CN102000322A - 一种抗肝癌药物及其制备、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肝癌药物及其制备方法，应用。抗肝癌药物包括：抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。本发明抗肝癌蛋白及其异构体，活性多肽片段及相应的翻译后修饰产物：(1)是目前唯一直接作用于肝癌细胞的细胞周期，抑制癌细胞增殖的多肽类药物。(2)由于其相应的蛋白序列为人类自身基因编码，无免疫原性.(3)与传统化学治疗药物相比，理论上无导致DNA损伤等相应的副作用，诸如脱发等。(4)制备简单，通过基因工程即可获得相应的纯品。无需经过单克隆抗体等制备过程复杂的细胞系筛选。

Description

一种抗肝癌药物及其制备、应用

技术领域

本发明涉及抗癌蛋白的制备及其应用技术领域，特别涉及一种新的抗肝癌蛋白ERp48的制备及其应用。

背景技术

肝癌发病及预后现状：肝癌为全球常见癌症之一，是我国最常见的恶性肿瘤之一。国际抗癌研究中心(IARC)估计，目前全球肝癌新发病例约56.4万，其中中国新发肝癌每年约30.6万，肝癌死亡约每年30.0万。显然，中国肝癌年发病和年死亡数均占全球肝癌的半数以上。我国是全球肝癌发病数最多的国家。我国肝癌患者40-50岁青壮年男性居多，而且预后极差。1970s年代，我国未经治疗肝癌确诊后平均生存时间1-2个月。在确诊后95％的患者于6个月内死亡。1991-1998年澳大利亚对245例肝癌的中位生存期分析表明，其中位生存期仅为8个月。其发病率，死亡率之高，预后之差，因而被称之为“癌中之王”。我国是肝炎病毒感染大国，乙型及丙型肝炎病毒携带率超过1.5亿人，而长期携带病毒患者其肝癌发生率是正常人群肝癌发生率的200-300倍之多。显然，肝癌防治是我国医务人员及科研人员任重道远的任务。

肝癌治疗现状及趋势：一个多世纪以来，肝癌的治疗基本上是建立在系统病理学的基础上，及采用外科，放疗，化疗，介入和局部方法消灭病理证实的肿瘤细胞。在传统的治疗模式下，小肝癌用射频，切除，以及肝移植的5年生存率分别为40％、50％、以及60～70％。在这种综合系统干预支持下的传统肝癌治疗措施下，小肝癌术后生存率已经基本稳定于上述现状，近年来基于上述传统治疗方案，即便是早期肝癌的预后也无显著改善(汤钊猷.从生物学角度看肝癌治疗趋势.中华肝胆外科杂志.2009；19：401-402)。导致患者手术后难以长期生存的根本原因在于转移与复发。

化疗的疗效及局限性：目前经典的观念认为，减少患者手术，放疗，射频，以及肝移植后复发的根本措施是全身化疗。但近期美国圣地亚哥的科研人员甚至发现，经典化疗药物之一的环磷酰胺甚至能够促进癌细胞的转移(Yamauchi K，Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice：an opposite effect of chemotherapy.Cancer Res.2008；68(2)：516-520)。这无疑为肝癌等肿瘤患者化疗或术后化疗的应用敲响了一个警钟。而基于栓塞疗法的化疗可能会促进肺癌转移早已是近几年肿瘤专家们已经注意的问题。显然，肿瘤的化学治疗很难成为肝癌治疗的主要治疗措施。无论是局部治疗还是全身化疗，治疗失败的主要原因主要有两个：耐药性及远处转移。但无论是耐药还是转移，其根本原因在于缺乏彻底抑制肿瘤细胞复制的药物。

生物治疗现状及趋势：近半个多世纪以来，对不能手术切除的肝癌疗效并无根本进展。其中最主要的原因是缺乏有效的特异性药物治疗靶点。近几年来，以免疫疗法为主导的生物治疗已经成为肿瘤生物治疗的主导方向之一。但基于免疫调节的生物治疗对实体瘤显然难以实现完全消除实体病灶，但对癌细胞在血道、淋巴道的播散显然具有一定疗效。就目前所提供的靶点而言，即便是针对部分、几个所谓免疫靶点的药物(如Sorafenib)，对不能手术切除肝癌的生存期也仅能延长40％左右。显然，肝癌有效靶点的探索仍然是制约其疗效和预后的瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种新的肝癌生物治疗药物，即一种新的内质网居民蛋白ERp48(发明人命名PubMed编号NM_032042)，该蛋白与现有生物免疫治疗制剂相比，最大的优点是直接抑制癌细胞DNA合成，而不是通过间接免疫调控达到抗癌治疗的作用。由于所述蛋白是人类正常基因的编码产物，无免疫原性及过敏反应等潜在的副作用。理论上同样也不具有传统肿瘤化疗药物的严重副作用，诸如造血抑制，脱发等。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗肝癌药物，包括：抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种，在制备抗肝癌药物中的应用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种，在抗肝癌药物筛选中的应用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

为解决上述技术问题，本发明另提供了一种一种抗癌蛋白ERp48的制备方法，包括以下步骤：首先根据ERp48基因编码序列，设计体外扩增引物克隆该基因编码序列，体外克隆纯化后的cDNA片段连接到pET-32a(+)表达质粒上，连接目的片段的pET-32a-ERp48表达质粒体外扩增，纯化，转化大肠杆菌E.coli，然后IPTG诱导大量表达ERp48蛋白；表达后的蛋白采用反相色谱柱层析纯化；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

所述体外扩增引物优选为：上游引物P1 5′-ggtaccatgtctatttccttgagctc-3′，下游引物P2 5′-aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3′。

为解决上述技术问题，本发明再提供了一种抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a.应用Trizol提取人肝癌细胞HepG2总RNA；

b.逆转录制备HepG2细胞cDNA模板；

c.PCR法扩增ERp48基因；

d.pET32a-ERp48目的载体构建；

e.重组蛋白的诱导表达；

f.重组蛋白的纯化。

为解决上述技术问题，本发明也提供了一种抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种，在肝癌诊断和/或治疗中的应用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

本发明有益的技术效果在于，本发明抗肝癌蛋白及其异构体，活性多肽片段及相应的翻译后修饰产物：(1)是目前唯一直接作用于肝癌细胞，抑制癌细胞增殖的生物制剂。(2)由于其相应的蛋白序列为人类自身基因编码，无免疫原性.(3)与传统化学治疗药物相比，理论上无导致DNA损伤等相应的副作用，诸如严重的骨髓造血抑制，脱发等。(4)制备简单，通过基因工程即可获得相应的纯品。无需经过单克隆抗体等制备过程复杂的细胞系筛选。

附图说明

图1为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2，48小时后细胞(1×400倍)照片，HepG2细胞购自北京协和细胞库；

图2为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2，转染ERp48真核表达质粒[pCDNA3.1(-)-ERp48]48小时后，肝肿瘤细胞系增生(1×400倍)照片，pcDNA3.1 myc-his(-)A(简称pcDNA3.1(-))购自Invitrogen公司，产品编号V80020；

图3为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2转染ERp48表达质粒[pCDNA3.1(-)-ERp48]48小时后，细胞增生(1×200倍)照片；

图4为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2转染ERp48 RNA干预质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-ERp48shRNA)(简称pcDNA6.2-ERp48shRNA)48小时后，细胞增生(1×200倍)照片；

图5为本发明实施例所述，培养HepG2细胞48小时，流式细胞仪细胞周期检测结果图；

图6为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.0001μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图；

图7为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.001μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图；

图8为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.01μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图；

图9为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.1μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种新的肝癌生物治疗药物，即一种新的内质网居民蛋白ERp48(发明人命名，PubMed编号为：NM_032042)，该蛋白与现有生物免疫治疗制剂相比，最大的优点是直接抑制癌细胞DNA合成，而不是通过间接免疫调控达到抗癌治疗的作用。由于所述蛋白是人类正常基因的编码产物，无免疫原性及过敏反应等潜在的副作用。理论上同样也不具有传统肿瘤化疗药物的严重副作用，诸如造血抑制，脱发等。

本发明具体实施包括以下主要步骤：

1.应用Trizol提取人肝癌细胞(HepG2)总RNA

(1)在大约为10⁷个人肝癌细胞(HepG2)中，加入1ml Trizol试剂，充分混匀，室温静置5min；

(2)加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置2min；

(3)4℃，12000rpm离心15min，留取上清；

(4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

(6)加入1ml 75％乙醇(DEPC水配置)，洗涤沉淀，

(7)4℃，7500rpm离心5min，吸弃上清；

(8)超净台内晾干，加入50μl的DEPC水溶解(65℃促溶10min)。

DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。

DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。

DEPC水一般是指千分之一浓度的DEPC，在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，用来处理Tip头、离心管的DEPC水不需高压灭活，而用于配制DEPC酒精等试剂和用来这种RNA相关试验的DEPC水需灭火后使用。

DEPC水的制备方法是：取市售DEPC 1ml，加入1L待处理水(蒸馏水等)中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC(DEPC分解为CO₂和乙醇)。

2.逆转录制备HepG2细胞cDNA模板

逆转录试剂盒使用：宝生物(大连)有限公司，产品编号D6210A

(1)配置Reverse Transcription反应液：

                                                   

试剂                             使用量(μl)

                                                   

Oligo dT Primer                  1

dNTP Mixture                     1

Total RNA                        2

DEPC水补充至                     10

                                                   

(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却；

(3)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl；

                                                   

试剂                              使用量(μl)

                                                   

上述变性后反应液                  10

5X PrimeScript II Buffer          4

RNase Inhibitor                   0.5

PrimeScript II RTase              1

DEPC水补充至                      20

                                                  

(4)42℃ 50min，95℃ 5min，冰上冷却。

3.PCR法扩增ERp48基因

根据ERp48序列(PubMed：NM-032042)，设计合成引物，上游引物P1 5′-ggtaccatgtctatttccttgagctc-3′，下游引物P2 5′-aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3′，分别引入BamH I和Hind 酶切位点。扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min20s，循环35次后，72℃保温10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。反应体系如下：

                                                

试剂                               使用量

                                                

10×缓冲液(含20mmol/L MgCl2)       2.5μl

dNTP Mixture(10mmol/L)             0.5μl

P1(12.5μmmol/L)                   1.0μl

P2(12.5μmmol/L)                   1.0μl

HepG2 cDNA                         1.0μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)              0.5μl

双蒸水水补充至                     25μl

                                                   

Taq酶使用：深圳中晶生物技术有限公司，产品编号EP0401。

4.pET32a-ERp48目的载体构建

pET-32a购自Novagen公司，产品编号69015-3；

(1)PCR产物回收

PCR产物回收试剂盒使用：威格拉斯(北京)生物技术有限公司，产品编号N004；

1)DNA电泳结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段。

2)含DNA的琼脂糖胶块装入1.5ml离心管，估算其重量(每管不超过0.2g)。加入Buffer I(溶胶结合液)300μl(胶块≤0.1g)或600μl(胶块＞0.1g)。DNA Binding Matrix(DNA结合基质)震荡混匀后取5μl加入以上液体。

3)离心管置于60℃水浴10min，每隔2～3min取出混悬震荡10sec，至琼脂糖凝胶完全溶解。

4)室温放置5min，于台式离心机上高速离心1min，小心吸去液体。

5)加入Buffer II(固定液)300μl，吹打混匀，高速离心1min，小心吸去液体。

6)加入Buffer III(洗涤液)600μl，吹打混匀，高速离心1min，小心吸净液体。室温晾干5min。

7)加入20μl Elution Buffer，混悬震荡，置于50～60℃水浴5min。高速离心1min，小心吸出上清液体，转入新的离心管中，即为纯化的DNA溶液。

(2)T-A克隆

pGEM-T easy使用：普洛麦格(北京)生物技术有限公司，产品编号A137A

T4DNA连接酶将目的基因片段插入载体pGEM-T：取3.5μl PCR的回收产物，0.5μl pGEM-T，加入5μl 2×T4buffer及1μl T4连接酶，16℃孵育过夜。

(3)转化入大肠埃希菌感受态细胞

E.coli DH5α使用：北京全式金生物技术有限公司，产品编号CD201

感受态制备：来自单菌落或冻存菌液的细菌E.coli DH5α接种于5ml的LB培养基中37℃振摇(＞200rpm)过夜活化，1ml接种于100ml的LB培养基中(1∶100)，37℃振摇(＞200rpm)培养至A600＝0.6～0.8。两个离心管各装入50ml培养液，冰浴10min，于4℃，4000rpm离心10min，弃上清，各用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。各用2ml 0.1M CaCl2及0.5ml的80％的甘油以250μl分装到Ep管中，冻存于-20℃活性可达2-3周，-70℃可无限延长。

转化：冰浴中融化一管冻存的感受态细菌加入10μl的连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，转入42℃水浴中热休克90sec，再立即冰浴2min。加入800μl的LB培养基(不含抗生素)，于37℃ 120～150rpm振摇约45min。1000g离心4min，弃掉800μl上清，用剩余的培养基(约250μl)重悬，铺入氨苄西林平板上进行菌落筛选，于37℃温箱中倒置培养12～20h。

(4)提取质粒

质粒提取试剂盒为：威格拉斯(北京)生物技术有限公司，产品编号N011；

收菌：取过夜培养菌1-3ml菌液，装入1.5ml的离心管中，12000xg室温离心2min沉淀菌体，完全弃除上清。

重悬：加入200ul Buffer P1(首次使用时加入RNase A，混匀)，充分混悬震荡菌体沉淀10-15sec，使其完全分散开，至无絮块存在。

裂解：加入200ulBuffer P2，轻轻颠倒离心管3-5次，室温放置2-3min，使细菌完全裂解，溶液透明。裂解时间不要超过5min。

中和：加入300ul Buffer P3，轻轻颠倒离心管4-6次，充分混匀，室温放置1-5min，可见白色絮状物产生。于室温12000xg离心8min。

柱平衡：向插入套管的离心柱内加入300Buffer PE，于台式离心机上高速离心30sec，弃去套管内废液，将离心柱插入套管。

DNA结合：将中和后离心的质粒粗提物上清小心吸出，转移至平衡液处理过的离心柱内，于台式离心机上高速离心30sec。弃去套管内废液，再将离心柱插回套管。

清洗：向离心柱内加入Buffer PWT(洗涤液T)500ul，高速离心30sec，弃去套管内废液，将离心柱插回套管。

再清洗：向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)700ul，高速离心30sec，弃去套管内废液，再将离心柱插回套管。再次高速离心1-2min甩干。

收离心柱：小心取出离心柱，不要沾上套管内的废液。弃去套管。

洗脱DNA：将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心管内硅胶膜中心位置加入30ul Elution Buffer(洗涤液)，注意不要触及硅胶膜；高速离心1min，离心管中即得纯化的质粒DNA溶液。保存于-20℃.

(5)酶切鉴定

pGEM-T easy使用：普洛麦格(北京)生物技术有限公司，产品编号A137A；

反应体系为：提取的质粒(pGEM-T-ERp48)DNA5μl、EcoRI和Hind Ⅲ各1μl、10×M buffer 1μl，双蒸水2μl，总体积10μl。混匀后37℃过夜。2％琼脂糖凝胶电泳，确认质粒均已酶切。回收含ERP48基因片段的凝胶，方法同前。

(6)DNA序列测定

挑取白色菌落，于含氨苄西林(50～100μg/ml)的液体LB 5ml中37℃振荡(200～250rpm)培养过夜，分装到Ep管中，然后，进行DNA序列测定。

(7)表达载体的构建

pGEM-T-ERp48和pET-32a分别用EcoRI和Hind Ⅲ双酶切，反应体系为：质粒DNA为8μl、EcoRI和HindⅢ各1μl、10×M buffer 2μl，双蒸水8μl，总体积为20μl。混匀后37℃过夜。2％琼脂糖凝胶电泳样品，确认质粒均已酶切；

酶切产物于2％琼脂糖电泳分离，回收产物DNA，方法同前；

T4DNA连接酶将ERP48基因片段插入酶切后的载体pET-32a：取6μlPCR的回收产物，1μl pET-32a酶切回收产物，2μl 5×T4 buffer及1μl T4连接酶，16℃孵育过夜；

pET-32a-ERP48连接产物转化大肠埃希菌BL21感受态细胞(制备方法同前)，提取质粒并用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定。最后将酶切鉴定阳性的转化菌送北京奥科生物公司进行DNA序列测定。

5.重组蛋白的诱导表达

将转化有pET-32a(+)-ERP48的大肠埃希氏菌50μl接种于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃230～250rpm过夜培养，次日，取20ml转种于2000ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中37℃ 230～250rpm培养，至菌液密度为A600＝0.6～0.8，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，以37℃继续摇菌4h。离心集菌，将沉淀冻存于-80℃冰箱中。

6.重组蛋白的纯化

(1)将细菌沉淀反复冻融三次后从-80度冰箱取出，收集菌斑于100ml烧杯中(烧杯提前称重)；

(2)称量细菌沉淀重量3g；

(3)加入湿菌液30ml，反复吹匀，湿菌液配方：20mM Tris-HCl(PH8.0)，5mM EDTA；

(4)用湿菌液将细菌悬液稀释200倍，紫外分光光度仪测OD值为0.1177；

(5)超声碎菌：用酒精擦拭超声探头，待风干后开始超声。条件：超声5秒暂停5秒，5min/循环，每10个循环测OD值，30个循环后改为20s/20s，共50个循环，最后测OD值不再下降为0.0072

(6)4℃15000rpm离心20min；

(7)洗涤液30ml洗涤包涵体3次，离心3次，离心条件：15000rpm，4℃，15min，洗涤液配方：0.5M尿素，20mM Tris-HCl(PH8.0)，5mM EDTA，100mM NaCl，1％ Triton X-100；

(8)ddH2O 30ml洗涤包涵体2次，离心2次，条件同上；

(9)A液(8M脲)30ml溶解包涵体，室温低速摇过夜；

(10)15000rpm，4℃离心25min；

(11)A液充分溶解包涵体后，离心收集上清，0.22μm滤膜过滤后经AKTA purifier蛋白纯化仪进行复性和纯化。具体步骤如下：样品上经5个柱床体积A液洗涤的亲和层析柱，然后用B液(20mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、20mmol/LPB)逐渐按线性梯度降低尿素浓度至零进行蛋白柱上复性(共40ml复性液，流速为5ml/分)，最后以20mM～500mM的咪唑线性梯度洗脱吸附在Ni-NTA树脂上的重组蛋白，分别收集穿透液、洗脱、峰，得到重组蛋白纯品。

(12)蛋白分析试剂盒(BCA法)测定得到的重组蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，蛋白分析试剂盒购自Thermo公司，产品编号23227。

如图1所示，为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2，48小时后细胞(1×400倍)照片；图中显示，培养人肝肿瘤细胞系HepG2，48小时后细胞增生显著。

如图2所示，为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2，转染ERp48真核表达质粒[pCDNA3.1(-)-ERp48]48小时后，肝肿瘤细胞系增生(1×400倍)照片；图中显示，转染ERp48真核表达质粒[pCDNA3.1(-)-ERp48]后，与对照细胞系(图1)相比，肝肿瘤细胞系增生显著受抑。

如图3所示，为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2转染ERp48表达质粒[pCDNA3.1(-)-ERp48]48小时后，细胞增生(1×200倍)照片；图中显示，培养人肝肿瘤细胞系HepG2转染ERp48表达质粒[pCDNA3.1(-)-ERp48]48小时后，细胞增生受抑。

如图4所示，为本发明实施例所述，培养人肝肿瘤细胞系HepG2转染ERp48RNA干预质粒(pEGFP-C1-RNi)48小时后，细胞增生(1×200倍)照片；图中显示，培养人肝肿瘤细胞系HepG2转染ERp48RNA干预质粒(pEGFP-C1-RNi)48小时后，细胞增生活跃。

通过本发明人的研究，内质网居民蛋白ERp48高表达于正常肝细胞，肝细胞损伤及肝癌细胞该蛋白表达显著降低。为了明确该基因的作用，申请人构建了该基因的真核表达质粒pCDNA3.1(-)-ERp48，将该基因表达质粒pCDNA3.1(-)-ERp48转染肝癌细胞系HepG2。转染后48小时，流式细胞仪检测显示，培养肝癌细胞与未转染pCDNA3.1(-)-ERp48表达质粒相比，癌细胞增殖显著受抑(如图1，图2所示)。流式细胞仪分析显示，转染后的肝癌细胞S期消失。提示，高表达ERp48基因可以抑制癌细胞增殖，该人类新基因是一个典型的抑癌基因。生物信息学分析显示，该基因的异构体是一个分泌蛋白，转染pCDNA3.1(-)-ERp48后所有肝癌细胞S期均消失(DNA合成抑制)可能与该蛋白的旁分泌作用有关。

如图5所示，为本发明实施例所述，培养HepG2细胞48小时后，流式细胞仪细胞周期检测结果图；图中显示，培养HepG2细胞48小时后，流式细胞仪细胞周期检测结果为：G1期：68.18％；G2期：0.09％；S期31.73％；G2/G1比值1.98。

如图6所示，为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.0001μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图；图中显示，ERp48重组蛋白(0.0001μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果为：G1期：69.38％；G2期：5.03％；S期25.99％；G2/G1比值1.87。

如图7所示，为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.001μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图；图中显示，ERp48重组蛋白(0.001μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果为：G1期：70.80％；G2期：9.63％；S期19.57％；G2/G1比值1.85。

如图8所示，为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.01μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图；图中显示，ERp48重组蛋白(0.01μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果为：G1期：72.89％；G2期：9.82％；S期17.29％；G2/G1比值1.84。

如图9所示，为本发明实施例所述，ERp48重组蛋白(0.1μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果图。图中显示，ERp48重组蛋白(0.1μg/ml)处理培养的HepG2细胞48小时后，流式细胞仪检测结果为：G1期：79.45％；G2期：18.28％；S期2.27％；G2/G1比值1.68。

本发明实施例中，首先根据ERp48基因编码序列，设计体外扩增引物克隆该基因编码序列，体外克隆纯化后的cDNA片段连接到pET-32a(+)表达质粒上，连接目的片段的pET-32a-ERp48表达质粒体外扩增，纯化，转化大肠杆菌E.coli，然后IPTG诱导大量表达ERp48蛋白。表达后的蛋白采用反相色谱柱层析纯化。

进一步地，发明人利用基因工程技术，体外克隆表达了所述蛋白ERp48的原核表达重组蛋白，并证实该蛋白可以剂量依赖性地抑制体外培养肝癌细胞(HepG2)的增殖，使肝癌细胞DNA合成终止，导致肝癌细胞的细胞周期S期缺乏。转染ERp48的肝癌细胞系后，由于ERp48高表达，同样导致肝癌细胞DNA合成终止，S期缺乏(如图5～图9所示)。

进一步地，将纯化后的不同浓度的重组蛋白(0.0001、0.001、0.01、0.μg/ml)与体外培养的肝癌细胞(HepG2)共孵育，分别在孵育后12、24、36、以及48小时，利用流式细胞技术检测细胞周期。以明确所述蛋白对肝癌细胞HepG2增殖及细胞周期的影响。以上结果表明，所述重组蛋白可以剂量依赖性地抑制培养HepG2增殖，导致培养癌细胞S期消失，上述结果表明所述蛋白可以抑制癌细胞的DNA合成及增殖。ERp48重组蛋白对培养HepG2细胞的影响仅见于ERp48和HepG2细胞共孵育48小时后(如图5～图9所示)，培养12，24，36小时均未见显著抑制作用(阴性结果未给出)。

进一步地，将克隆ERp48真核表达质粒转(pCDNA3.1(-)-ERp48)染肝癌细胞HepG2，转染ERp48表达质粒后，肝癌细胞HepG2于培养48小时后流式细胞仪检测显示HepG2细胞增殖受抑制，S期缺失。表明癌细胞DNA合成终止。

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品和/或新方法属于保留的权利。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (20)

1.一种抗肝癌药物，其特征在于，包括：抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

2.抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种，在制备抗肝癌药物中的应用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

3.抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种，在抗肝癌药物筛选中的应用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

4.一种抗癌蛋白ERp48的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先根据ERp48基因编码序列，设计体外扩增引物克隆该基因编码序列，体外克隆纯化后的cDNA片段连接到pET-32a(+)表达质粒上，连接目的片段的pET-32a-ERp48表达质粒体外扩增，纯化，转化大肠杆菌E.coli，然后IPTG诱导大量表达ERp48蛋白；表达后的蛋白采用反相色谱柱层析纯化；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

5.根据权利要求4所述抗癌蛋白ERp48的制备方法，其特征在于，所述体外扩增引物为：上游引物P1 5′-ggtaccatgtctatttccttgagctc-3′，下游引物P2 5′-aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3′。

6.一种抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.应用Trizol提取人肝癌细胞HepG2总RNA；

b.逆转录制备HepG2细胞cDNA模板；

c.PCR法扩增ERp48基因；

d.pET32a-ERp48目的载体构建；

e.重组蛋白的诱导表达；

f.重组蛋白的纯化。

7.根据权利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤a，应用Trizol提取人肝癌细胞HepG2总RNA进一步包括：

(1)在106-108个人肝癌细胞HepG2中，加入1ml Trizol试剂，充分混匀，室温静置5min；

(2)加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置2min；

(3)4℃，12000rpm离心15min，留取上清；

(4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

(6)加入1ml 75％DEPC水配置的乙醇，洗涤沉淀；

(7)4℃，7500rpm离心5min，吸弃上清；

(8)超净台内晾干，加入50μl的DEPC水溶解，65℃促溶10min。

8.根据权利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤b，逆转录制备HepG2细胞cDNA模板进一步包括：

逆转录试剂盒使用：宝生物(大连)有限公司，产品编号D6210A；

(1)配置Reverse Transcription反应液：

                                              

试剂                        使用量(μl)

                                              

Oligo dT Primer             1

dNTP Mixture                1

Total RNA                   2

DEPC水补充至                10

                                              

(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却；

(3)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl；

                                              

试剂                         使用量(μl)

                                              

上述变性后反应液             10

5X PrimeScript II Buffer     4

RNase Inhibitor              0.5

PrimeScript II RTase         1

DEPC水补充至                 20

                                              

(4)42℃ 50min，95℃ 5min，冰上冷却。

9.根据权利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤c，PCR法扩增ERp48基因进一步包括：

上游引物P1 5′-ggtaccatgtctatttccttgagctc-3′，下游引物P2 5′-aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3′，分别引入BamH I和Hind Ⅲ酶切位点；扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min20s，循环35次后，72℃保温10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果；反应体系如下：

                                               

试剂                              使用量

                                               

10×缓冲液(含20mmol/L MgCl2)      2.5μl

dNTP Mixture(10mmol/L)            0.5μl

P1(12.5μmmol/L)                  1.0μl

P2(12.5μmmol/L)                  1.0μl

HepG2HepG2cDNA                    1.0μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)             0.5μl

双蒸水水补充至                    25μl

                                               

10.根据权利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤d，pET32a-ERp48目的载体构建进一步包括：

(1)PCR产物回收；

(2)T-A克隆；

(3)转化入大肠埃希菌感受态细胞；

(4)提取质粒；

(5)酶切鉴定；

(6)DNA序列测定；

(7)表达载体的构建。

11.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)，PCR产物回收，进一步包括：

PCR产物回收试剂盒使用：威格拉斯(北京)生物技术有限公司，产品编号N004；

1)DNA电泳结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段；

2)含DNA的琼脂糖胶块装入1.5ml离心管，估算其重量，且保证每管不超过0.2g；当胶块≤0.1g时加入Buffer I 300μl；当胶块＞0.1g时，加入Buffer I 600μl；DNA Binding Matrix震荡混匀后取5μl加入以上液体；

3)离心管置于60℃水浴10min，每隔2～3min取出混悬震荡10sec，至琼脂糖凝胶完全溶解；

4)室温放置5min，于台式离心机上高速离心1min，小心吸去液体；

5)加入Buffer II 300μl，吹打混匀，高速离心1min，小心吸去液体；

6)加入Buffer III 600μl，吹打混匀，高速离心1min，小心吸净液体，室温晾干5min；

7)加入20μl Elution Buffer，混悬震荡，置于50～60℃水浴5min；高速离心1min，吸出上清液体，转入新的离心管中，即为纯化的DNA溶液。

12.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)，T-A克隆，进一步包括：

T4 DNA连接酶将目的基因片段插入载体pGEM-T：取3.5μl PCR的回收产物，0.5μl pGEM-T，加入5μl 2×T4 buffer及1μl T4连接酶，16℃孵育过夜。

13.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)，转化入大肠埃希菌感受态细胞，进一步包括：

感受态制备：来自单菌落或冻存菌液的细菌E.coli DH5α接种于5ml的LB培养基中37℃，小于200rpm振摇过夜活化，1ml接种于100ml的LB培养基中，小于200rpm，37℃振摇培养至A600＝0.6～0.8；两个离心管各装入50ml培养液，冰浴10min，于4℃，4000rpm离心10min，弃上清，各用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体，4℃，4000rpm离心10min，弃上清；各用2ml 0.1M CaCl₂及0.5ml的80％的甘油以250μl分装到Ep管中，冻存于-70℃；

转化：冰浴中融化一管冻存的感受态细菌加入10μl的连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，转入42℃水浴中热休克90sec，再立即冰浴2min；加入800μl的不含抗生素的LB培养基，于37℃ 120～150rpm振摇45min；1000g离心4min，弃掉800μl上清，用剩余的培养基重悬，铺入氨苄西林平板上进行菌落筛选，于37℃温箱中倒置培养12～20h。

14.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)，提取质粒，进一步包括：

使用威格拉斯生物技术有限公司质粒提取试剂盒，产品编号N011；

收菌：取过夜培养菌1-3ml菌液，装入1.5ml的离心管中，12000xg室温离心2min沉淀菌体，完全弃除上清；

重悬：加入200ul Buffer P1，首次使用时加入RNase A，混匀，充分混悬震荡菌体沉淀10-15sec，使其完全分散开，至无絮块存在；

裂解：加入200ul Buffer P2，轻轻颠倒离心管3-5次，室温放置2-3min，使细菌完全裂解，溶液透明；

中和：加入300ul Buffer P3，轻轻颠倒离心管4-6次，充分混匀，室温放置1-5min，可见白色絮状物产生；于室温12000xg离心8min；

柱平衡：向插入套管的离心柱内加入300 Buffer PE，于台式离心机上高速离心30sec，弃去套管内废液，将离心柱插入套管；

DNA结合：将中和后离心的质粒粗提物上清小心吸出，转移至平衡液处理过的离心柱内，于台式离心机上高速离心30sec；弃去套管内废液，再将离心柱插回套管；

清洗：向离心柱内加入Buffer PWT 500ul，高速离心30sec，弃去套管内废液，将离心柱插回套管；

再清洗：向离心柱内加入Buffer PW 700ul，高速离心30sec，弃去套管内废液，再将离心柱插回套管；再次高速离心1-2min甩干；

收离心柱：取出离心柱，弃去套管；

洗脱DNA：将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心管内硅胶膜中心位置加入30ul Elution Buffer；高速离心1min，离心管中即得纯化的质粒DNA溶液，保存于-20℃。

15.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)，酶切鉴定，进一步包括：

反应体系为：提取的质粒pGEM-T-ERp48的DNA5μl、EcoRI和Hind Ⅲ各1μl、10×M buffer 1μl，双蒸水2μl，总体积10μl。混匀后37℃过夜；2％琼脂糖凝胶电泳，确认质粒均已酶切；回收含ERP48基因片段的凝胶。

16.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)，DNA序列测定，进一步包括：

挑取白色菌落，于含氨苄西林50～100μg/ml的液体LB 5ml中37℃振荡200～250rpm培养过夜，分装到Ep管中，然后，进行DNA序列测定。

17.根据权利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)，表达载体的构建，进一步包括：

pGEM-T-ERp48和pET-32a分别用EcoRI和HindⅢ双酶切，反应体系为：质粒DNA为8μl、EcoRI和HindⅢ各1μl、10×M buffer 2μl，双蒸水8μl，总体积为20μl；混匀后37℃过夜；2％琼脂糖凝胶电泳样品，确认质粒均已酶切；

酶切产物于2％琼脂糖电泳分离，回收产物DNA；

T4 DNA连接酶将ERP48基因片段插入酶切后的载体pET-32a：取6μlPCR的回收产物，1μl pET-32a酶切回收产物，2μl 5×T4 buffer及1μl T4连接酶，16℃孵育过夜；

pET-32a-ERP48连接产物转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，提取质粒并用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定；最后将酶切鉴定阳性的转化菌进行DNA序列测定。

18.根据权利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤e，重组蛋白的诱导表达，进一步包括：

将转化有pET-32a(+)-ERP48的大肠埃希氏菌50μl接种于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃ 230～250rpm过夜培养，次日，取20ml转种于2000ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中37℃ 230～250rpm培养，至菌液密度为A600＝0.6～0.8，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，以37℃继续摇菌4h；离心集菌，将沉淀冻存于-80℃冰箱中。

19.根据权利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤f，重组蛋白的纯化，进一步包括：

(1)将细菌沉淀反复冻融三次后从-80度冰箱取出，收集菌斑于100ml烧杯中；

(2)称量细菌沉淀重量3g；

(3)加入湿菌液30ml，反复吹匀；

(4)用湿菌液将细菌悬液稀释200倍，紫外分光光度仪测OD值，湿菌液配方：20mM Tris-HCl(PH8.0)，5mM EDTA；

(5)超声碎菌：超声5秒暂停5秒，5min/循环，每10个循环测OD值，30个循环后改为超声20秒暂停20秒，共50个循环；

(6)4℃ 15000rpm离心20min；

(7)洗涤液30ml洗涤包涵体3次，离心3次，离心条件：15000rpm，4℃，15min，洗涤液配方：0.5M尿素，20mM Tris-HCl(PH8.0)，5mM EDTA，100mM NaCl，1％ Triton X-100；

(8)ddH2O 30ml洗涤包涵体2次，离心2次，条件同上；

(9)A液，8M脲，30ml溶解包涵体，室温低速摇过夜；

(10)15000rpm，4℃离心25min；

(11)A液充分溶解包涵体后，离心收集上清，0.22μm滤膜过滤后经AKTA purifier蛋白纯化仪进行复性和纯化；

(12)蛋白分析试剂盒BCA法测定得到的重组蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，蛋白分析试剂盒购自Thermo公司，产品编号23227。

20.抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表达蛋白、重组蛋白、异构体、剪切体、以及活性多肽片段，中的一种或多种，在肝癌诊断和/或治疗中的应用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的编号为NM_032042。

Images