CN101961331A - 泛素e1抑制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及泛素E1抑制剂及其制备方法，根据PRY-41(4[4-(5-硝基-呋喃基-亚甲基)-3，5-二氧代-吡唑烷-1-基]-苯甲酸乙酯)的结构，采用液相有机合成的方法制备成具有不同替代基团的系列化合物Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮及其相关衍生物(如：4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮等)。本发明的泛素E1抑制剂，可以用于抑制泛素化作用介导的蛋白降解和泛素化作用的非降解功能，特别是在抑制剂阻断NFκB活性的过程中，该抑制剂可以杀死含有p53的转化细胞，即，该抑制剂可能具有治疗肿瘤的潜在特性，也可作为研究泛素蛋白酶体系统作用机理的重要工具。

Description

泛素E1抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种泛素E1抑制剂的化合物及其衍生物和制备方法。

背景技术

泛素蛋白酶体系统(UPS)，主要包括结合酶(E1，E2和E3)和降解复合物(蛋白酶体)。E1通过其活性半胱氨酸与泛素C端形成一个高能硫酯键，从而活化泛素。继而，该键被转移到E2的半胱氨酸活性位点。E3与E2相互作用，识别靶蛋白催化所结合的泛素，并通过异肽键将靶蛋白上的赖氨酸残基转变成为ε氨基基团。被活化的泛素，也可以与已经结合于靶蛋白上的泛素结合，最终形成多聚泛素链。这些泛素可以通过其7个赖氨酸中的一个(特别是K48和K63)进行连接。现已证实，通过K48连接的多聚泛素链发挥的泛素化作用，通常介导靶蛋白进入蛋白酶体的降解过程。相比之下，K63连接的多聚泛素链则通常在Toll样受体的结合以及细胞因子诱导的NFκB活化过程中发挥重要作用。在哺乳动物细胞中，仅存在一种E1、约30种E2和上百种E3。大部分E3具有RING指结构特异性模体，但其催化机理尚未阐明。因此，阻断泛素蛋白酶体的最为有效的方法，是抑制E1或蛋白酶体的功能。值得注意的是，虽然通过抑制蛋白酶体的功能可以阻断泛素作用介导的蛋白降解作用，但是E1功能的抑制还可以进一步阻碍泛素化作用介导的非蛋白降解功能。

大量研究结果显示，多数肿瘤细胞内均存在泛素蛋白酶体系统的异常，人们进一步通过表达癌基因(c-myc和c-jun)和去稳定化抑癌基因p53的实验，对该现象进行了证实。因此，靶向泛素蛋白酶体系统已被认为是一种可用于开发新型抗肿瘤小分子化合物药物的可靠途径。

近年来发现了一种可以渗透入细胞的小分子物质，名为PYR-41(4[4-(5-硝基-呋喃基-亚甲基)-3，5-二氧代-吡唑烷-1-基]-苯甲酸乙酯)，是泛素E1的抑制剂。同时可以在细胞内和体外发挥作用。研究表明它可以通过Michael加成作用攻击泛素E1的活化半胱氨酸位点，而非E2的半胱氨酸活化位点。PYR-4不仅可以诱导非转化细胞的生长阻滞，它还可以引起转化细胞的凋亡。当PYR-41与转化后的小鼠胚胎成纤维细胞共同孵育后，该药可杀伤具有野生型p53的细胞，而p53阴性的细胞则相对耐受。因此，PYR-41是一种可用于肿瘤治疗研究的新药。同时，也有报道指出，PYR-41可以通过TNFα和IL-1抑制NFκB的活化。这主要是因为它可以抑制TRAF的泛素化作用，该作用可以使IκB磷酸化。通过该种作用可以阻断磷酸化IκB的泛素化作用。因此，E1抑制剂可应用于研究不同细胞中所存在的泛素化作用，特别是对于那些不参与蛋白酶体降解过程的作用机理的研究，E1抑制剂更是一种极为有用的工具。PYR-41(IC50约为10μM)具有强疏水性，不能很好溶解于水溶液。而且，根据Lipinski条例，该物质含有不能作为理想药物的基团。因此，极有必要研制一种具有良好药用物理化学特性的泛素E1抑制剂药物，通过动物实验，深入研究泛素化作用在不同细胞过程中的功能。

肿瘤是目前导致世界人口死亡的主要病因之一。多种肿瘤的治疗，急需更为有效、更为安全的化疗方案问世。现有结果表明，靶向泛素蛋白酶体系统是研发新型肿瘤治疗策略的有效途径。泛素E1抑制剂可以用于抑制泛素化作用介导的蛋白降解和泛素化作用介导的非降解功能。特别是在抑制剂阻断NFκB活性的过程中，该抑制剂可以杀死含有p53的转化细胞，这一结果显示，该抑制剂可能具有治疗肿瘤的潜在特性；同时，它也是一种可用于研究泛素蛋白酶体系统作用机理的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种制备泛素E1抑制剂的方法，继而可以依该物质为先导，便于深入对其进行药物治疗应用的研究。

本发明的阶段性成果及启示：根据PYR-41的结构，以小鼠泛素E1催化区为基础，使用泛素C端的5个氨基酸残基组成的肽与其进行空间对接。如图1所示，该肽结合于E1催化区域中间的大中心裂口部位。与以往研究一致的是泛素的C端与E1形成硫酯结构，甘氨酸的COOH基团位置很接近活化的半胱氨酸(图1A)。与泛素五肽相似的是，在空间接入实验中，PYR-41也接入到泛素E1的中间大裂隙中(如图1B和C)。PYR-41在裂隙中存在3个可能的结合方式(图1B)，其中一个位于PYR-4的亲核受体部分。该位点十分接近于活化的半胱氨酸位点(图1C)。以上发现为PYR-41共价修饰泛素E1的观点以及合理设计新型抑制剂药物，提供了可靠的分子结构基础。

本发明是这样实现的：

该泛素E1抑制剂，是根据PRY-41(4[4-(5-硝基-呋喃基-亚甲基)-3，5-二氧代-吡唑烷-1-基]-苯甲酸乙酯)的结构，采用液相有机合成的方法制备成具有不同替代基团的系列化合物Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮及其相关衍生物。

所说系列化合物Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮及其相关衍生物，包括：4-((-5-硝基呋喃-2-烃基)亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；4-(亚萘基-1-基亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；1-苯基-4-(2，4，6-三甲氧苯亚甲基)吡唑烷-3，5-二酮；4-(4-氯苯)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮；4-(4-(苯甲氧基)-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；N-(4-((3，5-二氧代-1-苯吡唑烷-4-亚基)甲基)苯基)乙酰胺；4-(4-(二甲氨基)苯亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮；4-(环丙烷六亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮。

该系列化合物及其衍生物，采用液相有机合成的方法制备，制备方法如下：

1.通过盐酸肼与无水碳酸钠反应产生肼取代产物(ii)，收率为85-95％；

2，肼取代产物(ii)与酰基氯(iv)反应产生酰化肼(例如：甲基-3-氧代-3-(2-苯肼)丙酸(iii))使用吡啶作为碱基，回收率为60-70％；

3.来源于化合物(iii)1-苯吡唑烷-3，5-二酮(v)，在酒精中与氢氧化钠反应，使化合物(iii)环合，回收率为40-50％；

4.PYR-41的预测类似物(vii)通过吡唑烷二酮(v)与一分子醛反应合成，回收率为30-55％。

5.上述反应中，加入苯肼和4-乙氧基-3-甲氧苯甲醛，便可以获得PYR-41的类似物4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(vii)。

如下述路线I，III，IV所示，Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮，即为本发明中所述的化合物分子式(其中Y为不同的取代基团)。方案II所述产物4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮，即为该化合物的其中一种具体分子式。

方案I：抑制剂分子库的合成路线(路线I)

方案II：化合物合成(VIII)

方案III：抑制剂分子库的合成路线(路线II)

方案IV：抑制剂分子库的合成路线(路线III)

方案I-IV中I，III和IV分别描述了3种Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮化合物的合成和制备方法。方案II中具体描述了一种经过取代某些基团制备成的小分子化合物4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮。

表1.E1抑制剂

NMR结果如表1所示1-9化合物。

4-((-5-硝基呋喃-2-烃基)亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(1)：

HNMR(DMSO-d6，δ)，7.02-8.10(m，7H)，8.81(s，1H).

4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(2)：

H¹NMR(DMSO-d6，δ)，1.47(t，3H)，3.96(s，3H)，4.26(q，2H)，7.23-7.33(m，2H)，7.53-7.58(m，2H)，

7.81-7.97(m，3H)，8.12-8.16(m，1H)，8.7-8.95(m，1H).

4-(亚萘基-1-基亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(3)：

H¹NMR(DMSO-d6，δ)7.33(t，1H)，7.52-7.61(m，2H)，7.73-7.87(m，4H)，8.17(d，J＝6Hz，1H)，

8.29(d，J＝9Hz，2H)，8.70-8.90(m，2H).

1-苯基-4-(2，4，6-三甲氧苯亚甲基)吡唑烷-3，5-二酮(4)

H¹NMR(DMSO-d6，δ)10.90(br，1H)，7.89-7.84(m，3H)，7.54(m，2H)，7.28(m，1H)，6.42(s，2H)，

4.17-3.92(m，9H).

4-(4-氯苯)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(5)：

H¹NMR(DMSO-d6，δ)7.31(t，1H)，7.53-8.04(m，7H)，8.72(m，2H).

4-(4-(苯甲氧基)-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(6)：

H¹NMR(DMSO-d6，δ)，3.96(s，3H)，5.36(s，2H)，7.29-8.2(m，13H)，8.92(m，1H).

N-(4-((3，5-二氧代-1-苯吡唑烷-4-亚基)甲基)苯基)乙酰胺(7)：

H¹NMR(DMSO-d6，δ)，2.22(s，3H)，6.75(m，1H)，7.52(m，2H)，7.82(m，5H)，8.71(m，2H)，10.56(s，1H)

4-(4-(二甲氨基)苯亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(8)：

H¹NMR(DMSO-d6，δ)，3.2(s，6H)，6.94(d，J＝12Hz，2H)，7.24(m，1H)，7.50(m，2H)，7.80(m，3H)，8.68(br，2H).

4-(环丙烷六亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(9)：

H¹NMR(CDCl3，δ)，7.30-7.79(m，6H)，3.98-3.72(m，1H)，2.04-1.05(m，10).

发明人已经采用液相有机合成的方法制备成功多种PYR-41类似物，这些化合物及其回收率列于表1中，其他类似化合物可通过相似过程合成(化合物(vii)，方案I)。实验过程如下：

基于PRY-41的结构，本发明之泛素E1抑制剂是具有不同替代基团的系列化合物。R和Y在复合物TM1中表示替代基团，其中可以包括：烃基、芳香基、杂环或其他可以作为E1抑制剂的基团。经过液相和固相阶段进行有机合成。目前至少存在200种(R＝20，Y＝10)可以用于活性评估的化合物及其衍生物。也可以通过减少双键，在TM2化合物中增加Z替代基团制备E1抑制剂(Z包括：氢、烃基、烷氧基、芳香基等)。

本发明以一种或者几种化合物的成分，进行盐化、溶剂化或至少使用一种药用载体进行药物制剂的制备。该泛素E1抑制剂的应用，包括使用一种或多种有效剂量的化合物对目的细胞或患者进行治疗研究。

本发明中的化合物，包括化合物本身及其相关盐化，溶剂化，水化，多形变体或前体药物。术语“药用盐化”指由任何一种实验体化合物制备成的盐，其含有酸性功能基团，如羧酸功能基团和一种药学中可接受的有机或无机碱。其中适用的碱包括但并不局限于碱性金属的羟基(如：钠，钾，锂)，碱土金属的羟基(如：钙和镁)，其他金属的羟基(如：铝和锌)，铵和有机胺(如：非替代或羟基替代的单，双或三烷基胺，双环己胺，三丁基胺，吡啶，N-甲基，N-乙胺，二乙胺，三乙胺)，单，双或三(2-羟基低烷胺)(如：单，双或三(2-羟乙基)胺)，2-羟基-叔-氨基丁烷或3-(羟甲基)甲胺，N，N-2-低烷基-N-(羟基低烷基)-胺(如：N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或3-(2-羟乙基)胺)，N-甲基-D-葡萄糖胺以及氨基酸(如：精氨酸，赖氨酸及类似物)。术语“药用盐”指以前面所述任一种具有基本功能基团的实验体化合物制备而成的盐(如：一个氨基功能基团和一个药用有机或无机酸，其中适当的酸包括：硫氢酸，柠檬酸，乙酸，乙二酸，盐酸，溴化氢，碘化氢，硝酸，磷酸，乳酸，水杨酸，酒石酸，抗坏血酸，丁二酸，马来酸，苯磺酸，富马酸，葡糖酸，葡糖糖醛酸，甲酸，苯甲酸，谷氨酸，甲磺酸，乙磺酸和P-甲苯磺酸)。

其中，X是独立的氧，硫或NR¹基团。

每个R¹是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，如C(O)R，C(O)OR或C(O)NRR²每个基团可由取代基进行替代。

每个R²是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，每个基团可由取代基进行替代。

每个R是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基，每个基团可由取代基进行替代。

Y是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基，芳香基，杂芳香基，硝基或卤素。

其中，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基，芳香基，杂芳香基团可以被H，卤素，氰基，烷氧基，硫醚，NR³R⁴，S(O)R⁵，S(O)₂R⁵。

每个R³和R⁴是选自H，烃基，芳烷基或芳香基的独立基团，其中，R⁵是OH，OR³，NH₂或NHR³。

Z是H，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，杂环芳香基，卤素，C(O)R³，C(O)OR³，C(O)SR³，C(O)NR³R⁴，C(S)OR³，C(NR¹)OR³，C(NR¹)NR³R⁴。

Z₂是H，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，杂环芳香基，卤素，C(O)R³，C(O)OR³，C(O)SR³，C(O)NR³R⁴，C(S)OR³，C(NR¹)OR³，C(NR¹)NR³R⁴。

m和n是独立的0-5之间的整数。

这些术语和专有名词(例如：烃基，烯基，炔基，杂烷基，芳香基，杂环芳香基等)的解释可以从教材或者以前的公知技术中获得(例如：美国专利申请20080306130)。

本发明可用于研发治疗或者预防细胞恶性增长疾病或异常的新型小分子化合物。该化合物可应用于易发生或者患不良细胞增殖疾病或细胞异常的肿瘤患者的治疗研究，其首选应用是抗肿瘤治疗研究，其中包括使用一种或多种上述的化合物，单一或混合用于抗肿瘤治疗研究(恶性肿瘤包括实体瘤和微转移肿瘤)。

本发明可用于研发治疗和预防肿瘤、逆转录病毒感染、免疫反应疾病及免疫异常状态的新型药物和方法。包括：使用上述化合物对患病的哺乳动物和病变细胞进行治疗研究。这种方法包括使用一种或多种有效剂量的化合物对目的细胞或患者进行治疗研究。重要的是，该化合物及其衍生物的应用可以改变患者相关疾病的检测指标，病变细胞的数目和/或减少病毒的量，从而达到研究开发治疗或缓解疾病进程的新策略。实验结果表明，本发明中的化合物还可以抑制哺乳动物细胞的自噬，其中包括人类在内的灵长类动物细胞。

本发明中所述的化合物，还可用于研究开发患者的体外局部涂抹治疗，例如：本化合物可用于银屑病和狼疮疾病造成的皮肤炎症损伤或异常病灶的外用治疗新方法的研究。

本发明可应用于研发的治疗方法还包括对适应人群的疾病或者异常状态的鉴别，例如：鉴别适合该类化合物及其衍生物研发治疗的肿瘤患者；炎症或免疫反应疾病及异常状态人群；逆转录病毒易感人群。这种鉴别方法可用于患者自身或保健专业人员的判断。其中包括主观选择或客观检测(通过测试或者诊断方法开展)。已知肿瘤相关检测包括患者样本分析，例如：组织活检或者患者体液(血液和唾液等)检测；肿瘤细胞或肿瘤的蛋白质标志物检测；逆转录病毒感染的测试(如：HIV感染)。已有研究证实，HIV感染的检测包括PCR扩增和病毒RNA的检测，抗HIV抗体的免疫印迹检测，抗HIV抗体的凝集实验，HIV特异性抗原的ELISA检测和线性免疫检测方法。在每项方法中，需要提供患者的生物样本，如：血液，血浆，精液或唾液。因此，本发明中的方法包括采集个体的生物学样本；对样本进行检测，确定是否存在肿瘤标志物或反转录病毒的感染，如HIV感染，HIV颗粒或HIV核酸；根据本发明所描述的内容确定该个体是否需要进行相关治疗研究。检测炎症和免疫相关异常状态的方法目前已有报道，其中包括：患者样本分析(例如：皮肤样本，活检组织或者患者体液(如：血液和唾液))和患者的特殊检查(如：患者炎症或免疫反应区域皮肤的检查)。

本发明还包括在治疗或预防研究领域中相关新型小分子化合物对患者体内标志物或者诊断指标的变化影响(这些指标的变化包括：出现，消失，增加和减少)。其中标志物和检测指标包括(肿瘤，炎症和免疫相关异常状态，逆转录病毒的感染(如：HIV感染，HIV复制，病毒载量或者HIV感染标志物的表达))。更重要的是，通过这些评估可以为早期治疗研究的开展提供依据。如上所述，本发明中的方法包括了：(1)采集和分析样本。样本可以是细胞，遗传物质，组织或体液(例如：血液，血浆和唾液等)。(2)将样本的分析结果报告给个体或者其他卫生保健专家。(3)提供相关疾病及症状的治疗研究方法。

本发明中所说的个体和患者可以互换。其中的个体和群体主要指动物，特别是哺乳动物，包括灵长类和非灵长类(例如：猴，猿或人)，尤其指人。具体来讲，个体是一个免疫缺损或免疫抑制的哺乳动物，以人为主(例如：HIV感染患者)。另一种情况，个体是具有不良细胞(特别是肿瘤细胞)增殖的哺乳动物，以肿瘤患者为主。

本发明中的化合物可以抑制E1进行其他泛素样修饰。本发明之化合物通过调节个体E1相关泛素化作用以研发治疗疾病及异常状态的新型药物和治疗方法。使用上述实验式I和/或II的化合物及其衍生物对个体进行研究，应用一种剂量或某种条件下使用的充足剂量。有效剂量和用药方法可以参照以往情况选择。例如：以标准效能评估结果为依据。通过化合物及其衍生物研究效果以及E1相关泛素化作用的改变，对该化合物及其衍生物进行体内和体外肿瘤及病毒感染的研发效果进行评估。

本发明中所述的化合物也可用于探明泛素系统及泛素化作用对非蛋白酶体的抑制功能。除了在蛋白酶体降解靶蛋白过程中发挥作用外，泛素系统也参与了很多细胞内与蛋白酶体降解无关的过程，包括：胞吞作用，内涵体的运输，病毒出芽，DNA修复，核与胞质的运输与激酶活化。更有意义的是，目前仅有少数工具可用于这些过程中泛素系统的功能研究。

本发明可应用于多种前期药物的研发：以一种或多种化合物的有效剂量在需要研究的细胞或个体内发挥作用。其中个体包括哺乳动物，如灵长类，特别是人。其中的方法包括：个体(已发现的需要研究的个体)应用前面所述一种化合物或多种化合物的有效剂量进行研究。其特征在于，研究个体的鉴别可由个体或卫生保健专家通过主观(选择)或客观(例如：通过诊断或检测方法测试)进行判断。

本发明中的化合物，可以使用单一或混合的方法与其他治疗药物联合研究开发新的治疗策略。该化合物或混合物可作为药物制剂的成分与传统赋形剂混合(例如：药用有机或无机载体物质)用于口服，肠外，肠内或局部应用。该赋形剂不会与活性化合物产生有害反应，也不会给受体造成有害反应。其中，适当的药用载体包括但不局限于水，氯化钠溶液，酒精，植物油，聚乙二醇，凝胶，乳糖，直链淀粉，硬脂酸镁，滑石粉，硅酸，粘性石蜡，香精，脂肪酸甘油一脂和甘油二脂，脂肪酸脂，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等。药物的制备过程可进行灭菌。如有需要，该化合物可以与辅助药物混合(例如：润滑剂，防腐剂，稳定剂，湿润剂，乳化剂，可用于调整渗透压的盐，缓冲液，颜色，香料和/或芳香族物质，以及与活性化合物不发生有害反应的类似物)。

根据所使用的不同活性化合物的特点，尤其是实验体的化合物成分，使用方法以及给药途径等调整应用剂量。根据前期资料和指导方案，按照常规剂量的设定可以确定本发明中最佳用药频率和方案。同时，经过参考《Remington制药科学》中的内容，从总体上确定本发明中所述的一种或多种化合物的适当有效剂量(特别是使用多种化合物时)的范围为0.01-100mg/kg受试者体重/天，较佳范围为0.01-20mg/kg受试者体重/天，最佳范围为0.05-4mg/kg受试者体重/天。最低剂量为0.01mg/kg/天到90mg/kg/天之间的任意剂量，最高剂量为1mg/kg/天到100mg/kg/天之间的任意剂量(例如：0.5mg/kg/天和2mg/kg/天，5mg/kg/天和20mg/kg/天)。其中，最佳剂量每天使用一次或亚剂量每天使用多次(例如：2-4次亚剂量)适当间隔或以其他适当进度进行治疗研究。这种亚剂量使用时可作为一个单位剂量，例如每单位剂量含有0.05-10mg的本发明所述化合物，最低剂量为0.05mg/天到400mg/天之间的任意剂量；最高剂量为1mg/天到500mg/天之间的任意剂量(例如：5mg/天和100mg/天，150mg/天和500mg/天)。

本发明中所描述的药用衍生物或前体药物指：任何可药用的盐、酯、酯类盐或其他本发明中化合物的衍生物。应用于受体时可直接或间接提供本发明中所述的活性化合物。其中，当该化合物及其衍生物可能具有研究开发治疗肿瘤的潜在特性应用于哺乳动物(例如：通过口服化合物)治疗研究时因为具备更易于吸收入血或增加母体化合物传递入生物学屏障(例如：大脑和中枢神经系统)等特点，而增加本发明中所述化合物的生物利用度的衍生物和前体化合物及其衍生物是本发明的重点内容。好的前体化合物及其衍生物是指在本发明所述的实验体结构基础上附加一个基团后可以增加化合物及其衍生物的水溶性或通过消化道粘膜主动转运的衍生物。

附图说明

图1.泛素或PYR-41与E1进行空间对接模拟示意图；

图2.本发明泛素E1抑制剂制备方法的工艺流程图；

图3.本发明中所述的部分化合物可有效减少泛素-E1结合免疫印迹实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图叙述一个实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1：泛素E1抑制剂化合物及其衍生物的制备

图2显示了本实施例的制备方法和工艺流程：

(a)制备无碱肼基，以苯肼为例(见方案II)：

在50ml含有0.01M盐酸苯肼水溶液中加入无水碳酸钠(0.015M)，用二氯甲烷萃取3次，每次30ml，获得溶液。用无水碳酸钠干燥并浓缩释放苯肼，无需纯化便可用于后续合成。

(b)制备化合物(iii)，甲基-3-氧代-3-(N’-苯肼基)丙酸

将苯肼(5.94g，55mM)溶解于100ml无水THF和Et₃H(8.11ml，58.3mM)。混合反应物冷却至-10℃，逐滴加入50ml含有甲基-3-氯-3-氧代-丙酸(7.12ml，56.6mM)无水THF。反应混合物加热到室温并搅拌1小时，将反应混合物用100ml水稀释，再用乙酸乙酯萃取3次，每次100ml。用100ml水和100ml盐水清洗已经结合的有机相，然后置硫酸钠中干燥，过滤浓缩，回收棕色溶液。

(c)制备化合物(v)，1-苯基吡唑烷-3，5-二酮

粗制甲基-3-氧代-3-(N’-苯肼基)丙酸(8g，38mM)溶于100ml乙酮并加入乙醇化1N氢氧化钠溶液(110ml，110mM)。反应混合物于室温搅拌30分钟，加入1N盐酸溶液调整pH为4。经过滤，收集形成的沉淀，水洗3次，每次20ml。真空干燥回收标题化合物为米色溶液。

(d)制备化合物(vii)4-((-5-硝基呋喃-2-烃基)亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮

将1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(250mg，1.4mM)和5-硝基-2-呋喃甲醛(1.8mM)加入无水乙醇中，加热回流过夜。冷却至室温后，过滤收集沉淀。用无水乙醇清洗固相3次，每次10ml。真空干燥获得标题化合物。

实施例2：泛素E1抑制剂化合物及其衍生物的泛素E1抑制作用检测

实验方法：使用DMEM/F-12培养基(Hyclone，logan，UT)(其中含有10％FCS，0.3％碳酸氢钠，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养RPE细胞，用于检测泛素E1抑制剂渗透进入细胞，并在细胞内结合E1泛素复合物的水平。将细胞接种于12孔组织培养板中，培养过夜，细胞融合度达到85％。用DMSO，PYR-41(50μM)和化合物(50μM)孵育30分钟。用PBS轻柔洗2次，加入裂解缓冲液将细胞刮下(裂解缓冲液：5mM Tris-HCl，pH6.8，8.7M尿素，1％NP-40，20mM N-己基顺丁烯二酰亚胺，3mM EDTA，10mM碘乙酰胺和混合蛋白酶抑制剂)，简单超声，12000转/分钟，4℃离心20分钟，收集上清。将样本分成等量2部分，分别加入不含和含有400mM DTT的4倍载样缓冲液中，用8％的低浓度胶进行SDS-PAGE，使用抗E1抗体进行免疫印迹，如前所述。

实验结果：通过搜索现存的化学分子数据库，发现了30个商业化的PYR-41类似物。当使用化合物(表1中所述：4-((-5-硝基呋喃-2-烃基)亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(1)；4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(2)；4-(亚萘基-1-基亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(3)；1-苯基-4-(2，4，6-三甲氧苯亚甲基)吡唑烷-3，5-二酮(4)；4-(4-氯苯)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(5)；4-(4-(苯甲氧基)-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(6)；N-(4-((3，5-二氧代-1-苯吡唑烷-4-亚基)甲基)苯基)乙酰胺(7)；4-(4-(二甲氨基)苯亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(8)；4-(环丙烷六亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮(9))处理PREV细胞(图3)时，其中部分化合物(表1)可有效减少泛素-E1结合物的水平。结果如图3所示。RPE细胞经10mM化合物作用30分钟，将细胞裂解物进行SDS-PAGE，转移至硝酸纤维膜上，用抗泛素E1抗体进行免疫印迹，上面的条带显示与E1结合的泛素。进行非变性SDS-PAGE后，免疫印迹显示该条带消失。

说明：

1、化合物可选形式为以下的实验体或药用盐，溶剂或水合物，如下：

其中每个X是独立的O，S或NR¹；

每个R¹是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，如C(O)R，C(O)OR或C(O)NRR²每个基团可由取代基进行替代。

每个R²是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，每个基团可由取代基进行替代。

每个R是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基，每个基团可由取代基进行替代。

Y是独立的氢，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基，芳香基，杂芳香基，硝基或卤素。

其中，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基，芳香基，杂芳香基团可以被H，卤素，氰基，烷氧基，硫醚，NR³R⁴，S(O)R⁵，S(O)₂R⁵。

每个R³和R⁴是选自H，烃基，芳烷基或芳香基的独立基团，其中，R⁵是OH，OR³，NH₂或NHR³。

Z是H，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，杂环芳香基，卤素，C(O)R³，C(O)OR³，C(O)SR³，C(O)NR³R⁴，C(S)OR³，C(NR¹)OR³，C(NR¹)NR³R⁴。

Z₂是H，烃基，烯基，炔基，环烷基，芳烷基，杂烷基或芳香基，杂环芳香基，卤素，C(O)R³，C(O)OR³，C(O)SR³，C(O)NR³R⁴，C(S)OR³，C(NR¹)OR³，C(NR¹)NR³R⁴。

m和n是独立的0-5之间的整数。

2、使用说明1中的一个或多个化合物应用有效剂量用于个体疾病的研发领域。可用于病毒，肿瘤，银屑病或狼疮易发病个体的研究。

3、局部应用混合化合物及其衍生物研究开发治疗银屑病或者狼疮的方法，包括：(i)说明1中的一种或多种化合物；(ii)药用载体。

Claims (4)

1.泛素E1抑制剂，其特征在于：根据PRY-41(4[4-(5-硝基-呋喃基-亚甲基)-3，5-二氧代-吡唑烷-1-基]-苯甲酸乙酯)的结构，采用液相有机合成的方法制备成具有不同替代基团的系列化合物Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮及其相关衍生物。

2.根据权利要求1所述泛素E1抑制剂，其特征在于，所说系列化合物Y-1-苯吡唑烷-3，5-二酮及其相关衍生物，包括：4-((-5-硝基呋喃-2-烃基)亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；4-(亚萘基-1-基亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；1-苯基-4-(2，4，6-三甲氧苯亚甲基)吡唑烷-3，5-二酮；4-(4-氯苯)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮；4-(4-(苯甲氧基)-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮；N-(4-((3，5-二氧代-1-苯吡唑烷-4-亚基)甲基)苯基)乙酰胺；4-(4-(二甲氨基)苯亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮；4-(环丙烷六亚甲基)-1-苯基吡唑烷-3，5-二酮。

3.根据权利要求1所述泛素E1抑制剂的制备方法，其特征在于，依下述步骤进行：

1)通过盐酸肼与无水碳酸钠反应，产生肼取代产物(ii)，收率为85-95％；

2)肼取代产物(ii)与酰基氯(iv)反应，产生酰化肼，使用吡啶作为碱基，回收率为60-70％；

3)来源于化合物(iii)的1-苯吡唑烷-3，5-二酮(v)，在酒精中与氢氧化钠反应，使化合物(iii)环合，回收率为40-50％；

4)PYR-41的预测类似物(vii)通过吡唑烷二酮(v)与一分子醛反应合成，回收率为30-55％。

5)在上述4的反应中，加入苯肼和4-乙氧基-3-甲氧苯甲醛，便获得PYR-41的类似物4-(4-乙氧基-3-甲氧苯亚甲基)-1-苯吡唑烷-3，5-二酮(vii)。

4.根据权利要求1所述泛素E1抑制剂，其特征在于，所说的化合物，包括化合物本身及其相关盐化，溶剂化，水化，多形变体或前体药物。

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