CN101967456B

CN101967456B - 一种胶冻样类芽孢杆菌及其培养方法和培养基

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Publication number: CN101967456B
Application number: CN2010102767077A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 李力; 沈德龙; 马鸣超; 姜昕; 关大伟; 曹风明; 陈慧君; 冯瑞华; 葛一凡; 邴晓会; 杨小红
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-09-09
Also published as: CN101967456A

Abstract

本发明一种胶冻样类芽孢杆菌及其培养方法和培养基，属于微生物技术领域。该胶冻样类芽孢杆菌P.muc3016同时具有固氮、溶磷和解钾的作用，属于类芽孢杆菌类群。对该胶冻样类芽孢杆菌发酵培养时进行补料发酵，并监测调控其碳源浓度及溶解氧浓度。所述培养基包括碳源、豆粕粉、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钙和碳酸钙，培养基的pH为7.5～7.0。本发明的胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷和解钾三种作用，具有较强的功能活性，明显提高作物产量；采用本发明所述培养方法和培养基能够提高了发酵密度并缩短了发酵时间。

Description

一种胶冻样类芽孢杆菌及其培养方法和培养基

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种胶冻样类芽孢杆菌P.muc 3016 CGMCCNo.4100以及培养该细菌的方法和培养基。

背景技术

目前，我国农业土壤中缺磷、钾问题越来越明显。一方面，我国磷、钾素化肥生产能力严重不足，每年需要大量进口；另一方面，耕作层的土壤中含有大量磷、钾元素，但这些磷、钾绝大部分固化在铝硅酸盐中，不能被植物吸收利用。另外，我国农业生产中目前大量应用氮素化肥，而氮素化肥的利用率不到40％，大量未被利用的氮素不但形成白白损失，而且成为地下水和江河湖泊的污染源。

硅酸盐细菌，俗称“钾细菌”，是一类可分解正长石等硅酸盐矿物和磷灰石的芽胞杆菌，据目前分类学研究表明，该类群属于胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)和土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus edaphicus)。自原苏联学者从土壤中分离到这种细菌，发现这类细菌的某些类型能分解硅酸盐类矿物，并将植物难以吸收的磷、钾等元素释放以供植物利用；此外，这类细菌可同时产生胞外多糖，具有增强植物非特异性免疫能力，在农业生产实践中表现出良好的应用效果，成为微生物肥料领域研究和应用的热点。此外，该类菌种在采矿、冶金、饲料、环保领域也有着广阔的应用。

现有具有固氮、溶磷、解钾能力的微生物肥料(菌剂)都采用混合菌种来实现此三种功能，即分别由具有固氮能力的菌种、具有溶磷能力的菌种和具有解钾能力的菌种三类菌种组合而成，相应生成工艺及过程控制较为复杂。

在发酵工艺及培养基配方设计上，对该类菌种的都是采用一次配料、灭菌、批次发酵工艺，在发酵过程中不对发酵状态进行监测和干预，发酵产物即芽孢含量获得率较低，通常芽孢密度不超过10亿/ml；且发酵时间较长，通常30h左右。

发明内容

为了解决上面提到的现有技术所存在的问题，本发明的一个目的提供了一种具有较强的固氮、溶磷、解钾功能的胶冻样类芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供培养这种胶冻样类芽孢杆菌的方法。

本发明的第三个目的在于公开了用于培养这种胶冻样类芽孢杆菌的培养基。

本发明的技术方案如下：

一种胶冻样类芽孢杆菌，其中，所述胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷和解钾的作用。

上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌，其中，所述胶冻样类芽孢杆菌的16S rDNA如序列表1所示。

上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌，其中，所述胶冻样类芽孢杆菌为P.muc3016 CGMCC No.4100。

上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，是指将上述技术方案中所述的胶冻样类芽孢杆菌置于培养基中进行发酵培养，其中所述培养基中包含下列浓度的物质：碳源0.2～0.8g/L、豆粕粉2.0～8.0g/L、硫酸铵0.6～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.6g/L、磷酸二氢钾0.1～0.6g/L、磷酸氢二钾0.4～1.5g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.1～0.5g/L，培养基的pH为7.5～7.0；

在发酵培养过程中还包括下述步骤：

(1)、发酵培养中间补料流加碳源，保持发酵培养基中碳源含量不高于 0.05％；

(2)、调节发酵罐通风量及搅拌速度，使发酵液溶解氧浓度不低于30％；

(3)、在发酵前12h发酵温度保持在28℃～32℃，12h后每2h温度提高1℃，在温度升至36℃时保持该温度，直至形成芽孢产率到95％。

上述技术方案中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，其中，所述培养基包含下列浓度的物质：碳源0.4～0.6g/L、豆粕粉4.0～6.0g/L、硫酸铵0.9～1g/L、硫酸镁0.3～0.5g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钾0.8～1g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.2～0.4g/L。

上述技术方案中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，其中，所述培养基中的碳源选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。

培养上述技术方案中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养基，其中，所述培养基包含下列浓度的物质：碳源0.2～0.8g/L、豆粕粉2.0～8.0g/L、硫酸铵0.6～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.6g/L、磷酸二氢钾0.1～0.6g/L、磷酸氢二钾0.4～1.5g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.1～0.5g/L，培养基的pH为7.5～7.0。

上述技术方案中所述的培养胶冻样类芽孢杆菌的培养基，其中，所述培养基包含下列浓度的物质：碳源0.4～0.6g/L、豆粕粉4.0～6.0g/L、硫酸铵0.9～1g/L、硫酸镁0.3～0.5g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钾0.8～1g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.2～0.4g/L。

上述技术方案中所述的培养胶冻样类芽孢杆菌的培养基，其中，所述培养基中的碳源选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。

本发明所述的菌种P.muc 3016的菌体特征、菌群特征以及生理生化特征如下：

(1)、菌体特征：该菌种P.muc 3016为G-芽孢杆菌(有时会随着培养条件及菌龄会有变化)，细胞粗长杆状，两端钝圆，产生聚β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒；在无氮培养基上菌体大小为(1.0～1.2)um×(4.0～7.0)um；单个菌体或多个菌体包裹在同一荚膜边界内形成菌胶团，外被肥厚夹膜，并呈现2-4层的结构，有时比菌体大10倍以上；芽孢壁厚，椭圆形，中生或偏端生，芽孢囊微膨大(菌体照片见图2、3)。

(2)、菌落特征：在无氮的无氮筛选培养基(见菌落分离部分)上菌落胶质粘稠、湿润，形成光亮透明、边缘整齐圆形隆起菌落，挑起时富有弹性，可拉成丝。通常在28℃培养48小时，菌落直径可达3mm以上(菌体照片见图1)。

(3)、生理生化特性：氧或兼性厌氧生长，水解淀粉、硝酸盐还原、不利用木糖；石蕊牛奶反应不发生酸凝，不产碱；M.R反应为阳性；V.P反应为阴性；不产生吲哚；生长的最佳pH值为7.0～8.0，pH低于5.0或高于8.5均不生长；最佳生长温度范围为28℃～33℃。

(4)、分类地位的确定

16S rDNA全序列测定结果如序列1所示，根据16S rDNA全序列测定结果，该菌种P.muc 3016在系统发育上属于胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)。

由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所述的胶冻样类芽孢杆菌克服了现有技术中采用混合菌种来实现固氮、溶磷、解钾三种功能时相应生成工艺及过程控制较为复杂的缺点，由单一菌种同时实现了固氮、溶磷、解钾三种功能；

2、由于本发明所述的胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷、解钾三种功能，具有较强的功能活性，明显提高作物产量；

3、本发明中所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法首次在成孢发酵方法上对本发明所述菌种进行补料发酵，并监测调控其碳源浓度及溶解氧浓度，实现了高密度发酵的目的，较常规提高一倍左右，且成孢发酵时间为23h，较常规发酵方法缩短发酵时间大约6小时左右。

菌株保藏信息：本发明胶冻样类芽孢杆菌P.muc 3016，分类命名Paenibacillusmucilaginosus，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.4100，保藏日期为2010年8月24日。

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明

实施例1：胶冻样类芽孢杆菌P.muc 3016的筛选获得：

一、分离地及环境：

作为本发明的具体实施例，分离地及环境选择北京市昌平区国家褐潮土土壤肥力和肥料效益长期监测基地内耕层土壤，该基地位于北纬40°13’，东经116°14’；土壤理化性质见表1。

表1 分离地土壤状况

二、菌株筛选

(1)、挑取典型菌落：

称取10g土壤加入100ml无菌水中，25℃摇床震荡30分钟，取上清液作10^-1～10^-4稀释，将各稀释液在80℃处理15min，分别取0.1ml涂布于筛选平板培养基上，28℃～30℃培养3～5d，挑取具有胶冻样类芽孢杆菌典型菌落特征的单菌落，显微镜检查其纯度，确认为纯培养后转接至斜面，28℃～30℃培养至菌苔长起，置4℃冰箱保存备用。

无氮筛选培养基配方：蔗糖5.0g，Na₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 0.1g，FeCl₃·6H₂O 0.005g，pH7.5，琼脂粉16g，蒸馏水1.0L。

(2)、单菌株解钾性能筛选：

250ml三角瓶中分装筛选培养基50ml(成份同上无氮筛选培养基，不加琼脂粉)，加入0.1g钾长石粉，121℃灭菌30min，接入菌悬液(1.6×108CFU/ml)5ml；对照处理接等量灭活菌液，30℃振荡(200r/min)培养7天后采用原子吸收分光光度计测定培养液中钾含量，以筛选高效分解钾长石的菌株。

(3)、单菌株解磷性能筛选：

对步骤(2)筛选的高效分解钾长石的菌株继续进行溶磷筛选，筛选溶磷细菌性能的培养基为改良的Pikovskaya培养基，其中培养基配方为含有下列浓度的物质：(NH₄)₂SO₄0.5g/L，NaCl0.2g，KCl 0.2g/L，MgSO₄:7H2O 0.3g/L，MnSO₄0.03g/L，FeSO₄0.03g/L，酵母粉0.5g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸三钙5.0g/L，pH值7.2。其中磷酸三钙过80目筛，115℃高压灭菌20min。将配置好的上述液体培养基按50mL加入到250mL三角瓶中，灭菌冷却后接入待筛选菌株的菌悬液(1.6×10⁸CFU/ml)5ml；对照处理接等量灭活菌液，30℃振荡(200r/min)培养5天后采用钼锑抗比色法，用紫外可见分光光度计测定培养液中磷含量，以筛选高效解磷的菌株。

(4)、单菌株固氮性能筛选：

(I)将步骤(3)中筛选的具有高效解钾、溶磷能力的的各菌株同时活化，保持生长状态一致；

(II)将活化后的各菌株接入不走(1)中所述的无氮筛选培养基(其中加入0.5g酵母膏)，30℃200rpm振荡培养20h；

(III)测各菌株的OD600值，按每个液体小瓶1ml 1OD值的量接种；

(IV)各取出6倍量菌液，4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用生理盐水洗两遍后充分悬浮于1ml液体上述补加酵母膏的筛选培养基中，再加入2ml(适量)培养基混匀，用A15将菌液的OD₆₀₀值调到1；

(V)每个液体小瓶加入9ml上述补加酵母膏的筛选培养基，接入1ml菌液，向液体小瓶中塞入胶塞，注入纯氩4min，按事先算好的体积加入氧气(1.5ml空气)，使瓶内氧气的终浓度为0.5％。每个样品至少3个重复；各注入十分之一新制的乙炔(6.5ml)，30℃反应4-6h；

(VI)从每个液体小瓶中用微量进样器取出100μl气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。

最终筛选得到具有较强固氮、解磷、解钾的芽孢杆菌，将其命名为P.muc3016。

实施例2：菌种P.muc 3016的固氮、溶磷、解钾性能：

按照实施例1菌株筛选方法中固氮、溶磷和解钾的测定方法对菌种P.muc 3016的固氮、溶磷、解钾性能进行测定，结果显示：在固氮性能方面，该菌种具有较高的固氮酶活性，为3.024C₂H₄nmol/(h^-1·mg)蛋白，显著高于目前微生物肥料生产中使用的圆褐固氮菌ACCC 11103的固氮酶活性达85％；在溶磷性能方面，用该菌种接种处理含磷矿粉(无机磷)及卵磷脂(有机磷)的缺磷培养基，无机及有机磷含量分别比对照增加211.5％、146.2％；在解钾性能方面，用该菌种接种处理含钾长石的缺钾培养基，其水溶性钾浓度为87.7mg/L，对照为23.4mg/L，增加3.75倍。

实施例3：菌种的培养：

实施例3-1：

按下列浓度制备发酵培养基，其中碳源0.2g/L、豆粕粉8.0g/L、硫酸铵0.6g/L、酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸钙0.2g/L和碳酸钙0.5g/L，培养基的pH为7.5～7.0；其中碳源为淀粉、糖蜜或蔗糖。

将实施例1中获得的菌种P.muc 3016接种到上述培养基中，然后按照下述步骤进行操作：

(1)、发酵培养中间补料流加碳源，保持发酵培养基中淀粉含量不高于0.05％；

按照本实施例所述的培养方法进行培养，发酵时间为23h，较常规发酵方法缩短发酵时间大约6小时左右。在100L发酵罐小试水平，发酵芽孢得率在95％以上，芽孢发酵密度18.7亿/ml，较国内常规水平5～10亿/ml，提高了一倍以上；发酵时间不超过30h。

实施例3-2：

本实施例与实施例3-1相同，区别在于：所述培养基中含有下列浓度的物质：碳源0.8g/L、豆粕粉2.0g/L、硫酸铵1.5g/L、硫酸镁0.6g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸钙0.1g/L和碳酸钙0.1g/L，培养基的pH为7.5～7.0；其中碳源为淀粉和糖蜜或淀粉和蔗糖的组合。

实施例3-3：

本实施例与实施例3-1基本相同，区别在于：所述培养基中含有下列浓度的物质：碳源0.4g/L、豆粕粉4g/L、硫酸铵0.9g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、硫酸钙0.2g/L和碳酸钙0.4g/L，培养基的pH为7.5～7.0；其中碳源为淀粉、糖蜜和蔗糖的组合。

实施例3-4：

本实施例与实施例3-1基本相同，区别在于：所述培养基中含有下列浓度的物质：碳源0.6g/L、豆粕粉6g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸钙0.1g/L和碳酸钙0.2g/L，培养基的pH为7.5～7.0；其中碳源选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。

实施例4：菌种P.muc 3016对作物产量的影响：

试验设计：马铃薯小区实验设灭菌的空白培养基、P.muc 3016菌液两个处理，每个处理4小区重复，每小区面积16m²，小区实验排列采用随机拉丁方设计。供试土壤性质见表2

表2 小区实验土壤基本理化性质

马铃薯小区P.muc3016菌液接种施用：平整试验地，均匀肥力，按当地习惯施肥及进行田间管理，常规亩施农家肥2000kg，亩栽苗2223株。将马铃薯芽块与菌液搅拌均匀，播种完成后，将各剩余的菌液稀释100倍，均匀浇灌于各芽块周围。中间根据土壤墒情浇适量水及进行其他管理，保持马铃薯生长正常。收获时各小区分别计产，各小区产量用 SAS软件进行统计分析；马铃薯块茎中的全磷、全钾分析方法分别为NY/T 298-1995、NY/T298-1995。

表3菌液对马铃薯生物学性状的影响

注：1)“*”≥200g为中大薯，对照为常规施肥+空白培养基。

2)表中结果为各处理中10株马铃薯的平均值。

表4菌液处理对马铃薯块茎产量的影响

显著标准：L.S.D 0.05＝5.77kg(16.97％)；L.S.D 0.01＝8.22kg(24.18％)

结果分析：菌液对马铃薯生物学性状的影响见表3所示，菌液对马铃薯产量的影响如表4所示，应用P.muc 3016菌液于马铃薯，马铃薯产量达到1768kg/亩与对照组1417kg/亩相比增加24.7％，差异达极显著水平，增收效益达250元。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种胶冻样类芽孢杆菌，其特征在于：所述胶冻样类芽孢杆菌为P.muc 3016CGMCC No.4100，该胶冻样类芽孢杆菌的16S rDNA如序列表1所示，所述胶冻样类芽孢杆菌同时具有固氮、溶磷和解钾的作用。

2.权利要求1所述胶冻样类芽孢杆菌的培养方法，是指将该细菌置于培养基中进行发酵培养，其特征在于，所述培养基包含下列浓度的物质：碳源0.2～0.8g/L、豆粕粉2.0～8.0g/L、硫酸铵0.6～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.6g/L、磷酸二氢钾0.1～0.6g/L、磷酸氢二钾0.4～1.5g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.1～0.5g/L，培养基的pH为7.5～7.0；所述碳源选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。

在发酵培养过程中还包括下述步骤：

(1)、发酵培养中间补料流加碳源，保持发酵培养基中碳源含量不高于0.05％；

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养基包含下列浓度的物质：碳源0.4～0.6g/L、豆粕粉4.0～6.0g/L、硫酸铵0.9～1g/L、硫酸镁0.3～0.5g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钾0.8～1g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.2～0.4g/L。

4.培养权利要求1所述胶冻样类芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于：所述培养基包括下列浓度的物质：碳源0.2～0.8g/L、豆粕粉2.0～8.0g/L、硫酸铵0.6～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.6g/L、磷酸二氢钾0.1～0.6g/L、磷酸氢二钾0.4～1.5g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.1～0.5g/L，培养基的pH为7.5～7.0；所述碳源选自淀粉、糖蜜或蔗糖中的一种或两种以上的组合。。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述培养基包含下列浓度的物质：碳源0.4～0.6g/L、豆粕粉4.0～6.0g/L、硫酸铵0.9～1g/L、硫酸镁0.3～0.5g/L、磷酸二氢钾0.3～0.5g/L、磷酸氢二钾0.8～1g/L、硫酸钙0.1～0.2g/L和碳酸钙0.2～0.4g/L。