15分钟。
⑤4℃、12,000rpm离心30分钟，收集上清，即为细胞核提取物。
(2)检测细胞核蛋白中hUTP14a的表达情况
将细胞核提取物进行8％SDS-PAGE凝胶电泳，然后进行Western Blot(以Actin为上样量对照)，一抗为实施例3制备的hUTP14a多克隆抗体(抗体1)。
结果见图5A，在上样量基本一致的情况下，转染siRNA-A-1、siRNA-A-2和siRNA-A-3的细胞的细胞核内hUTP14a表达被沉默。
2、分析细胞中p53蛋白的水平
(1)提取细胞总蛋白
①细胞用冷的PBS洗两次，再加1ml冷的PBS刮取细胞入1.5ml EP管，12,000rpm离心15秒，取沉淀。
②沉淀中加入1ml细胞总蛋白裂解液重悬细胞。
③冰上间歇超声，45HZ、每次15秒，重复三次。
④4℃、12,000rpm离心30分钟，收集上清，即为细胞总蛋白。
(2)检测细胞中p53的水平
将细胞总蛋白进行8％ SDS-PAGE凝胶电泳，然后进行Western Blot(以Actin为上样量对照)，一抗为鼠抗p53单克隆抗体(购自北京中杉金桥公司)。
结果见图5A，在上样量基本一致的情况下，转染siRNA-A-1、siRNA-A-2和siRNA-A-3的细胞内p53含量均高于转染siRNA-NC的细胞。
结果表明，干扰内源hUTP14a的表达后，p53蛋白的水平升高。
二、过表达hUTP14a引起内源p53蛋白水平降低
(一)质粒转染细胞
用重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a转染HeLa细胞，具体步骤如下：
①在5×7cm培养瓶中种上细胞(1×106个细胞/瓶)，培养24h，使细胞达到90％汇合。
②将不同剂量的质粒(0μg、1μg、2μg、4μg或6μg)溶于200μl无血清的培养基中。
③将10μl脂质体(LipofectamineTM2000)溶于200μl无血清的培养基中。
④将步骤②和步骤③的培养基混合，室温放置20min。
⑤将步骤①得到的待转染的细胞换上4ml无血清的培养基。
⑥将步骤④的混合物加入步骤⑤的培养基中，混匀，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
⑦6h后，换上含有10％(体积百分含量)FCS的培养基。
(二)鉴定试验
转染细胞24小时后，通过Western blot分析hUTP14a的表达情况和p53蛋白水平。
1、分析hUTP14a的表达情况
方法同步骤一的(二)的1。
结果见图5B，在上样量基本一致的情况下，随着质粒转染剂量的增加，细胞核内hUTP14a表达也增加。
2、分析细胞中p53蛋白的水平
方法同步骤一的(二)的2。
结果见图5B，在上样量基本一致的情况下，随着质粒的转染剂量的增加，细胞内p53蛋白含量降低。
结果表明，hUTP14a过表达导致p53蛋白水平的下降。
三、细胞内p53蛋白的半衰期测定
用重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a或重组质粒pCI-neo-Flag转染U2OS细胞，具体步骤同步骤二的(一)，转染剂量为4μg。
转染细胞16h后，加入放线菌酮(cycloheximide)，使其浓度为10μg/ml，以阻断蛋白质翻译；分别在0min、5min、10min、15min、20min、30min、40min收取细胞，提取细胞总蛋白，对p53蛋白、hUTP14a蛋白和Flag-hUTP14a蛋白的表达量进行分析。p53蛋白表达量分析方法同步骤一的(二)的2。hUTP14a蛋白表达量分析和Flag-hUTP14a蛋白表达量分析方法同步骤一的(二)的1。
结果见图5C，在上样量基本一致的情况下，转染重组质粒pCI-neo-Flag的细胞中p53蛋白的半衰期为20分钟，转染重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a的细胞中p53蛋白的半衰期为10分钟。结果表明，hUTP14a可以促进p53蛋白降解。
四、机理分析
p53的降解分为蛋白酶体非依赖和蛋白酶体依赖两种降解途径。很多原癌基因产物与p53蛋白结合后通过蛋白酶体导致p53蛋白的降解，这种降解可被蛋白酶抑制剂所阻断。为探讨hUTP14a引起的p53蛋白的降解是否通过蛋白酶体，在U2OS细胞内转染重组质粒pCI-neo-Flag-UTP14a，用重组质粒pCI-neo-Flag作对照。转染16h后，加蛋白酶体阻断剂MG132(终浓度为10μM)后继续培养4小时，同时溶剂DMSO作为对照，收取细胞总蛋白对p53的水平进行分析。结果见图5D。结果表明，用溶剂DMSO处理的细胞内p53蛋白被hUTP14a降解，而MG132处理的细胞内hUTP14a不能再降解p53蛋白。说明MG132能阻断UTP14a引起的p53蛋白降解，也就是说UTP14a引起的p53蛋白降解是依赖于蛋白酶体的。
实施例6、UTP14a在细胞内和细胞外结合p53蛋白
为研究hUTP14a与p53之间是否直接结合，用大肠杆菌中表达的GST和GST-p53融合蛋白与体外转录翻译的Flag-hUTP14a蛋白进行GST pull-down实验。用hUTP14a多克隆抗体进行Western blot检测。结果显示(图6A)：hUTP14a与p53直接结合。
p53蛋白含有393个氨基酸残基、分为四个主要的功能结构域，：从N端到C端它们依次是转录活化区(氨基酸1-97，p53-N)、序列特异的DNA结合区(氨基酸98-292，p53-M)、含有寡聚化功能域(氨基酸324-355)和负性调节区(氨基酸363-393)的C末端(氨基酸293-393，p53-C)。为了明确p53与hUTP14a结合的氨基酸序列，用大肠杆菌表达的GST-p53及3个截断体(图6B下面的示意图所示)：GST-p53-N，GST-p53-M，GST-p53-C与体外转录翻译的Flag-hUTP14a蛋白进行GST pull-down实验，然后用hUTP14a抗体进行Western blot检测。结果显示(图6B)，p53通过其aa 98-292(M段)和aa 293-393(C端)与hUTP14a结合，而aa 1-97(N端)不与hUTP14a结合。
为研究hUTP14a与p53结合的最小结构，构建了GST-hUTP14a系列截断突变体(图6C)：Del-1：aa 1-267，Del-2：aa 268-645，Del-3：aa 646-771，在大肠杆菌中表达这些截断体的GST融合蛋白，与体外翻译的p53蛋白进行GST pull-down实验。结果(图6C)显示，aa 1-267和aa 646-771与p53结合，而aa268-645不与p53结合。提示hUTP14a通过其N端和C端与p53结合。
同时将3个hUTP14a的GFP-hUTP14a截断体Del-1、Del-2和Del-3转染至H1299细胞，在激光共聚焦显微镜下观察GFP蛋白的定位，图6D所示，与p53结合的Del-1和Del-3是定位在细胞核内。
为验证hUTP14a与p53在细胞内的相互作用，将p53、Flag-hUTP14a质粒转染H1299细胞，转染24h后提取细胞总蛋白，用抗p53单克隆抗体进行免疫沉淀，经SDS-PAGE分离，用抗p53抗体和抗UTP14a多克隆抗体对沉淀下来的蛋白复合物进行Western blot检测，结果显示(图6E)用抗hUTP14a多克隆抗体可以从p53抗体沉淀下来的蛋白复合物物中检测出hUTP14a和Flag-hUTP14a。结果说明，hUTP14a在细胞内与p53结合。
实施例7、hUTP14a表达水平降低后抑制细胞增殖
将siRNA(siRNA-A-1、siRNA-A-2、siRNA-A-3或siRNA-NC)转染U2OS细胞，方法同实施例5的步骤一的(一)。转染细胞72小时后分别进行细胞克隆形成实验和增殖曲线制作。
细胞克隆形成实验，步骤如下：将500个细胞种于6孔板中，培养10天后，通过乙醇/冰醋酸(3体积份乙醇和1体积份冰醋酸混合)固定细胞后，经苏木素染色并拍照，结果见图7A。结果表明，转染siRNA-A-1、siRNA-A-2和siRNA-A-3后，细胞增殖明显受到抑制。
制作增殖曲线制作方法如下：将1×104个细胞/孔种于96孔板，分别在不同时间(24小时、48小时、72小时和96小时)加入CCK-8(购自Dojindo公司)10μl，继续培养4小时，测450nm的吸光值，每次实验各测2个孔，将3次实验的结果进行统计，用每点的平均值作增殖曲线，结果见图7B。转染了siRNA-A-1、siRNA-A-2和siRNA-A-3后，细胞增殖明显受到抑制。
Claims (8)
1.人UTP14a蛋白表达抑制剂在制备细胞增殖抑制剂中的应用；所述人UTP14a蛋白表达抑制剂为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种；所述细胞为U2OS细胞或HeLa细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述人UTP14a蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
3.人UTP14a蛋白表达抑制剂在制备促进细胞中p53蛋白水平升高的产品中的应用；所述p53蛋白如序列表的序列3所示；所述人UTP14a蛋白表达抑制剂为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种；所述细胞为U2OS细胞或HeLa细胞。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述人UTP14a蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
5.一种细胞增殖抑制剂，为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种。
6.如权利要求5所述的细胞增殖抑制剂，其特征在于：所述细胞为U2OS细胞或HeLa细胞。
7.一种促进细胞中p53蛋白水平升高的产品，为序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一种；所述p53蛋白如序列表的序列3所示。
8.如权利要求7所述的促进细胞中p53蛋白水平升高的产品，其特征在于：所述细胞为U2OS细胞或HeLa细胞。
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