CN101999999B

CN101999999B - 西伯利亚刺柏活性提取物的制法及美白抗衰老活性化妆品

Info

Publication number: CN101999999B
Application number: CN2009100345307A
Authority: CN
Inventors: 姚志蕊; 张婷婷; 赵毅; 马立伟; 陈婷婷; 肖韦; 许至安
Original assignee: JIANONG BIOCHEMICAL TECHNOLOGY (CHINA) Co Ltd
Current assignee: Jianong Biochemical Technology (China) Co., Ltd.; Pui lung biochemical (Suzhou Industrial Park) Co., Ltd.
Priority date: 2009-09-01
Filing date: 2009-09-01
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2029-09-01
Also published as: CN101999999A

Abstract

本发明涉及一种西伯利亚刺柏活性提取物的制法及美白抗衰老活性化妆品。西伯利亚刺柏经干燥、粉碎、提取、脱色、分离纯化、浓缩等步骤进行处理，获得中等极性的活性提取物，然后将该提取物添加到化妆品中配制成具有美白抗衰老功能的化妆品。该活性成分是通过对西伯利亚刺柏提取物进行抑制酪氨酸酶、抗氧化、清除自由基等活性筛选所得到的中等极性的活性成分，具有美白、锁水和抗衰老的特殊功效，并具有一定的抑菌效果。本发明所用原料为天然生物，且为可再生资源；制备工艺绿色安全、步骤简单独到，所得提取物稳定性好、功效持久，可在任一阶段直接添加到化妆品中，无需顾忌溶剂残留和微生物污染等问题。

Description

西伯利亚刺柏活性提取物的制法及美白抗衰老活性化妆品

技术领域

本发明涉及西伯利亚刺柏活性提取物的制法以及具美白和抗衰老功能的化妆品，尤其涉及一种从西伯利亚刺柏中提取脂溶性的中等极性活性成分的制备方法，以及应用该提取物制备而成的具有美白和抗衰老活性的化妆品。

背景技术

西伯利亚刺柏(Juniperus sibirica)是柏科刺柏属植物，常绿匍匐灌木或乔木。别名山桧(北研丛刊)，矮桧(中国裸子植物志)，西伯利亚杜松(中国东北裸子植物研究资料)，分布于大兴安岭山区、吉林(长白山)、新疆(阿尔泰山)、西藏。朝鲜、俄罗斯西伯利亚、中亚各国、日本、阿富汗至喜马拉雅山也有分布，生长于海拔1,400米至4,200米的地区，常生于林窗下、亚高山矮曲林、山坡针叶林缘、石山顶以及云杉林缘。

西伯利亚刺柏生长的环境由于其海拔高度，空气比较干燥，稀薄，太阳辐射比较强，气温比较低，总的来说高原上降雨比较少。长久以来，生长在海拔3500多米高山地带的西伯利亚刺柏(Rhododendron)耐寒性强，抗旱性强，抗紫外线能力强。

刺柏在民间被广泛用于治疗麻疹、皮肤疥癣和高烧感冒等。它的根、叶、种子中含有芳香油，因此除了具有医用价值外，其芳香性成分也被用于生产杜松子酒、化妆品和增强一些时尚饮料的口感与香味。目前对刺柏的研究主要是刺柏精油活性成分——萜类、烯类化合物。研究发现刺柏化学成分有α-蒎烯、β-谷甾醇、柠檬烯香茅醇、槲皮素等。但是对其多酚、黄酮类化合物的抗氧化性能、保湿、抑制酪氨酸酶活性以及抗衰老活性的研究尚未见报道。由于植物的可再生性，开发利用以获得更好的活性成分，是现下一科研契机。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种西伯利亚刺柏活性提取物的制法及美白抗衰老活性化妆品，借鉴绿色植物的天然保护机制，从极限环境条件下自生植物中提取天然、稳定的具有抗衰老和美白功效的中等极性活性成分。并将其应用于功能性化妆品中。

本发明的技术解决方案是：

西伯利亚刺柏活性提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

I、将干燥的西伯利亚刺柏制成粉末；II、按以下质量体积比将西伯利亚刺柏粉末与乙醇溶液混合放入圆底烧瓶中，每1g西伯利亚刺柏粉末使用10ml～35ml乙醇溶液；乙醇溶液中乙醇的质量浓度介于45％～55％，然后在25℃～40℃条件下加热浸泡提取2h～2.5h两次，合并两次提取液，得到粗提液；III、将西伯利亚刺柏乙醇粗提液减压浓缩去除并回收乙醇，用热水悬浮脱乙醇的提取物，得到悬浮液；IV、用石油醚萃取悬浮液，脱除叶绿素和鞣质，得到精提液；V、用乙酸乙酯超声萃取精提液中的活性提取物，浓缩回收乙酸乙酯后将活性提取物真空干燥成膏体。

进一步地，上述的西伯利亚刺柏的活性提取物的制备方法，其中——

步骤I中，将西伯利亚刺柏在自然环境下干燥，然后再粉碎制成平均粒度在100目的粉末。

步骤II中，将西伯利亚刺柏粉末按1g/35ml的比例与质量浓度为50％的乙醇溶液混合，并添加到圆底烧瓶中；然后以40℃水浴浸提两次，合并两次提取液，得到粗提液；

步骤III中，将得到西伯利亚刺柏乙醇粗提液减压浓缩，回收乙醇，用热水悬浮该粗提液，体积约为100～200mL，得到悬浮液；

步骤IV中，石油醚与悬浮液按体积比3∶1、2∶1或1∶1进行萃取，以较少量的石油醚尽可能的除去叶绿素和鞣质。

步骤V中，乙酸乙酯与精提液按体积比3∶1、2∶1或1∶1进行超声萃取，浓缩活性成分，回收乙酸乙酯，并将活性成分于45℃的真空干燥箱中干燥。

一种美白抗衰老活性化妆品，该化妆品包含按照权利要求1所述方法制备获得的西伯利亚刺柏活性提取物，所述活性提取物为多酚、黄酮类化合物，具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性的功效。该化妆品的剂型不限，可以为水剂、霜剂、油剂、洗液或乳状液等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、在化妆品的功能性原料的选材上，西伯利亚刺柏资源丰富，来源天然无污染，生产所得的是高附加值产品，真正实现了开发天然植物活性成分，具有很高的经济价值，并可在一定程度上调控生态环境；

2、上述西伯利亚刺柏的提取方案中，化妆品限用原料——乙醇已通过减压浓缩脱除干净，消除了工艺制造中的隐患；

3、在上述提取工艺中采用石油醚除叶绿素、鞣质等低极性化合物，相对于在提取之前除掉叶绿素和鞣质来说，叶绿素和鞣质脱除的完全度较高，而且抗氧化活性和美白活性成分损失较少，且石油醚可回收再利用，节省成本；

4、在上述制备工艺中较低温度提取，高温溶解，活性稳定。所提取出来的活性成分具有较好的高温稳定性，可以添加在化妆品配置的任一阶段，甚至在化妆品的高温灭菌阶段加入也不会影响其原有活性，因而无需顾忌化妆品冷配可能带来的微生物污染问题。

具体实施方式

本发明将极限环境天然植物的保护机制应用于皮肤护理中，制备出具有美白抗衰老作用的化妆品，该化妆品选用西伯利亚刺柏为主要原料，从中提取天然的中等极性活性成分，具有抗自由基、抗氧化和美白的功能。

本发明从西伯利亚刺柏中提取脂溶性活性成分的方法包括以下步骤：

步骤1、将干燥的西伯利亚刺柏花叶粉碎成粉末；

步骤2、选用乙醇作为提取液，按以下质量体积比将西伯利亚刺柏粉末与乙醇溶液混合放入圆底烧瓶中，每1g西伯利亚刺柏粉末使用10ml～35ml乙醇溶液；乙醇溶液中乙醇的质量浓度介于45％～55％，然后在25℃～40℃条件下加热浸泡提取2h～2.5h两次，合并两次提取液，得到粗提液；

步骤3、将西伯利亚刺柏乙醇粗提液减压浓缩去除并回收乙醇，并用100～200mL去热水悬浮脱乙醇的提取物，得到悬浮液；

步骤4、将步骤3得到的热水悬浮液，用石油醚萃取，以石油醚与悬浮液混合萃取，合并萃取液，减压浓缩回收石油醚；

步骤5、将步骤4得到的精提液用乙酸乙酯超声萃取，以乙酸乙酯与精提液混合萃取至乙酸乙酯基本无色为止，合并萃取液，减压浓缩回收乙酸乙酯，将活性成分置于45℃的真空干燥箱中干燥24h得中等极性活性成分浸膏。

上述方案的优选工艺为：

在上述方案的步骤1中，采用采摘的西伯利亚刺柏花叶自然条件下干燥，粉碎成平均粒度在100目的粉末。

在上述方案的步骤2中，将西伯利亚刺柏粉末与乙醇溶液(体积分数0～100％)以质量体积比(g∶mL)1∶10～1∶40混合放入原地烧瓶中，水浴加热(温度为室温、30℃、40℃、60℃、80℃、煮沸)提取0.5h～4h，提取1～5次，以DPPH清除率为检测指标研究提取工艺。得到较佳的提取条件为：将西伯利亚刺柏粉末按1g/35ml的比例与质量浓度为50％的乙醇溶液混合，并添加到圆底烧瓶中；然后以40℃水浴浸提两次，合并两次提取液，得到粗提液；

在上述方案的步骤4中，将水悬液用石油醚萃取，以石油醚与悬浮液体积比为3∶1、2∶1、1∶1萃取，萃取至石油醚基本无色为止，合并萃取液，回收石油醚。

在上述方案的步骤5中，将步骤4所得水悬液用乙酸乙酯超声萃取，以乙酸乙酯与精提液体积比为3∶1、2∶1、1∶1萃取，萃取至乙酸乙酯基本无色为止，合并萃取液，回收乙酸乙酯，将活性成分置于45℃的真空干燥箱中干燥24h得中等极性活性成分浸膏。

采用上述方案获得的活性提取物具有良好的高温稳定性，发明人对生产的中间产物以及最终制成的浸膏，进行抗氧化、抗自由基以及抑制酪氨酸酶活性检测，发现在制备过程中活性成分得到很好的富集与保留，获得的中等极性活性成分具有较高的活性。其功效检测方法如下：

一、抑制酪氨酸酶活性的检测方法

1、取四只试管分别标上1^#、2^#、3^#、4^#；

2、参照表1，在四只试管内分别加入相应各列所列的反应液；

3、振摇混匀，37℃预热10min；

4、然后在各管分别加入酪氨酸酶溶液，37℃准确反应20min，迅速转移至比色皿中，于475nm处测吸光度值(A)；

5、酪氨酸酶抑制率的计算：按下式计算对酪氨酸酶抑制率。

抑制率＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％

式中：A1、A2、A3、A4分别代表表1中1^#、2^#、3^#、4^#四个反应体系在步骤4中所测得的吸光度A₄₇₅。

表1：待测液的组成(单位：ml)

反应液	1^#	2^#	3^#	4^#
					酪氨酸溶液	0.7	0	0.7	0
美白剂溶液	0	0	0.5	0.5
					美白剂的空白溶剂	0.5	0.5	0	0
PH6.8磷酸盐缓冲液	0.8	1.5	0.8	1.5

二、活性物抗自由基能力的体外检测方法

1、准确称取20mg DPPH(1，1-二甲基苄基苯肼，C₁₈H₁₂N₅O₆)，用无水乙醇定容于250ml容量瓶，浓度2×10^-4mol/L；

2、取若干试管编号，参照表2，添加试剂。

表2：试剂添加量(单位：ml)

组别	DPPH	样品	提取溶剂
				空白0	2.0	0	1.0
样品溶液1	2.0	1.0	0
				样品溶液2	2.0	1.0	0
样品溶液3	2.0	1.0	0

3、混合均匀，室温下(25℃或水浴25℃)反应10min后，测定517nm波长下的吸光度值。

4、根据下式计算抑制率：

抑制率(％)＝(1-A_t/A_空白)×100％

A_空白：空白对照在517nm波长下的吸光度值

A_t：样品在517nm波长下的吸光度值

三、活性物总抗氧化能力的体外检测方法

(一)溶液配制

1、FRAP工作液

A-醋酸缓冲液：取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml，即得PH3.6的“醋酸-醋酸钠”缓冲液

B-TPTZ溶液：10mmol/L TPTZ+40mmol/L HCl(终浓度)

C-三氯化铁溶液：20mmol/L的FeCl₃6H₂O

D-FRAP工作液：25ml A+2.5ml B+2.5ml C

2、样品溶液

A：称取样品，用醋酸缓冲液配成10g/100ml的溶液；

B：用醋酸缓冲液配制2mmol/L的Vc溶液。

(二)操作方法

1、标准曲线的制作：

1)取新鲜配制的FRAP 200μl(水浴预热到37度)加入40μl去离子水，以分光光度计在593nm波长下做空白样本吸光度校正；

2)参照表3配制Vc标准溶液；

3)分别将10μl标准溶液和30μl去离子水加入200μl的FRAP工作液中，混合均匀；

4)由分光光度计记下0.5秒后的吸光值；

5)根据吸光度值和Vc的含量制作标准曲线。

表3：Vc标准溶液的配置

最终浓度 (mmol/L)	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4	1.6	1.8	2.0
												2mmol/L Vc溶液(μl)	5	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100
去离子水 (μl)	95	90	80	70	60	50	40	30	20	10	0

2、样品抗氧化能力的测定

将配置好的样品溶液利用1中的方法测定其光吸收值，在标准曲线上找到其对应的V含量，比较同等质量的样品和Vc的抗氧化效果。

通过以上活性检测，发现：本发明提取的活性物抑制酪氨酸酶的活性较同等质量的Vc好，其抗氧化性与抗自由基功效也与Vc接近，但是此方法提取的活性物，具有良好的热稳定性和光稳定性。

四、抑菌试验

1、供试菌种：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、痤疮丙酸杆菌(P.acnes)。

2、培养基：营养琼脂培养基

3、刺柏提取物抑菌能力的测定

(1)菌悬液的制备：取活化后的菌种若干，用适量无菌生理盐水洗入烧杯中，用血球计数法制成含菌量为107～108CFU/mL的菌悬液。

(2)待测溶液的配置：体积分数50％的乙醇配制成1％的刺柏提取物溶液。

(3)滤纸片法测定抑菌圈直径：把滤纸片用打孔器打成直径6mm的滤纸片，然后121℃湿热灭菌，把灭菌好的滤纸片浸入样品液中15min，然后取出置于灭菌的表面皿上使乙醇挥发；用移液器吸取0.2mL菌悬液涂平板。将浸泡过的滤纸片取出贴于含菌平板上，每皿3片，以无菌蒸馏水做对照，每菌重复3次，于37℃培养16h～18h，用数显游标卡尺测定抑菌圈直径，取平均值。

实验结果显示，刺柏提取物对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌具有一定的抑制效果。

五、黑色素细胞测试

1、小鼠B16黑色素细胞培养

用含质量分数为10％小牛血清的1640培养液在37℃、5％CO₂的条件下培养B16黑色素细胞，细胞接种量为3×10⁶个/L，每3d传一次代。

2、细胞增殖率的测定

选择对数生长期的B16黑色素细胞，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为2×10⁴个/mL，接种于96孔培养板，每孔180μL，置于37℃、5％CO₂的培养箱内培养24h。镜下观察生长状态，分别加入受试物20μL/孔，继续培养48h。于结束前4h加入MTT30μL/孔，4h后弃上清液，然后加入DMSO 150μL/孔，振荡10min左右，用酶联免疫检测仪测定475nm波长处的吸光度。

测试结果为三种活性物对黑色素细胞的增殖几乎均无抑制作用，对细胞增殖的抑制率均低于10％，即三种活性物基本无细胞毒性。

3、细胞内酪氨酸酶活力测定

取B16黑色素细胞接种于25cm²的培养瓶，接种量为2×10⁵个/瓶，培养48h后更换成加有受试物的培养基，继续培养48h，以不加活性物作为对照。0.25％胰酶消化后，用pH6.8的PBS(磷酸缓冲液)吹打成细胞悬液，低温离心后弃上清液，收获细胞团块。加入1mL0.5％的脱氧胆酸钠，冰浴15min，裂解细胞制备含酪氨酸酶提取液。取该提取液0.5mL，于37℃预温后加入0.3％多巴溶液0.5mL，37℃水浴反应5min，用紫外分光光度计在475nm处测定吸光度。

测试结果为西伯利亚刺柏提取物的对酪氨酸酶的抑制率较Vc乙基醚好、与熊果苷相当。

通过以上体外活性检测，发现：本发明提取的西伯利亚刺柏提取物的美白、抗衰老活性，与Vc乙基醚、熊果苷相当，并且该活性物具有良好的热稳定性和光稳定性。

按照本发明技术方案制得的西伯利亚刺柏中等极性活性成分，可以用作为美白和抗衰老化妆品的功能性原料，其使用形式没有特殊要求，它可以被配制成的形式有水剂、霜剂、油剂、洗液、乳状液等。

作为本发明应用的典型基质，涉及的已知物质有：动植物油、矿物油、蜡、高级醇、脂肪醇、硅油、表面活性剂、磷脂、醇类、多元醇类、水溶性聚合物、油溶性聚合物类、矿物质、去离子水等，另外，根据需要可适当加入PH调节剂、抗氧化剂、螯合剂、颜料、防腐剂和香精等。此外，也可以与具有美白作用、抗衰老作用或者护肤功效性作用的其它活性成分结合使用，如防晒剂、血液循环促进剂、消毒剂、消炎剂、细胞活化剂、维生素类、氨基酸类、润湿剂、角质层分离剂。

表4和表5分别是应用本发明获得的西伯利亚刺柏提取物配制“膏霜”和“润肤乳液”化妆品的具体配料组成。配制时，将表中组分A加热至85℃，溶化搅拌均匀，作为油相，将组分B放入容器加热至85℃，搅拌溶解成水相原料，油相原料加入水相原料中搅拌，乳化均质后，冷却至65℃时添加组分C，继续搅拌冷却至35℃时，加入西伯利亚刺柏提取物和香精、防腐剂，搅拌均匀，陈化24小时后即可灌装、包转、检验，制得本发明之实例产品。

表4：“膏霜”配料

表5：“润肤乳液”配料

采用“双盲法”测试评价本发明的美白效果：按照上述实例制备含有西伯利亚刺柏提取物的美白抗衰老产品和不含西伯利亚刺柏提取物的基质各一份，前者作为样品，后者作为对照品，选择25～60岁的女士作为实验小组成员。每天早晚洗脸后在每位小组成员的脸部和前臂各四个部位涂适量的制剂，共4周，使用皮肤测试仪测试皮肤黑色素的含量，以及皮肤色差仪来评估制剂的美白效果，同时利用皮肤弹性测试仪来测试皮肤弹性，以及皮肤显微镜及活性皮肤表面分析系统来测试皮肤的皱纹的深浅，从而评价制剂的抗衰老效果。实验结果采用t检验法进行统计：含有西伯利亚刺柏提取物的化妆品，具有明显的美白和抗衰老活性。

Claims

1.西伯利亚刺柏活性提取物的制法，其特征在于包括以下步骤：

I、将干燥的西伯利亚刺柏制成粉末；

II、按以下质量体积比将西伯利亚刺柏粉末与乙醇溶液混合放入圆底烧瓶中，每1g西伯利亚刺柏粉末使用10ml～35ml乙醇溶液；乙醇溶液中乙醇的质量浓度介于45％～55％，然后在25℃～40℃条件下加热浸泡提取2h～2.5h两次，合并两次提取液，得到粗提液；

III、将西伯利亚刺柏乙醇粗提液减压浓缩去除并回收乙醇，用热水悬浮脱乙醇的提取物，得到悬浮液；

IV、用石油醚萃取悬浮液，所述石油醚与悬浮液按体积比3∶1、2∶1或1∶1混合，脱除叶绿素和鞣质，得到精提液；

V、用乙酸乙酯超声萃取精提液中的活性提取物，所述乙酸乙酯与精提液按体积比3∶1、2∶1或1∶1混合，浓缩回收乙酸乙酯后将活性提取物真空干燥成膏体。

2.根据权利要求1所述的西伯利亚刺柏活性提取物的制备方法，其特征在于：步骤I中，将西伯利亚刺柏在自然环境下干燥，然后再粉碎制成平均粒度在100目的粉末。

3.一种美白抗衰老活性化妆品，其特征在于：该化妆品包含按照权利要求1所述方法制备获得的西伯利亚刺柏活性提取物，所述活性提取物为多酚、黄酮类化合物，具有抑制酪氨酸酶活性和抗氧化活性的功效。

4.根据权利要求3所述的美白抗衰老活性化妆品，其特征在于：所述化妆品是水剂、霜剂、油剂或乳状液。