CN101959419A - 具有鞘翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供获自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株的核酸，及其变体和其片段，其编码具有针对包括鞘翅目的虫害的杀虫活性多肽。本发明的特定实施方式提供编码杀虫蛋白的分离的核酸、杀虫组合物、DNA构建体，和包含实施方式的核酸的转化的微生物和植物。所述组合物用于控制害虫尤其是植物害虫的方法。

Description

具有鞘翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因

发明领域

本发明涉及从新的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)基因获得的天然存在的核酸和重组核酸，所述基因编码以抗虫害杀虫活性为特征的杀虫多肽。本发明的组合物和方法使用所公开核酸及其所编码的杀虫多肽来控制植物疫害。

发明背景

虫害是世界农作物损失的主要因素。例如，西方玉米根虫(Western corn rootworm)进食、黑切根虫损害或欧洲玉米螟损害可以在经济上摧毁农业生产者。仅欧洲玉米螟攻击田地和甜玉米带来的虫害相关的农作物损失就已在损害和控制开销上达到每年十亿美元。

传统地，影响虫害群体的主要方法是应用广谱化学杀昆虫剂。然而，消费者与政府调节员一样越来越关心与生产和使用合成的化学杀虫剂相关的环境危害。调节员出于这种关心已禁止或限制使用一些更为危险的杀虫剂。因此，开发替代杀虫剂具有实质性利益。

使用诸如真菌、细菌或其它昆虫物种的微生物剂对农业上重要的虫害进行生物学控制，这为合成的化学杀虫剂提供了对环境友好且具有商业吸引力的替代途径。一般来讲，使用生物杀虫剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂相对于传统广谱化学杀昆虫剂的性质提供了更强的靶标特异性。此外，生物杀虫剂的生产成本通常更低，并因而提高大量品种的农作物的经济收益。

已知芽孢杆菌属的某些种的微生物具有抗广谱虫害的杀虫活性，所述虫害包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)及其它。苏云金芽孢杆菌(Bt)和甲虫芽孢杆菌(Bacillus papilliae)属于迄今所发现的最为成功的生物控制剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)(Harwook，ed.，((1989)Bacillus(芽孢杆菌)(Plenum Press)，306)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)(WO 96/10083)菌株。虽然也已从营养生长期的芽孢杆菌分离出杀虫蛋白，但是杀虫活性看上去集中在伴孢晶体蛋白包涵体上。已分离并表征编码这些杀虫蛋白的数种基因(参见，例如，美国专利第5,366,892号和第5,840,868号)。

微生物杀昆虫剂，特别是获自芽孢杆菌菌株的那些，作为化学疫害控制的替代品在农业上起重要作用。近来，农业科研工作者通过基因工程改造农作物植物来产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，已开发出具有增强的昆虫抗性的农作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以产生分离自Bt菌株的杀虫蛋白(参见，例如，Aronson(2002)CellMol.Life Sci.59(3)：417-425；Schnepf et al.(1998)Microbiol Mol Biol Rev.62(3)：775-806)。这些基因工程农作物现在广泛用于美国农业，并且向农民提供了传统昆虫控制方法的环境友好替代品。此外，已向美国农民销售经基因工程改造而包含杀虫的Cry毒素的马铃薯。

仍需要具有更广泛的抗虫害杀昆虫活性的新的Bt毒蛋白，例如对鞘翅目中更多品种的昆虫具有活性的毒素。此外，仍需要具有抗更多虫害活性的生物杀虫剂和具有改良杀昆虫活性的生物杀虫剂。

发明概述

本发明提供影响虫害的组合物和方法。更具体地，本发明的实施方式涉及影响昆虫的方法，所述方法利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列，从而产生表达实施方式中的杀昆虫多肽的转化的微生物和植物。这些害虫包括农业上重要的害虫，诸如，例如，西方玉米根虫，例如玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera LeConte)。在一些实施方式中，该核苷酸序列编码对属于鞘翅目的至少一种昆虫具有杀虫性的多肽。

实施方式提供核酸及其片段和其变体，其编码具有抗虫害杀虫活性的多肽(例如，编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)。实施方式的野生型(例如，天然存在的)核苷酸序列编码新的杀昆虫肽，所述核苷酸序列获得自Bt。实施方式还提供所公开的编码生物学活性(例如，杀昆虫)多肽的核苷酸序列的片段及变体。

实施方式还提供分离的杀虫(例如，杀昆虫)多肽，其由实施方式的天然存在的核酸或经修饰的(例如，突变的或经操作的)核酸所编码。在特定实例中，实施方式的杀虫蛋白包括全长蛋白和多肽的片段，其产生自突变的核酸，所述核酸经设计以将特定氨基酸序列引入实施方式的多肽。在特定实施方式中，所述多肽相对于其衍生自的天然存在的多肽具有增强的杀虫活性。

实施方式的核酸还可以用于产生转基因的(例如，转化的)单子叶或双子叶植物，所述植物的特征在于基因组包含至少一个稳定整合的核苷酸构建体，所述构建体包含实施方式的编码序列，所述编码序列与驱动所编码杀虫多肽表达的启动子可操作地连接。因此，还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。

在特定实施方式中，可以使用经优化而在宿主植物中提高表达的核酸来产生转化的植物。例如，可以回译(backtranslate)实施方式的一种杀虫多肽，从而产生包含为在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸，所述特定宿主例如诸如玉米(Zea mays)植物的农作物植物。这种转化的植物(例如，双子叶或单子叶植物)表达编码序列，从而导致产生杀虫多肽，并赋予所述植物增加的昆虫抗性。一些实施方式提供表达杀虫多肽的转基因植物，所述杀虫多肽用于影响各种虫害的方法。

实施方式还包括含有实施方式的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物，并且可以任选地包括另外的杀昆虫肽。实施方式包括将该组合物应用于虫害环境，从而影响虫害。

发明详述

本发明的实施方式涉及影响虫害、特别是植物疫害的组合物和方法。更为具体地，实施方式的分离的核酸及其片段和其变体包含编码杀虫多肽(例如蛋白)的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对诸如但不限于鞘翅目虫害的虫害具有生物学活性(例如杀虫性)。目的虫害包括但不限于西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)。

实施方式的组合物包含分离的核酸及其片段和其变体，其编码杀虫多肽、包含实施方式的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白和杀虫组合物。一些实施方式提供经修饰的杀虫多肽，所述多肽的特征在于相对于相应野生型蛋白的杀虫活性具有改良的抗鞘翅目杀昆虫活性。实施方式还提供用这些新的核酸转化的植物和微生物，以及涉及将该核酸、杀虫组合物、转化生物体及其产物用于影响虫害的方法。

实施方式的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物体，从而产生所编码的杀虫蛋白。所提供的方法涉及将该转化生物体用于影响或控制植物疫害。实施方式的核酸和核苷酸序列还可以用于转化诸如叶绿体的细胞器(McBride et al.(1995)Biotechnology 13：362-365；和Kota et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1840-1845)。

实施方式还涉及鉴定编码生物学活性杀虫蛋白的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核苷酸序列直接用于影响疫害、特别是诸如鞘翅目疫害的虫害的方法。因此，实施方式提供影响虫害的新方法，所述方法不依赖传统的合成的化学杀昆虫剂的使用。实施方式涉及发现天然存在的、可生物降解的杀虫剂以及编码它们的基因。

实施方式还提供同样编码生物学活性(例如，杀虫)多肽的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核酸包括经优化用于特定生物体的细胞表达的核酸或核苷酸序列，例如使用植物偏好密码子，以具有增强杀虫活性的多肽氨基酸序列为基础而回译(即反向翻译)的核酸序列。实施方式还提供突变，所述突变赋予实施方式的多肽改良的或改变的性质。参见，例如，共同未决的2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号和2003年12月24日提交的第10/746,914号。

在随后的描述中，广泛使用了大量术语。为促进对实施方式的理解，提供以下定义。

可以用SI可接受的形式表示单位、前缀和符号。除非另有所指，分别地，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。数字范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。参考说明书整体更为充分地定义以上定义的术语。

如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。

如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。编码蛋白的核酸可以包含位于该核酸翻译区内的非翻译序列(例如，内含子)或者可以缺少这样的居间非翻译序列(例如，如同在cDNA中)。

如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。

如本文所用，用于核苷酸序列方向上下文的术语“反义”涉及二倍多核苷酸序列，所述多核苷酸序列以转录该反义链的方向与启动子可操作地连接。该反义链与内源转录产物充分互补，以致该内源转录产物的翻译通常受抑制。因而，将术语“反义”用于特定核苷酸序列的上下文时，该术语涉及该参考转录产物的互补链。

本文可互换地使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。

本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

可以从本文公开的核酸或者使用标准分子生物学技术制备实施方式的多肽。例如，可以通过在适当宿主细胞中表达实施方式的重组核酸，或可选择地通过间接体内(ex vivo)方法的组合，来制备实施方式的蛋白。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。

“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，例如编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方式中，所分离的核酸可以包含少于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸。

如本文所用，将术语“分离的”或“纯化的”用于涉及实施方式的多肽时，指分离的蛋白基本上不含细胞物质并且包含具有少于约30％，20％，10％或5％(干重计)的污染蛋白的蛋白制备物。当重组地产生实施方式的蛋白或其生物学活性部分时，培养基代表少于约30％，20％，10％或5％(干重计)的化学前体或非目的蛋白化学品。

贯穿申请文件，将词语“包括(comprising)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体理解成提示包含所称元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，而非排除任何其它元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。

如本文所用，术语“影响虫害”指对任何发育阶段的昆虫进食、生长和/或行为的有影响的改变，包括但不限于杀灭昆虫、延迟生长、阻碍生殖能力、拒食素活性等等。

如本文所用，将术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地使用以指生物体或物质(诸如，例如蛋白)的活性，其测量可以通过但不限于害虫死亡率、害虫体重减少、害虫驱避性(repellency)以及进食和暴露适当长时间后害虫的其它行为和物理变化。因而，具有杀虫活性的生物体或物质不利地影响至少一种可测量的害虫健康参数。例如，“杀虫蛋白”是自身显示或与其它蛋白组合显示杀虫活性的蛋白。

如本文所用，术语“杀虫有效量”指存在于害虫环境的具有杀虫活性的物质或生物体的量。对每一物质或生物体而言，通过经验来确定在特定环境中受影响的每一害虫的杀虫有效量。类似地，当害虫是昆虫时，“杀昆虫有效量”可以用于指“杀虫有效量”。

如本文所用，术语“重组工程化的”或“工程化的”指利用重组DNA技术引入(例如工程化)蛋白结构的改变，这基于对蛋白作用机制的理解以及对被引入、被缺失或被取代的氨基酸的考虑。

如本文所用，术语“突变核苷酸序列”或“突变”或“诱变的核苷酸序列”指经诱变或改变而包含一个或多个核苷酸残基(例如碱基对)的核苷酸序列，所述核苷酸残基不存在于相应的野生型序列中。这样的诱变或改变由核酸残基的一个或多个添加、缺失或取代或替换所组成。当通过添加、移除或替换蛋白水解位点的氨基酸来制备突变时，这样的添加、移除或替换可以在该蛋白水解位点基序内或邻近该基序，只要完成了突变的目的(即只要改变了该位点的蛋白水解)。

突变体核苷酸序列可以编码突变体杀昆虫毒素，所述毒素显示改良的或降低的杀昆虫活性，或者可以编码氨基酸序列，所述氨基酸序列赋予包含它的多肽改良的或降低的杀昆虫活性。如本文所用的，蛋白、多肽或氨基酸序列上下文的术语“突变体”或“突变”指经突变或经改造而包含一个或多个氨基酸残基的序列，所述氨基酸残基不存在于相应的野生型序列中。这样的突变或改变由氨基酸残基的一个或多个添加、缺失或取代或替换所组成。突变体多肽显示改良的或降低的杀昆虫活性，或者代表氨基酸序列，所述氨基酸序列赋予包含它的多肽改良的杀昆虫活性。因而，术语“突变体”或“突变”指突变体核苷酸序列和所编码的氨基酸之一或两者。突变体可以单独使用或者与其它突变体或与实施方式的其它突变体相容地任意组合使用。“突变体多肽”可以相反地显示杀昆虫活性的降低。将超过一个突变添加至特定核酸或蛋白时，所述突变可以同时或顺序添加；如果顺序添加，突变可以以任何合适的次序添加。

如本文所用，术语“改良的杀昆虫活性”或“改良的杀虫活性”涉及实施方式的杀昆虫多肽，所述多肽相对于其相应的野生型蛋白具有增强的杀昆虫活性，和/或涉及对更广谱的昆虫有效的杀昆虫多肽，和/或涉及对不易受野生型蛋白毒性影响的昆虫具有特异性的杀昆虫多肽。改良的或增强的杀虫活性的发现需要证明相对于野生型杀昆虫多肽的杀虫活性，对昆虫靶标的杀虫活性提高至少10％，或者杀虫活性提高至少20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，60％，70％，100％，150％，200％或300％或更多，所述活性的确定是针对同样的昆虫。

例如，提供改良的杀虫或杀昆虫活性，其中相对于受野生型Bt毒蛋白影响的昆虫的范围，受该多肽影响的昆虫的范围更宽或者更窄。当需要多功能性时，可能需要较宽的影响范围，而当例如有益的昆虫另外有可能受该毒素的使用或存在所影响时，可能需要较窄的影响范围。虽然实施方式不受任何特别的作用机制的限制，但是也可以通过改变多肽的一个或多个特性来提供改良的杀虫活性；例如，可以增加多肽在昆虫肠内的稳定性或寿命，所述增加相对于相应野生型蛋白的稳定性或寿命。

本文所用术语“毒素”指表现杀虫活性或杀昆虫活性或改良的杀虫活性或改良的杀昆虫活性的多肽。“Bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素意在包括在Bt的各种菌株中发现的较宽种类的Cry毒素，其包括诸如例如Cry1s，Cry2s或Cry3s的毒蛋白。

术语“蛋白水解位点”或“切割位点”指氨基酸序列，其将敏感性赋予一类蛋白酶或特别的蛋白酶，以致包含所述氨基酸序列的多肽被该类蛋白酶或特别的蛋白酶所消化。据称，蛋白水解位点对识别该位点的一种或多种蛋白酶“敏感”。本领域理解，消化效率各不相同，并且消化效率的降低可以导致该多肽在昆虫肠内稳定性或寿命的增加。因而，蛋白水解位点可以将敏感性赋予不止一种蛋白酶或者不止一类蛋白酶，但是各种蛋白酶对该位点的消化效率可以各不相同。蛋白水解位点包括，例如，胰蛋白酶位点、糜蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。

例如，研究已表明鳞翅目的昆虫肠蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶。参见，例如，Lenz et al.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212；和Hedegus et al.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47。例如，已在Helicoverpa armigera幼虫的中肠内发现约18种不同的胰蛋白酶(参见Gatehouse et al.(1997)Insect Biochem.Mol.Biol.27：929-944)。已研究了这些蛋白酶所偏好的蛋白水解底物位点。参见，例如Peterson et al.(1995)Insect Biochem.Mol.Biol.25：765-774。

已努力理解Bt毒蛋白的作用机制并利用改良的性质工程化毒素。已表明昆虫肠蛋白酶可以影响Bt Cry蛋白对该昆虫的影响。一些蛋白酶通过将Cry蛋白从“毒素原(protoxin)”形式加工至毒性形式或“毒素”，来活化Cry蛋白。参见Oppert(1999)Arch.Insect Biochem.Phys.42：1-12；和Carroll et al.(1997)J.Invertebrate Pathology 70：41-49。该毒蛋白的活化可以包括从所述蛋白移除N末端和C末端肽，并且还可以包括从内部切割该蛋白。其它蛋白酶可以降解所述Cry蛋白。参见Oppert，如前。

不同特异性的Cry毒素的氨基酸序列的比较揭示了5个高度保守的序列单元(block)。所述毒素在结构上包含3个不同的结构域，从N末端到C末端为：涉及孔形成的7个α螺旋的簇(称作“结构域1”)、涉及细胞结合的3个反平行β片层(称作“结构域2”)以及β三明治(称作“结构域3”)。本领域技术人员已知这些结构域的位置和性质。参见，例如，Li et al.(1991)Nature，305：815-821和Morse et al.(2001)Structure，9：409-417。涉及特定结构域，例如涉及结构域1时，应理解关于特定序列的结构域的确切终点并不是关键的，只要该序列或其部分包含提供归因于该特定结构域的至少一些功能的序列。因而，例如，当提及“结构域1”时，意在指特定序列包括7个α螺旋的簇，但所用序列或关于该簇的序列的确切终点并不关键。本领域技术人员熟悉这类终点的确定以及对这类功能的评价。

为了尝试更好地表征和改良Bt毒蛋白，研究了Bt细菌菌株。发现从Bt菌株培养物制备的晶体制备物具有抗西方玉米根虫的杀虫活性(见实施例1)。尝试鉴定来自所选菌株的编码晶体蛋白的核苷酸序列，从这些细菌菌株分离实施方式的野生型(即天然存在的)核酸，将其克隆至表达载体并转化进大肠杆菌。依赖给定制备物的特性，认识到杀虫活性的证明有时需要胰蛋白酶预处理以活化该杀虫蛋白。因而，应理解一些杀虫蛋白的活化需要蛋白酶消化(例如，通过胰蛋白酶、糜蛋白酶等等)，而其它蛋白在无活化作用下便是生物活性的(例如，杀虫性)。

可以通过2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号和2003年12月24日提交的第10/746,914号所述的方法改造所述分子。此外，可以将核酸序列工程化，以编码包含另外的突变的多肽，所述突变赋予相对于天然存在的多肽的杀虫活性的改良的或改变的杀虫活性。该工程化的核酸的核苷酸序列包含未在野生型序列中发现的突变。

通常通过包括以下步骤的方法制备实施方式的突变体多肽：获得编码Cry家族多肽的核酸序列；分析所述多肽的结构，以鉴定特定“靶”位点的潜在基因序列的诱变，这基于对所述靶结构域在毒素作用模式中的所提议功能的考虑；将一个或多个突变引入核酸序列以产生对所编码多肽序列的一个或多个氨基酸残基的所需改变；以及分析所产生多肽的杀虫活性。

Bt杀昆虫毒素中的许多都是相关的，其氨基酸序列和三级结构的相似程度各不相同，并且公知获得Bt毒蛋白晶体结构的方法。从文献可获得示例性的Cry3A和Cry3B多肽两者的高分辨率晶体结构解析。解析到的Cry3A基因结构(Li et al.(1991)Nature 353：815-821)提供了对该毒素结构与功能间关系的深刻理解。组合考虑Bt毒素的已公开的结构分析和所报道的与特定结构、基序等等相关的功能，说明该毒素的特定区域与该蛋白的特定功能和特定作用模式的不连续步骤相关。例如，通常将分离自Bt的许多毒素描述为包含三个结构域：涉及孔形成的7螺旋束、涉及受体结合的3片层结构域和β三明治基序(Li et al.(1991)Nature 353：815-821)。

如美国专利第7,105,332号和2003年12月24日提交的未决美国申请第10/746,914号所报道，可以通过将位于该毒素结构域1的α螺旋3和4之间的区域作为靶标，来改良Cry蛋白的毒性。这一理论建立于关于杀昆虫毒素的知识体系，包括：1)据报道Cry3A毒素结构域1的α螺旋4和5插入内衬易感昆虫中肠的细胞的脂双分子层Gazit etal.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：12289-12294)；2)发明人了解野生型蛋白氨基酸序列内胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的位置；3)观察到在借助胰蛋白酶或糜蛋白酶处理的体外活化之后，野生型蛋白对某些昆虫更具活性；以及4)报道从3’端消化毒素导致了对昆虫毒性的降低。

可以制备一系列突变，并将其置于各种背景序列中，从而制备具有增强的或者改变的杀虫活性的新的多肽。参见，例如，如今已放弃的、2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号以及2003年12月24日提交的第10/746,914号。这些突变体包括但不限于：在位于结构域1的螺旋3和4之间的区域另外添加至少一个蛋白酶敏感的位点(例如胰蛋白酶切割位点)；用不同蛋白酶敏感的位点替换野生型序列的原始蛋白酶敏感的位点；在特定位置添加多蛋白酶敏感位点；在一个或多个蛋白酶敏感的位点附近添加氨基酸残基，从而改变所述多肽的折叠并因而增强在该一个或多个蛋白酶敏感的位点处的多肽消化；和添加突变以保护该多肽免受使毒性降低的降解性消化(例如，制备一系列突变，其中用缬氨酸替换野生型氨基酸以保护所述多肽免于消化)。可以单独或以任意组合使用突变，从而提供实施方式的多肽。

实施方式以这种方式提供包含各种突变的序列，所述突变诸如，例如包含位于所编码多肽结构域1的α螺旋3和4之间的另外的或可选择的蛋白酶敏感位点的突变。另外的或可选择的蛋白酶敏感位点的突变可以对诸如丝氨酸蛋白酶的数种蛋白酶或者诸如弹性蛋白酶的酶敏感，所述丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和糜蛋白酶。因而，另外的或者可选择的蛋白酶敏感位点的突变可以经设计以致该位点被蛋白酶类容易地识别和/或切割，所述蛋白酶诸如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶。还可以将蛋白酶敏感的位点设计为被已知产生于生物体的特定种类的酶或特定酶切割，所述酶诸如，例如棉铃虫Heliothis zea产生的糜蛋白酶(Lenz et al.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212)。突变还可以赋予对蛋白水解消化的抗性，例如对糜蛋白酶在所述肽的C末端的消化的抗性。

所编码多肽的氨基酸序列存在另外的和/或可选择的蛋白酶敏感位点，这可以提高实施方式的核酸编码的多肽的杀虫活性和/或杀虫特异性。因此，实施方式的核苷酸序列可以被重组工程化或者被操作以产生具有改良的或改变的杀虫活性和/或特异性的多肽，所述改良或改变相对于未经修饰的野生型毒蛋白。另外，本文公开的突变可以被置于其它核苷酸序列或与其它核苷酸序列联用，从而提供改良的性质。例如，昆虫糜蛋白酶容易切割的蛋白酶敏感位点可以被置于Cry背景序列，以提供针对该序列的改良的毒性，所述昆虫糜蛋白酶例如在花边粘虫(bertha armyworm)或棉铃虫中发现的糜蛋白酶(Hegedus et al.(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47；和Lenz et al.(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212)。实施方式以这种方式提供具有改良性质的毒性多肽。

例如，突变的Cry核苷酸序列可以包含另外的突变体，所述突变体包含将第二胰蛋白酶敏感的氨基酸序列(除开天然存在的胰蛋白酶位点)引入所编码多肽的另外的密码子。实施方式的可选择的添加突变体包含另外的密码子，所述密码子经设计以将至少一个另外的不同的蛋白酶敏感的位点引入该多肽，例如，紧靠天然存在的胰蛋白酶位点5’或3’的糜蛋白酶敏感的位点。可选择地，可以制备取代突变体，其中破坏编码天然存在的蛋白酶敏感位点的核酸的至少一个密码子，并且将可选择的密码子引入核酸序列，从而提供不同的(例如取代的)蛋白酶敏感的位点。还可以将替换突变体添加至Cry序列，其中破坏所编码多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位点，并且将糜蛋白酶或弹性蛋白酶切割位点引入它的位置。

认识到可以使用编码蛋白水解位点或推定的蛋白水解位点(例如诸如NGSR、RR或LKM的序列)氨基酸序列的任何核苷酸序列，并且用于将这些切割位点中的任何位点引入变体多肽的密码子的确切身份可以根据用途而不同，所述用途即在特定植物物种中的表达。还认识到所公开突变中的任何突变可以被引入实施方式的任一多核苷酸序列，所述序列包含提供天然胰蛋白酶切割位点的氨基酸残基的密码子，所述切割位点是修饰的靶标。因此，可以修饰全长毒素或其片段的变体，以包含另外的或可选择的切割位点，并且这些实施方式意在为本文公开的实施方式的范围所包括。

本领域技术人员会理解，只要所编码多肽保留杀虫活性，任何有用的突变可以被添加至实施方式的序列。因而，也可以突变序列，以致所编码多肽对糜蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。可以以任何组合在特定位置添加超过一个的识别位点，并且可以向所述毒素添加或从所述毒素移除多识别位点。因而，另外的突变可以包括3个、4个或更多个识别位点。将认识到可以在任一合适的多核苷酸序列中工程化多突变；因此，可以修饰全长序列或其片段，以包含另外的或可选择的切割位点以及对蛋白水解消化具有抗性。如此，实施方式提供包含突变的Cry毒素，所述突变改善杀虫活性，实施方式还提供改良的组合物以及使用其它Bt毒素影响害虫的方法。

突变可以保护该多肽免于蛋白酶降解，所述保护例如是通过从不同区域移除诸如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点的推定的蛋白水解位点。可以移除或改造这些推定位点的一些或全部，以致原始位点位置的蛋白水解被降低。可以通过比较突变体多肽和野生型毒素或者通过比较氨基酸序列各不相同的突变体毒素，来评价蛋白水解的变化。蛋白水解位点和推定的蛋白水解位点包括但不限于以下序列：RR，胰蛋白酶切割位点；LKM，糜蛋白酶位点；和NGSR，胰蛋白酶位点。只要所述多肽的杀虫活性被提高，可以通过添加或缺失任意数目和种类的氨基酸残基来改造这些位点。因而，相对于天然序列或背景序列，由包含突变的核苷酸序列编码的多肽将包含至少一个氨基酸改变或添加，或者2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，32，35，38，40，45，47，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270或280或更多个氨基酸改变或添加。如本领域所知，还可以通过截短天然或全长序列来提高多肽的杀虫活性。

实施方式的组合物包括核酸及其片段和其变体，其编码杀虫多肽。特别地，实施方式提供分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者包含编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，及其片段和其变体。

另外受到关注的是编码实施方式的杀虫蛋白的优化核苷酸序列。如本文所用，短语“优化核苷酸序列”指为在特定生物体表达而优化的核酸，所述特定生物体例如是植物。可以使用本领域已知方法制备用于任何目的生物体的优化核苷酸序列。参见，例如，如今已放弃的、2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号以及2003年12月24日提交的第10/746,914号，它们描述了编码所公开杀虫蛋白的优化核苷酸序列。在本实施例中，所述核苷酸序列的制备是通过反向翻译蛋白的氨基酸序列，并改变核苷酸序列以致包含玉米偏好密码子但仍编码相同的氨基酸序列。该方法的更多细节描述于Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498。优化核苷酸序列可用于提高杀虫蛋白在植物中的表达，所述植物例如禾本科(Gramineae)(Poaceae)单子叶植物，例如玉米(maize或corn)植物。

实施方式还提供分离的杀虫(例如杀昆虫)多肽，其由实施方式的天然存在的或修饰的核酸所编码。更为具体地，实施方式提供包括SEQID NO：2所示氨基酸序列的多肽，以及本文所述核酸编码的多肽，本文所述核酸例如SEQ ID NO：1所示的核酸，及其片段和其变体。

在特定实施方式中，实施方式的杀虫蛋白提供全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段以及由突变核酸产生的变体多肽，所述突变核酸经设计将特定氨基酸序列引入实施方式的多肽。在特定实施方式中，被引入所述多肽的氨基酸序列包括提供诸如蛋白酶的酶的切割位点的序列。

本领域已知Bt毒素的杀虫活性通常通过各种蛋白酶在昆虫肠内对所述肽的切割被活化。因为肽在昆虫肠内不总是以全效切割，所以全长毒素的片段相对于全长毒素自身可以具有增强的杀虫活性。因而，实施方式的多肽中的一些包括全长杀昆虫多肽的片段，并且多肽片段、变异体和突变中的一些将相对于其衍生自的天然存在的杀昆虫多肽的活性，具有增强的杀虫活性，特别是如果天然存在的杀昆虫多肽在筛选活性前未用蛋白酶进行体外活化。因而，本申请包括所述序列的截短形式或片段。

可以将突变置入包括所述被截短多肽的任一背景序列，只要所述多肽保留杀虫活性。使用本领域已知的分析或本文他处描述的分析，本领域技术人员可以容易地比较两种或更多种蛋白的杀虫活性。将理解实施方式的多肽可以通过表达本文所公开的核酸或通过使用标准分子生物学技术而产生。

认识到所述杀虫蛋白可以是寡聚的并且会在分子量、残基数目、组分多肽、抗特定害虫活性以及其它特性上各不相同。然而，通过本文所述方法，可以分离并表征对各种害虫有活性的蛋白。实施方式的杀虫蛋白可以与其它Bt毒素或其它杀昆虫蛋白组合使用，从而提高靶昆虫范围。此外，实施方式的杀虫蛋白与其它Bt毒素或不同性质的其它杀昆虫原则的组合使用具有预防和/或处理昆虫抗性的特定功效。其它杀昆虫剂包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸类型)、α淀粉酶以及过氧化物酶。

实施方式还包括核苷酸及其编码的氨基酸序列和多肽的片段和变体。如本文所用，术语“片段”指实施方式的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有杀虫活性。因而，已知实施方式的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可以正确地称为片段和突变体。

应理解如术语“片段”用于提及实施方式的核酸序列时，该术语还包括可用作杂交探针的序列。这类核苷酸序列通常不编码保留生物学活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列的片段的范围可以从至少约20个核苷酸，约50个核苷酸，约100个核苷酸到编码实施方式的蛋白的全长核苷酸序列。

编码实施方式的杀虫蛋白生物学活性部分的实施方式的核苷酸序列片段将编码至少15，25，30，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100或1200个连续的氨基酸，或者编码多达实施方式的杀虫多肽中存在的全部数量的氨基酸(例如SEQ ID NO：2的1163个氨基酸)。因而，应理解实施方式还包括多肽，所述多肽是实施方式的示例性杀虫蛋白的片段并且具有至少长15，25，30，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100或1200个连续氨基酸或者多达实施方式的杀虫多肽中存在的全部数量的氨基酸(例如SEQ ID NO：2的1163个氨基酸)。可以用作杂交探针或PCR引物的实施方式的核苷酸序列片段通常不需要编码杀虫蛋白的生物学活性部分。因而，实施方式的核酸片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或者它可以是能够用作使用本文所公开方法的杂交探针或PCR引物的片段。杀虫蛋白的生物学活性部分的制备可以通过分离实施方式的核苷酸序列中的一种的一部分，表达杀虫蛋白的所编码部分(例如通过体外重组表达)，和分析所述杀虫蛋白所编码部分的活性。

作为实施方式核苷酸序列片段的核酸包括至少16，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，1000，1200，1400，1600，1800或2000个核苷酸，或者多达本文公开的核苷酸序列中所存在数量的核苷酸(例如SEQ ID NO：1的3491个核苷酸)。特定实施方式涉及衍生自(例如产生自)实施方式的第一核酸的片段，其中所述片段编码以杀虫活性为特征的截短的毒素。实施方式的多核苷酸片段所编码的截短的多肽的特征在于等价或改良的杀虫活性，所述等价或改良是相对于该片段衍生自的第一核酸所编码的相应全长多肽的活性。所涉及的是实施方式的该核酸片段可以在天然或相应全长编码序列的3’端被截短。核酸片段还可以在天然或相应全长编码序列的5’和3’端均被截短。

本文所用术语“变体”指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方式的杀虫多肽中的一种的氨基酸序列的那些序列。诸如这些的天然存在的等位基因变体可以使用公知的分子生物学技术鉴定，所述技术诸如，例如本文所列的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。

变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，诸如使用例如位点定向诱变而产生的仍编码实施方式的杀虫蛋白的那些，诸如突变体毒素。一般来讲，实施方式的特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列一致性，一致性的确定是通过本文他处所述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。实施方式的核苷酸序列变体与该序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4，3，2或甚至1个核苷酸。

评价实施方式的特定核苷酸序列(即示例性核苷酸序列)的变体还可以通过比较变体核苷酸序列所编码多肽和该参考核苷酸序列所编码多肽的序列一致性百分比。因而，例如，公开了编码与SEQ ID NO：2的多肽具有给定序列一致性百分比的多肽的分离的核酸。可以使用本文他处所述序列比对程序计算任两个多肽之间的序列一致性百分比，所述程序使用默认参数。如果通过比较实施方式的任意给定对多核苷酸所编码的两个多肽所享有的序列一致性百分比，来评价所述任意给定对，那么该两个所编码多肽之间的序列一致性百分比为至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，一般至少约75％，80％，85％，至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，或者至少约98％，99％或更高的序列一致性。

如本文所用，术语“变体蛋白”包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通过缺失(所谓的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸或将一个或多个氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸。因而，术语“变体蛋白”包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天热蛋白生物学活性，即具有杀虫活性的足够数目的连续氨基酸残基。这样的杀虫活性相对天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者它可以是不变的，只要保留了杀虫活性。

实施方式包括的变体蛋白具有生物学活性，即它们继续具有天然蛋白的所需的生物学活性，所述活性即本文所述的杀虫活性。所述变体可以得自例如基因多态性或人类的操作。实施方式的天然杀虫蛋白的生物学活性变体将与天然蛋白氨基酸序列具有至少约60％，65％，70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列一致性，一致性的确定是通过本文他处描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。实施方式的蛋白的生物学活性变体与该蛋白的差异可以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4，3，2或甚至1个氨基酸残基。

实施方式还包括转化的微生物，所述转化使用至少一种实施方式的核酸、包含所述核酸的表达盒或者包含所述表达盒的载体。在一些实施方式中，所述微生物是依靠植物增殖的微生物。本发明的实施方式涉及封装的杀虫蛋白，所述蛋白包括能够表达至少一种实施方式的杀虫蛋白的转化的微生物。

实施方式提供杀虫组合物，包括实施方式的转化的微生物。在该实施方式中，所述转化的微生物通常以杀虫有效量与适当的载体共同存在于所述杀虫组合物中。实施方式还包括杀虫组合物，所述组合物包括杀昆虫有效量的实施方式的分离的蛋白，以及适当的载体，所述分离的蛋白单独存在或者与实施方式的转化的生物体和/或实施方式的封装的杀虫蛋白组合。

实施方式还提供使用实施方式的杀虫蛋白与至少一种其它的或“第二”杀虫蛋白的组合，来增加昆虫靶范围的方法。可以将本领域已知的任意杀虫蛋白用于实施方式的方法。所述杀虫蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制剂、α淀粉酶以及过氧化物酶。

实施方式还包括转化的植物或转基因植物，其包含至少一种实施方式的核苷酸序列。在一些实施方式中，使用核苷酸构建体稳定地构建植物，所述构建体包含与在植物细胞中驱动表达的启动子可操作地连接的至少一种实施方式的核苷酸序列。如本文所用，术语“转化的植物”和“转基因植物”表示基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转基因或转化的植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为重组表达盒的一部分整合进基因组。

应理解如本文所用，术语“转基因的”包括基因型已通过异源核酸的存在而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或者植物，包括最初如此改变的那些转基因，以及通过有性杂交或无性繁殖从所述最初的转基因产生的那些。如本文所用，术语“转基因的”不包括借助常规植物育种方法或者借助天然发生的事件对基因组(染色体或染色体外)的改变，所述天然发生的事件诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或者自发突变。

如本文所用，术语“植物”包括整体植物、植物器官(例如叶、茎、根等等)、种子、植物细胞及其子代。转基因植物的部分属于实施方式的范围，包括，例如，源于转基因植物或其子代并因而至少部分由转基因细胞组成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根，所述转基因植物先用实施方式的DNA分子转化。

如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。可以用于实施方式的方法的植物种类通常与适于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物两者。所述植物包括例如马铃薯(Solanum tuberosum)和玉米(Zea mays)。

虽然实施方式不依赖特定生物学机制来增加植物对植物害虫的抗性，但是实施方式的核苷酸序列在植物中的表达可以导致产生实施方式的杀虫蛋白以及提高所述植物对植物害虫的抗性。实施方式的植物可以用于农业上影响虫害的方法。某些实施方式提供转化的农作物植物，诸如例如玉米植物，其可以用于影响该植物的虫害的方法，所述虫害诸如例如西方玉米根虫。

“受试植物或植物细胞”是对目的基因的诸如转化的遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者是传自如此改造的植物或细胞并且包含所述改造的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标志物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

因而，实施方式的蛋白可以以各种方式被改造，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于所述操作的方法为本领域所公知。例如，可以通过将突变引入合成核酸(例如DNA分子)制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和核酸改变的方法为本领域所公知。例如，可以使用寡核苷酸介导的位点定向诱变技术，引入经设计的改变。参见，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利第4,873,192号；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(分子生物学技术)(MacMillan Publishing Company，New York)，以及本文所引用的文献。

可以修饰实施方式的突变的核苷酸序列，从而改变约1，2，3，4，5，6，8，10，12或更多个存在于所编码多肽一级序列的氨基酸。可选择地，可以引入更多的对天然序列的改变，以致所编码蛋白可以具有至少约1％或2％，或者约3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，或者约13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，或20％，21％，22％，23％，24％，或25％，30％，35％，或40％或更多的相对于对应的野生型蛋白而改变或者另外修饰的密码子。以同样的方式，所编码蛋白可以具有至少约1％或2％，或者约3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，或者约13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，或20％，21％，22％，23％，24％，或25％，30％，35％，或40％或更多的相对于对应的野生型蛋白而添加的密码子。应理解，实施方式的突变的核苷酸序列意在包括具有杀虫活性的生物学功能的、等同的肽，所述杀虫活性诸如改良的杀虫活性，其通过抗西方玉米根虫幼虫的拒食素性质来确定。所述序列的出现可以是因为密码子冗余性和功能性等同，已知其天然地存在在核酸序列和如此编码的蛋白内。

本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。

实施方式的基因和核苷酸序列因而包括天然存在的序列和突变体形式两者。同样地，实施方式的蛋白包括天然存在的蛋白及其变体(例如截短的多肽)和其经修饰的(例如突变体)形式。所述变体将继续具有所需杀虫活性。显然，将在编码所述变体的核苷酸序列中产生的突变绝不能使所述序列不符合读框，并且所述突变通常不会产生能够产生mRNA二级结构的互补区。参见，欧洲专利申请公开文本第75,444号。

本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不应对所述蛋白的性质产生剧烈改变。然而，当在进行取代、缺失或插入前，难以预测其确切效果时，本领域技术人员将理解所述效果将通过诸如昆虫进食分析的常规筛选分析来评价。参见，例如，通过引用并入本文的Marroneet al.(1985)J.Econ.Entomol.78：290-293和Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485。

变体核苷酸序列和蛋白还包括衍生自诸如DNA重排的诱变和重组方法的序列和蛋白。利用该方法，可以操作一个或多个不同的编码序列，从而产生具有所需性质的新的杀虫蛋白。如此，可以从相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸包含具有基本的序列一致性的序列区域，并且可以在体内或体外被同源重组。例如，使用该方法，可以在实施方式的核苷酸序列和其它已知的Cry核苷酸序列的对应部分之间重组全长编码序列、编码目的结构域的序列基序或者实施方式的核苷酸序列的任意片段，从而获得新基因，所述新基因编码具有改良的目的性质的蛋白。

受到关注的性质包括但不限于每单位杀虫蛋白的杀虫活性、蛋白稳定性、对非靶物种、特别是对人类、家畜以及表达实施方式的杀虫多肽的植物和微生物的毒性。实施方式不受特定重排策略的限制，除开所述重排策略涉及至少一种实施方式的核苷酸序列或其部分。重排可以仅涉及本文所公开的核苷酸序列，或者可以另外涉及重排本领域已知的其它核苷酸序列。DNA重排策略为本领域所已知。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。

还可以将实施方式的核苷酸序列用于从其它生物体分离相应的序列，所述其它生物体特别是其它细菌，更为特别地是其它芽孢杆菌菌株。如此，可以使用诸如PCR、杂交等等的方法来鉴定这些序列，所述鉴定基于其与本文所述序列的序列同源性。基于其与本文所述完整序列或其片段的序列一致性而选择的序列也为实施方式所包括。这些序列包括作为所公开序列同源物的序列。术语“同源物”指衍生自共同祖先基因并且因物种形成而在不同物种中所发现的基因。对于在不同物种中发现的基因，如果其核苷酸序列和/或其所编码的蛋白序列如本文他处所定义而享有基本的序列一致性，则被认为是同源物。同源物的功能在物种间常常高度保守。

在PCR方法中，可以设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，以从提取自任何目的生物体的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法通常为本领域已知，并且公开于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)，下文称″Sambrook″。另参见Innis et al.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR操作步骤：方法及应用指南)(Academic Press，New York)；lnnis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(PCR策略)(Academic Press，New York)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(PCR方法手册)(Academic Press，New York)。PCR的已知方法包括但不限于如下方法，所述方法使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等等。

在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如³²P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方式序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知，并且公开于Sambrook。

例如，可以将本文公开的完整序列或者其一个或多个部分用作能够与对应序列和信使RNA特异性杂交的探针。为在各种条件下完成特异性杂交，所述探针包含独特于实施方式序列并且通常长至少约10或20个核苷酸的序列。可以使用所述探针，以通过PCR从所选生物体扩增相应的Cry序列。可以使用该技术，以从所需生物体分离其它编码序列，或将该技术用作诊断分析，以确定生物体是否存在编码序列。杂交技术包括杂交筛选所接种的DNA文库(噬菌斑或菌落；参见，例如，Sambrook)。

可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。

通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度为用于短探针(例如10到50个核苷酸)的至少约30℃，和用于长探针(例如大于50个核苷酸)的至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。

特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的T_m(热力学熔点)可以近似自Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的公式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“％甲酰胺”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。T_m是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。

每1％的错配对应使T_m降低约1℃；因而，可以调节T_m、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将T_m降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的T_m低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述T_m低1℃、2℃、3℃或4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下进行杂交和/或清洗。

使用所述公式、杂交和清洗组合物，以及所需T_m，本领域技术人员会理解，实质上描述了杂交和/或清洗溶液严紧性的变化。如果所需程度的错配导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，那么可以提高SSC浓度以致能够使用更高的温度。对核酸杂交的一般性指南参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生化及分子生物学实验技术-核酸探针的杂交)，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；以及Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验指南)，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-lnterscience，New York)。另见Sambrook。因而，实施方式包括分离的序列，所述分离的序列编码实施方式的Cry蛋白并且在严紧条件下与本文公开的Cry序列或与其片段杂交。

用以下术语描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口(comparison window)”，(c)“序列一致性”，(d)“序列一致性百分比”和(e)“基本一致性”。

(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。

(b)如本文所用，“比较窗口”涉及多核苷酸序列的连续且指定的片段，其中比较窗口的多核苷酸序列可以包括相比于参考序列(其不包含添加或缺失)的添加或缺失(即间隔)，以对两个序列进行最适比对。通常，比较窗口长至少20个连续核苷酸，并且任选地可以长30，40，50，100或更长。本领域技术人员理解，为避免由多核苷酸序列包含间隔而造成的与参考序列的高相似性，通常引入间隔罚分，并将其从匹配数中减去。

用于比较序列的比对方法为本领域已知。因而，可以使用数学算法完成对任意两序列之间序列一致性百分比的确定。所述数学算法的非限制性实例为Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smithet al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜索比对方法；如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877所改进的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法。

可以利用这些数学算法的计算机工具，以比较序列，从而确定序列一致性。所述工具包括但不限于，PC/基因程序的CLUSTAL(可获得自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(2.0版)以及GCG Wisconsin遗传学软件包(第10版)的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA(可获得自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA)。可以使用默认参数利用这些程序进行比对。CLUSTAL程序详述于Higgins et al.(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins et al.(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet et al.(1988)NucleicAcids Res.16：10881-90；Huang et al.(1992)CABIOS 8：155-65；以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller(1988)的算法。使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以采用PAM120权重残基表、12的间隔长度罚分以及4的间隔罚分。Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul(1990)的算法。可以使用BLASTN程序、分值＝100、字长＝12来进行BLAST核苷酸搜索，从而获得与编码实施方式的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以使用BLASTX程序、分值＝50、字长＝3来进行BLAST蛋白搜索，从而获得与实施方式的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。可以如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389所述，使用(BLAST 2.0的)间隔BLAST来获得以比较为目的的间隔比对。可选择地，可以使用(BLAST 2.0的)PSI-BLAST来进行检测分子间远源关系的迭代搜索。参见上述Altschul et al.。使用BLAST、间隔BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序(例如，用于核苷酸序列的BLASTN、用于蛋白的BLASTX)的默认参数。参见万维网ncbi.hlm.nih.gov下的国立生物技术信息中心网站。还可以通过检查进行手工比对。

除非另有说明，本文提供的序列一致性/相似性值表示使用GAP第10版所获得的值，其使用下列参数：用于核苷酸序列的％一致性和％相似性，其使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；用于氨基酸序列的％一致性和％相似性，其使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62评分矩阵；或者其任意等价程序。如本文所用，术语”等价程序”指任意序列比较程序，其为所讨论的任意两个序列而生成比对，所述比对具有与GAP第10版所生成的相应比对相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列一致性百分比。

GAP使用上述Needleman和Wunsch(1970)的算法，以寻找最大化匹配数且最小化间隔数的对两条完整序列的比对。GAP考虑了所有可能的比对和间隔位置，并生成具有最大匹配碱基数和最少间隔的比对。它允许提供匹配碱基单元的间隔生成罚分和间隔延伸罚分。对于其插入的每一间隔，GAP必须利用匹配的间隔生成罚分数。如果选择大于0的间隔延伸罚分，则对于每一插入的间隔，GAP必须另外利用间隔长度乘间隔延伸罚分。对于蛋白序列，GCG Wisconsin遗传学软件包(第10版)的默认间隔生成罚分值和间隔延伸罚分值分别是8和2。对于核苷酸序列，该默认间隔生成罚分是50，而默认间隔延伸罚分是3。间隔生成罚分和间隔延伸罚分可以表示为选自0至200的整数。因而，例如，间隔生成罚分和间隔延伸罚分可以是0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或更大。

GAP代表最佳比对家族中的一个成员。该家族可能有许多成员，但其他成员的质量都不如GAP。GAP显示比对的4个价值数字：品质(Quality)、比率(Ratio)、一致性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的度量。比率是品质除以较短片段中碱基的数目。一致性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略跨越间隔的符号。当符号对的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性进行评分。GCG Wisconsin遗传学软件包第10版所用的得分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)如本文所用，两条核酸或多肽序列上下文中的“序列一致性”或“一致性”指当在指定的比较窗口内比对最大对应性时，两条序列中相同的残基。对于蛋白，当使用序列一致性百分比时，应认识到不一致的残基位置经常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被用于取代具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并因此不改变该分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可上调序列一致性百分比，以校正取代的保守特性。由这类保守性取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段为本领域技术人员所公知。通常，这涉及将保守性取代评分为部分而不是完全的错配，从而提高序列一致性百分比。因此，例如，如果将一致的氨基酸的得分给定为1，而将非保守性取代的得分给定为0，则将保守性取代的得分给定为0至1。如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所执行的，计算保守性取代得分。

(d)如本文所用，“序列一致性百分比”表示通过相对于比较窗口而比较两条最适比对的序列而确定的值，其中，为了最适比对两条序列，比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即间隔)。百分比通过以下计算：确定两条序列中一致的核酸碱基或氨基酸残基均存在的位置的数目，从而得出匹配位置的数目，用比较窗口中位置总数除匹配位置的数目，并且将结果乘以100，从而得出序列一致性百分比。

(e)(i)术语多核苷酸序列的“基本一致性”表示多核苷酸包含利用使用标准参数的所述比对程序之一时，与参考序列具有至少70％、80％、90％或95％或更高的序列一致性的序列。本领域技术人员会认识到可以适当地调整这些值，以确定两个核苷酸序列所编码蛋白的相应的一致性，所述确定考虑了密码子简并性、氨基酸相似性、读框定位(reading frame positioning)等等。用于这些目的的氨基酸序列基本一致性通常表示具有至少60％、70％、80％、90％或95％的序列一致性或更高的序列一致性。

如果两个分子在严紧条件下相互杂交，也说明核苷酸序列基本一致。通常，在确定的离子强度和pH下，选择严紧条件，使其比特定序列的T_m低约5℃。然而，严紧条件包括比T_m低约1℃至20℃范围的温度，这取决于如本文另外所定性的所需严紧度。如果严紧条件下不相互杂交的核酸所编码的多肽是基本一致的，所述核酸则仍是基本一致的。这可以出现在，例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性而产生的核酸拷贝时。如果第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，那么说明两个核酸序列基本一致。

(e)(ii)肽上下文的术语“基本一致性”表示在指定的比较窗口，肽包含与参考序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或更高序列一致性的序列。使用上述Needleman和Wunsch(1970)的全局比对算法，能进行用于这些目的的最适比对。一个肽与针对另一肽制备的抗体具有免疫反应性，说明两个肽序列基本一致。因而，肽与另一肽基本一致，例如，其中该两个肽仅因保守取代而不同。“基本相似的”肽共有如上所述的序列，除不一致的残基位置可以因保守氨基酸改变而不同。

术语“核苷酸构建体”在本文的使用并非意在将实施方式限于包含DNA的核苷酸构建体。本领域技术人员会认识到，核苷酸构建体、特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合所构成的多核苷酸和寡核苷酸也可以用于本文所公开的方法。实施方式的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外包括所述构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，实施方式的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列包括能用于实施方式的转化植物方法的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所构成的那些。所述脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物两者。实施方式的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还包括核苷酸构建体的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等等。

另一实施方式涉及转化的生物体，诸如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。转化的生物体包含：实施方式的DNA分子、包含所述DNA分子的表达盒或包含所述表达盒的载体，其可以稳定地整合进所转化生物体的基因组。

在DNA构建体中提供实施方式的序列，所述构建体用于在目的生物体中表达。所述构建体包括与实施方式的序列可操作连接的5’和3’调节性序列。本文所用术语“可操作连接”表示启动子和另一序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列起始并介导对应于所述另一序列的DNA序列的转录。通常，可操作连接表示被连接的核酸序列是邻接的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，是邻接且在相同读框内的。所述构建体可以另外包含至少一个被共转化进生物体的另外的基因。可选择地，可以在多DNA构建体上提供另外的一个或多个基因。

所述DNA构建体具有多个用于插入Cry毒蛋白序列的限制性位点，所述Cry毒蛋白序列将位于调节性区域的转录调节之下。所述DNA构建体可以另外包含可选择的标志物基因。

按5’到3’的转录方向，DNA构建体包含：转录和翻译起始区(即启动子)、实施方式的DNA序列以及在用作宿主的生物体内具有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。转录起始区(即启动子)相对于宿主生物体和/或实施方式的序列，可以是同源的、类似物的、外源的或异源的。另外，所述启动子可以是天然序列或者可选择地是合成序列。本文所用术语“外源的”表示在导入启动子的同源生物体内没有发现该启动子。当所述启动子相对于实施方式的序列是“外源的”或“异源的”时，意在表明该启动子不是实施方式中可操作连接的序列的同源的或天然存在的启动子。如本文所用，嵌合基因包含与转录起始区可操作连接的编码序列，所述转录起始区对于所述编码序列是异源的。当启动子是同源或天然的序列时，可操作连接的序列的表达改造自野生型表达，这导致表型的改变。

终止区可以与转录起始区是同源的，可以与可操作连接的目的DNA序列是同源的，可以与植物宿主是同源的，或者可以得自另一来源(即，相对于启动子、目的序列、植物宿主或其任一组合是外源的或异源的)。

可以从根癌农杆菌(A.tumefaciens)Ti质粒获得方便的终止区，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon etal.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

适当时可以优化核酸以提高在宿主生物体中的表达。因而，如果宿主生物体是植物，可以使用植物偏好密码子来合成合成的核酸，从而改良表达。参见，例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11，对宿主偏好密码子使用的讨论。例如，虽然在单子叶植物和双子叶植物物种中均可以表达实施方式的核酸序列，但是可以修饰序列，以解决单子叶植物或双子叶植物特异的密码子偏好和GC含量偏好，这是因为这些偏好已经表现出了差异(Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好密码子可以衍生自玉米的已知基因序列。28条玉米植物基因的玉米密码子使用列于上文Murray et al.的表4。本领域可以获得合成植物偏好基因的方法。参见，例如，美国专利第5,380,831号和第5,436,391号，和Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其通过引用并入本文。

已知另外的序列修饰来增强细胞宿主的基因表达。这些包括清除序列，所述序列编码假的多聚腺苷化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复和可能不利于基因表达的其它良好表征的序列。可以将序列的GC含量调节至给定细胞宿主的平均水平，其参考在该宿主细胞表达的已知基因而计算。本文所用术语“宿主细胞”指包含载体且支持该表达载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是诸如大肠杆菌的原核细胞，或者是诸如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或者单子叶植物或双子叶植物细胞的真核细胞。单子叶植物宿主细胞的实例是玉米宿主细胞。如果可能，则修饰序列以避免预期的发夹mRNA二级结构。

表达盒可以另外包含5’前导序列。所述前导序列能发挥增强翻译的作用。翻译前导序列为本领域已知并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Gallie et al.(1995)Gene 165(2)：233-238)，MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)，人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353：90-94)；苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in Molecular Biology of RNA(RNA的分子生物学)，ed.Cech(Liss，NewYork)，pp.237-256)；以及玉米萎黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81：382-385)。另见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段以提供合适方向的和适当时合适读框的DNA序列。为达到这一目的，可以采用接头或连接子来连接DNA片段，或者可以涉及其它操作来提供方便的限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等等。为了这一目的，可以涉及体外诱变，引物修复，限制性，退火，再取代，例如转换(transition)和颠换(transversion)。

在实践实施方式时可以使用大量启动子。可以基于所需结果选择启动子。可以使核酸与组成型、组织偏好型、诱导型或用于在宿主生物体中表达的其它启动子组合。用于植物宿主细胞的合适的组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子和WO 99/43838及美国专利第6,072,050号所公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy etal.(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)PlantMol.Biol.12：619-632 and Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等等。其它组成型启动子包括，例如，公开于美国专利第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,121号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；第5,608,142号；和第6,177,611号的那些。

从诱导型启动子表达基因可以是有益的，这取决于所需结果。对于调节实施方式的核苷酸序列在植物中的表达，伤口诱导型(wound-inducible)启动子有特别的好处。所述伤口诱导型启动子可以对昆虫取食造成的损伤产生反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利第5,428,148号；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；systemin(McGurl et al.(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok et al.(1994)PlantJ.6(2)：141-150)；等等，其通过引用并入本文。

此外，可以在实施方式的方法和核苷酸构建体中采用病原体诱导型启动子。所述病原体诱导型启动子包括来自致病相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在受病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等等。参见，例如，Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4：645-656；和VanLoon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。另见WO 99/43819，其通过引用并入本文。

在病原体感染部位或在该部位附近局部表达的启动子引人注目。参见，例如Marineau et al.(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions(植物-微生物的分子水平的相互作用)2：325-331；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；和Yan(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。另见Chen et al.(1996)Plant J.10：955-966；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner et al.(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利第5,750,386号(线虫诱导型)；并且这些参考文献为本文所引用。玉米PRms基因的诱导型启动子特别引人注目，其表达受病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见，例如，Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。

可以使用化学品调节启动子，通过应用外源化学调节物来调节基因在植物中的表达。依目的而定，启动子可以是化学品诱导型启动子，其中化学品的应用诱导基因表达，或者化学品阻遏启动子，其中化学品的应用阻遏基因表达。化学品诱导型启动子为本领域已知，并且包括，但不限于，玉米In2-2启动子，其为苯磺酰胺除草剂安全剂所激活，玉米GST启动子，其为用作萌前型除草剂的疏水亲电子化合物所激活，以及烟草PR-1a启动子，其为水杨酸所激活。其它所关注的化学品调节启动子包括类固醇反应性启动子(参见，例如，Sehena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见，例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利第5,814,618号和第5,789,156号)，其通过引用并入本文。

可以利用组织偏好启动子将增强的杀虫蛋白表达靶定在特定植物组织内。组织偏好启动子包括以下所讨论的那些，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505。如有必要，可以为弱表达修饰这些启动子。

叶偏好启动子为本领域已知。参见，例如，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor et al.(1993)Plant J.3：509-18；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。

根偏好或根特异性启动子是已知的，并且可以选自可由文献获得的许多启动子，或者从各种可相容物种重新分离。参见，例如，Hire etal.(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller and Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(法国菜豆GRP 1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆根和根瘤中表达)。另见Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了分离自血色素基因的两种根特异性启动子，所述基因来自固氮的非豆科糙叶山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮的非豆科山黄麻(Trema tomentosa)。使这些基因的启动子与β-葡糖苷酸酶报告基因相连，并被导入非豆科烟草(Nicotiana tabacum)和豆科百脉根(Lotus corniculatus)两者，并且在两例中均保留了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们的结论是增强子和组织偏好DNA决定子在这些启动子中分离。Teeri et al.(1989)使用与lacZ的基因融合，来表明编码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖表皮尤其活跃，并且TR2’基因在完整植物中是根特异性的，且因叶组织受伤而被刺激，这是与杀昆虫或杀幼虫基因联用所尤其需要的特征组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1’基因表现类似的特征。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；以及rolB启动子(Capana et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。另见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。

“种子偏好”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育中具有活性的那些启动子，诸如种子贮藏蛋白的启动子)和“种子萌发”启动子(在种子萌发中具有活性的那些启动子)两者。参见Thompson et al.(1989)BioEssays 10：108，其通过引用并入本文。所述种子偏好启动子包括，但不限于，Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；以及milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)(参见美国专利第6,225,529号，其通过引用并入本文)。γ-玉米蛋白和Glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于，豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等等。另见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好启动子；其通过引用并入本文。具有特定组织“偏好”表达的启动子在该组织的表达的程度比在至少一种其它植物组织中的表达程度高。一些组织偏好的启动子表现几乎专门在特定组织中表达。

当需要低水平表达时，可以使用弱启动子。通常，如本文所用的术语”弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。低水平表达意指约1/1000转录本至约1/100,000转录本至约1/500,000转录本的水平。可选择地，应认识到术语”弱启动子”还包括仅在少数细胞而不在其它细胞中驱动表达从而造成总的低水平表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以缺失或修饰该启动子序列的部分从而降低表达水平。

所述弱组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利第6,072,050号)、35S CaMV核心启动子等等。其它的组成型启动子包括，例如，公开于美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611的那些；其通过引用并入本文。

通常，表达盒会包括用于选择所转化细胞的可选择标志物基因。利用可选择标志物基因选择所转化细胞或组织。标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些，以及赋予除草剂化合物抗性的基因，所述化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。适当的可选择标志物基因的另外实例包括但不限于，编码对以下物质的抗性的基因，所述物质为氯霉素(Herrera Estrella et al.(1983)EMBO J.2：987-992)；甲氨蝶呤(Herrera Estrella et al.(1983)Nature 303：209-213；和Meijer et al.(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)；链霉素(Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard et al.(1996)Transgenic Res.5：131-137)；博来霉素(Hille et al.(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)；磺胺药物(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136)；溴苯腈(Stalker et al.(1988)Science 242：419-423)；草甘膦(Shaw et al.(1986)Science 233：478-481；和美国申请序列号10/004,357和10/427,692)；草铵膦(DeBlock et al.(1987)EMBO J.6：2513-2518)。通常参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao et al.(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu et al.(1987)Cell 48：555-566；Brown et al.(1987)Cell 49：603-612；Figge etal.(1988)Cell 52：713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(海德堡大学博士论文)；Reines etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(海德堡大学博士论文)；Gossenet al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology(实验药理学手册)，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；和Gill et al.(1988)Nature 334：721-724。所述公开通过引用并入本文。

以上所列可选择标志物基因并非意在限制。实施方式可以使用任一可选择标志物基因。

实施方式的方法涉及将多肽或多核苷酸导入植物。”导入”意在表示向植物呈递多核苷酸或多肽，以致该序列进入所述植物的细胞内部。实施方式的方法不依赖将多核苷酸或多肽导入植物的特定的方法，只要所述多核苷酸或多肽进入所述植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽导入植物的方法为本领域已知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“稳定转化”意在表示导入植物的核苷酸构建体整合进植物基因组，并且能够遗传给其子代。”瞬时转化”意在表示多核苷酸被导入植物但不整合进植物基因组，或者多肽被导入植物。

转化操作步骤和将核苷酸序列导入植物的操作步骤可以因作为转化靶标的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而不同。将核苷酸序列导入植物细胞继而插入该植物基因组的适当方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)，农杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055号和第5,981,840号)，直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722)，和弹道颗粒加速(参见，例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养：基础方法)，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926)；和Lecl转化(WO 00/28058)。对于马铃薯转化，参见Tu et al.(1998)Plant Molecular Biology 37：829-838和Chonget al.(2000)Transgenic Research 9：71-78。另外的转化方法可以在以下文献中找到，Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(胚珠组织的实验操作)，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米，通过根癌农杆菌)；以上所有均通过引用并入本文。

在具体实施方式中，可以使用各种瞬时转化方法向植物提供实施方式的序列。所述瞬时转化方法包括但不限于，将Cry毒素蛋白或其变体和其片段直接导入植物，或者将Cry毒素转录本导入所述植物。所述方法包括，例如，显微注射或颗粒轰击。参见，例如，Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784，以上所有均通过引用并入本文。可选择地，使用本领域已知技术能将Cry毒素的多核苷酸瞬时转化进植物。所述技术包括病毒载体系统以及对多核苷酸的沉淀以致阻止DNA随后的释放。因而，可以发生从颗粒结合的DNA的转录，但是它被释放而整合进基因组的频率大大降低。所述方法包括使用聚乙亚胺包被的颗粒(PEI；Sigma #P3143)。

本领域已知在植物基因组特定位置靶向插入多核苷酸的方法。在一个实施方式中，使用位点特异性重组系统实现在所需基因组位置插入多核苷酸。参见，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上所有均通过引用并入本文。简言之，实施方式的多核苷酸可以包含在转移盒内，所述转移盒侧翼连接两个非一致的重组位点。将该转移盒导入植物，于靶位点稳定整合进其基因组，所述靶位点侧翼连接对应于转移盒位点的两个非一致的重组位点。提供合适的重组酶，转移盒于靶位点被整合。因而，目的多核苷酸于植物基因组中特定的染色体位置被整合。

依照常规方式，可以使已被转化的细胞生长成植物。参见，例如，McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。随后可以使这些植物生长，并且用相同的转化品系或不同品系授粉，鉴定具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂合体。可以生长两代或更多代，从而保证所需表型特征的表达保持稳定并被遗传，随后收获种子，以确保已经实现所需表型特征的表达。

可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触，向植物提供实施方式的核苷酸序列。通常，所述方法涉及在病毒DNA或RNA分子内并入目的核苷酸构建体。应认识到，可以最初将实施方式的重组蛋白作为病毒聚合蛋白的部分来合成，随后可以通过体内或体外的蛋白水解来处理所述聚合蛋白，从而产生所需杀虫蛋白。还应认识到包含实施方式杀虫蛋白的氨基酸序列的至少一部分的这种病毒聚合蛋白可以具有所需的杀虫活性。实施方式包括所述病毒聚合蛋白以及编码它们的核苷酸序列。向植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码蛋白的方法为本领域已知，其涉及病毒DNA或RNA分子。参见，例如，美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367；和5,316,931；其通过引用并入本文。

实施方式还涉及实施方式的所转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子，块茎，球茎，鳞茎，叶，和根与芽的插条。

实施方式可以用于转化任意植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注植物的实例包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica)的种(如油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作籽油来源的那些芸苔属的种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、粟(如狼尾草(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、穇子(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(Lactuca sativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、以及黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、罗马甜瓜(C.cantalupensis)以及甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)以及菊花。可用于实践实施方式的针叶树包括例如：松，诸如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinus contorta)以及辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加拿大铁杉(Tsuga canadensis)；白云杉(Piceaglauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉，诸如银冷杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；以及雪松，诸如西方红色雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄柏(Chamaecyparis nootkatensis)。实施方式的植物包括农作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，诸如玉米和大豆植物。

草坪草包括但不限于一年生早熟禾(Poa annua)；一年生黑麦草(Lolium multiflorum)；加拿大早熟禾(Poa compressa)；邱氏羊茅(Festucarubra)；细弱翦股颖(Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(Agrostis palustris)；麦穗草(Agropyron desertorum)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；草地早熟禾(Poa pratensis)；野茅(Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；紫羊茅(Festuca rubra)；小糠草(Agrostis alba)；粗茎早熟禾(Poa trivialis)；羊茅(Festuca ovina)；无芒雀麦(Bromus inermis)；高羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；绒毛剪股颖(Agrostis canina)；硷茅(Puccinellia distans)；蓝茎冰草(Agropyron smithii)；狗牙草(Cynodon spp.)；圣奥古斯丁草(Stenotaphrum secundatum)；结缕草(Zoysia spp.)；巴哈雀稗(Paspalum notatum)；地毯草(Axonopus affinis)；假俭草(Eremochloa ophiuroides)；狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(Paspalumvaginatum)；格兰马草(Bouteloua gracilis)；水牛草(Buchloe dactyloids)；侧穗格兰马草(Bouteloua curtipendula).

所关注的植物包括提供所关注的种子的谷类植物、含油种子植物以及豆科植物。所关注的种子包括谷类种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、黍等。含油种子植物包括棉、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉米、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴、大豆、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

在某些实施方式中，实施方式的核酸序列可以与任意组合的目的多核苷酸序列堆叠，从而产生具有所需表型的植物。例如，实施方式的多核苷酸可以与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的其它任何多核苷酸堆叠，所述多肽诸如其它Bt毒素蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser et al.(1986)Gene 48：109)、pentin(描述于美国专利第5,981,722号)等等。生成的组合还可以包含多拷贝的任一目的多核苷酸。也可以将实施方式的多核苷酸与其它任一基因或基因的组合相堆叠，从而产生具有各种所需性状组合的植物，其包括但不限于动物取食所需的性状，诸如高油基因(例如，美国专利第6,232,529号)；平衡型氨基酸(例如，hordothionins(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,049)；大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359；和Musumuraet al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强的消化性(例如，修饰的贮藏蛋白(2001年11月7日提交的美国申请序列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请序列号10/005,429)，其公开内容通过引用并入本文。

还可以将实施方式的多核苷酸与疾病或除草剂抗性所需的性状相堆叠(例如，烟曲霉毒素去毒基因(美国专利第5,792,931号)；无毒性和疾病抗性基因(Jones et al.(1994)Science 266：789；Martin et al.(1993)Science 262：1432；和Mindrinos et al.(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，诸如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂，诸如草铵膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因和GAT基因，如美国申请序列号10/004,357；和10/427,692所公开)；以及与加工或加工产物所需的性状相堆叠，诸如高油(例如，美国专利第6,232,529号)；修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5,952,544号；WO 94/11516))；修饰的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉支化酶(SBE)和淀粉去支化酶(SDBE))；以及多聚物或生物塑料(例如，美国专利第5.602,321号；β-酮硫解酶，聚羟基丁酯合酶，和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，其公开内容通过引用并入本文。也可以将实施方式的多核苷酸与提供农艺学性状或转化技术性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状诸如雄性不育(例如，参见美国专利第5.583,210号)、茎强度、开花时间，所述转化技术性状诸如细胞周期调节或基因打靶(例如，WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)，其公开内容通过引用并入本文。

可以通过包括但不限于杂交育种植物或遗传转化的任何方法来产生这些堆叠的组合物，所述杂交育种植物通过任何常规方法或方法。如果通过遗传转化植物来堆叠性状，那么可以在任意时间以任意顺序组合目的多核苷酸序列。例如，可以将包含一种或多种所需性状的转基因植物用作靶标，从而通过随后的转化导入其它性状。可以使用转化盒的任意组合所提供的目的多核苷酸，以共转化操作步骤同时导入所述性状。例如，如果要导入两条序列，那么所述两条序列可以包含在分开的转化盒(反式)或包含在相同的转化盒(顺式)中。可以借助相同的启动子或借助不同的启动子驱动序列的表达。在某些情况下，需要导入抑制目的多核苷酸表达的转化盒。可以将其与其它抑制盒或过表达盒的任意组合相组合，从而在植物中生成所需的性状组合。还认识到可以使用位点特异性重组系统，将多核苷酸序列在所需基因组位置堆叠。参见，例如，WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855和WO99/25853，所有这些都通过引用并入本文。

可以将实施方式的组合物用于保护植物、种子和各种方式的植物产物。例如，组合物能用于下述方法，该方法涉及将有效量的杀虫组合物通过操作置于害虫环境，所述操作选自喷洒(spraying)、撒粉(dusting)、撒播(broadc asting)或种子包被。

在将植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、谷物、种子)、尤其是种子作为商品销售时，通常用保护剂包被将其处理，所述保护剂包被包括除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂，或这些制备物中的几种的混合物，如有需要，以及用另外的载体、表面活性剂或者通常用于制剂领域的促应用佐剂处理，从而提供对细菌、真菌或动物害虫造成的损害的保护。为了处理种子，可以通过用液体制剂浸渍块根或谷物，或者通过用组合的湿性或干性制剂将其包被，来将保护剂包被用于种子。另外，在特殊情况下，应用于植物的其它方法是可行的，例如针对芽或果实的处理。

可以用种子保护剂包被处理实施方式的植物种子，所述植物种子包含编码实施方式的杀虫蛋白的核苷酸序列，并且所述种子保护剂包被包含种子处理化合物，诸如，例如，克菌丹、萎锈灵、福美双、methalaxyl、安定磷和通常用于种子处理的其它化合物。在一个实施方式中，包含实施方式的杀虫组合物的种子保护剂包被单独使用，或与通常用于种子处理的种子保护剂包被中的一种组合使用。

认识到可以使用编码杀虫蛋白的基因来转化昆虫致病生物体。所述生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。

可以通过合适的载体将编码实施方式的杀虫蛋白的基因导入微生物宿主，将所述宿主应用于环境、或者植物或动物。在将核酸插入细胞的上下文中的术语“导入的”指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括涉及将核酸并入真核或原核细胞，其中可以将核酸整合进细胞基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变成自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

可以选择已知占据一种或多种目的作物“植物圈”(叶面、叶围、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物，使其能够在特定环境中与野生型微生物成功竞争，使表达杀虫蛋白的基因稳定地维持和表达，以及令人满意地，提高对环境降解和失活杀虫剂的防护。

所述微生物包括细菌、藻类和真菌。特别引人注目关注的微生物诸如是细菌，例如，假单孢菌属(Pseudomonas)，欧文氏菌属(Erwinia)，沙雷氏菌属(Serratia)，克雷伯菌属(Klebsiella)，黄单胞菌属(Xanthomonas)，链霉菌属(Streptomyces)，根瘤菌属(Rhizobium)，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，Methylius，农杆菌属(Agrobacterium)，醋杆菌属(Acetobacter)，乳酸杆菌属(Lactobacillus)，节细菌属(Arthrobacter)，固氮菌属(Azotobacter)，明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)；是真菌，特别地是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)，隐球菌属(Cryptococcus)，克鲁维斯酵母属(Kluyveromyces)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)，红酵母属(Rhodotorula)和黑酵母属(Aureobasidium)。特别关注的是植物圈细菌物种，诸如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，木醋酸菌(Acetobacter xylinum)，农杆菌属(Agrobacteria)，球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroids)，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)，真养产碱杆菌(Alcaligenes entrophus)，木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandir)和植物圈酵母物种，诸如深红酵母(Rhodotorula rubra)，粘红酵母(R.glutinis)，海滨红酵母(R.marina)，橙红酵母(R.aurantiaca)，浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)，流散隐球酵母(C.diffluens)，罗伦隐球菌(C.laurentii)，玫瑰酵母(Saccharomyces rosei)，S.pretoriensis，酿酒酵母(S.cerevisiae)，玫瑰色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)，香气掷孢酵母(S.odorus)，Kluyveromyces veronae和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别关注的是色素性微生物。

可以使用现有的许多方式，在允许稳定地维持和表达基因的条件下，将表达杀虫蛋白的基因导入微生物宿主。例如，能构建表达盒，所述表达盒包括目的核苷酸构建体以及与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列和/或在该宿主中具有功能的复制系统，所述核苷酸构建体与用于表达该核苷酸构建体的转录和翻译调节性信号可操作连接，借助所述核苷酸序列，发生整合，借助所述复制系统，发生整合或稳定的维持。

转录和翻译调节性信号包括但不限于，启动子、转录起始位点、操作基因、活化子(activator)、增强子、其它调节性元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等等。参见，例如，美国专利第5,039,523号和第4,853,331号；EPO 0480762A2；Sambrook et al.(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，ed.Maniatis et al.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，下称″Sambrook II″；Davis et al.，eds.(1980)Advanced Bacterial Genetics(高级细菌遗传学)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Cold Spring Harbor，New York；并且所述参考文献为本文所引用。

合适的宿主细胞可以包括原核细胞或真核细胞，其通常限于不产生对诸如哺乳动物的高等生物体有毒性的物质的那些细胞，其中处理含杀虫蛋白的细胞，从而在将受处理细胞应用于具有一种或多种靶害虫的环境时，延长杀虫蛋白在所述细胞中的活性。然而，能使用产生对高等生物体具有毒性的物质的生物体，其中所述毒素不稳定或者应用水平足够低，以致避免对哺乳动物宿主存在毒性的任何可能。作为宿主，特别关注的是原核细胞和低等真核细胞，诸如真菌。示例性的原核细胞(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌属，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽胞杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，诸如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，诸如发光菌，酵单胞菌属(Zymomonas)，沙雷氏菌属，气单胞菌属(Aeromonas)，弧菌属(Vibrio)，脱硫弧菌属(Desulfovibrio)，螺旋菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)诸如假单胞菌属和醋杆菌；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核细胞有真菌，诸如藻状菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母，诸如酵母属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；以及担子菌(Basidiomycetes)酵母，诸如红酵母属，短梗霉属(Aureobasidium)，掷孢酵母属等。

在为产生杀虫蛋白而选择宿主细胞方面特别关注的特征包括将杀虫蛋白基因导入宿主的便捷、表达系统的可获得性、表达的效率、蛋白在宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。用作杀虫剂微胶囊的所关注的特征包括对于杀虫剂的保护性特性，诸如厚的细胞壁、色素沉着和胞内包装或包涵体形成；叶亲和性；哺乳动物毒性的缺乏；对昆虫食入的吸引；杀死和固定且不损害毒蛋白的便捷；等等。其它考虑包括制剂和处理的便捷，经济，储藏稳定性等等。

特别关注的宿主生物体包括酵母，诸如红酵母(Rhodotorula spp.)，短梗霉(Aureobasidium spp.)，酵母(Saccharomyces spp.)(诸如，酿酒酵母)，掷孢酵母(Sporobolomyces spp.)；叶面生物体，诸如假单胞菌(Pseudomonas spp.)(诸如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)，荧光假单胞菌)，欧文氏菌(Erwinia spp.)以及黄质菌(Flavobacterium spp.)；以及其它此类生物体，包括Bt、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)等等。

编码实施方式的杀虫蛋白的基因能导入依靠植物倍增的微生物(附生植物)，从而将杀虫蛋白递送至潜在的靶害虫。附生植物，例如，可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阳性菌。

根定殖(root-colonizing)的细菌，例如，可以通过本领域已知方法分离自所关注的植物。具体地，定殖根的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株可以分离自植物根(参见，例如，Handelsman et al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718)。可以通过本领域已知的标准方法，将编码实施方式的杀虫蛋白的基因导入根定殖的蜡状芽胞杆菌。

借助电转化能将编码杀虫蛋白的基因导入，例如，根定殖的芽孢杆菌。具体地，编码杀虫蛋白的基因能克隆至穿梭载体，例如，pHT3101(Lerecius et al.(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218)。包含特定杀虫蛋白基因的编码序列的穿梭载体pHT3101，例如，借助电穿孔能转化至根定殖的芽孢杆菌(Lerecius et al.(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218)。

可以设计表达系统，以致，例如将杀虫蛋白分泌至诸如大肠杆菌的革兰氏阴性菌的胞质外。使杀虫蛋白分泌的优点在于：(1)避免所表达杀虫蛋白的潜在细胞毒性作用；以及(2)改善杀虫蛋白的纯化效率，包括但不限于，提高每体积细胞肉汤的蛋白复性和纯化效率，缩短每单位蛋白复性和纯化的时间和/或减少其成本。

可以制备大肠杆菌分泌的杀虫蛋白，例如，通过将合适的大肠杆菌信号肽融合至杀虫蛋白的氨基端末端。可以在大肠杆菌已知分泌的蛋白中发现大肠杆菌识别的信号肽，例如OmpA蛋白(Ghrayeb et al.(1984)EMBO J，3：2437-2442)。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白，它的信号肽因而被认为在转位过程中有效。另外，加工前，OmpA信号肽不需要被修饰，例如脂蛋白信号肽的其它信号肽可能如此(Duffaud et al.(1987)Meth.Enzymol.153：492)。

实施方式的杀虫蛋白在细菌宿主中能发酵，加工所得细菌并将其以与将Bt菌株用作杀昆虫喷雾剂的相同方式用作微生物喷雾剂。在芽孢杆菌分泌一种或多种杀虫蛋白的情况下，使用本领域已知方法去除或突变分泌信号。所述突变和/或缺失阻止在发酵过程中将一种或多种杀虫蛋白分泌至生长培养基。在细胞内保留杀虫蛋白，随后加工所述细胞以产生封装的杀虫蛋白。为该目的可以使用任意合适的微生物。假单胞菌已被用于将Bt毒素表达为封装的蛋白，加工所得细胞，并将其作为杀昆虫剂喷洒(Gaertner et al.(1993)，in：Advanced Engineered Pesticides(高级工程化杀虫剂)，ed.Kim)。

可选择地，通过将异源基因导入细胞宿主来产生杀虫蛋白。异源基因的表达直接或间接地导致杀虫剂的胞内产生和维持。随后将细胞应用于具有一种或多种靶害虫的环境时，在延长细胞所产生毒素活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留毒蛋白的毒性。随后可以根据常规技术配制这些天然封装的杀虫蛋白，以将其应用于具有靶害虫的环境，例如土壤、水和植物的叶子。参见，例如EPA 0192319，所述参考文献为本文所引用。

在实施方式中，可接受的载体能将转化的微生物(其包括整个生物体、细胞、一种或多种孢子、一种或多种杀虫蛋白、一种或多种杀虫组分、一种或多种影响害虫的组分、一种或多种突变体、活细胞或死细胞和细胞组分，包括活细胞和死细胞和细胞组分的混合物，并且包括破损的细胞和细胞组分)或分离的杀虫蛋白配制成一种或多种杀虫组合物，所述杀虫组合物，例如是悬浮液、溶液、乳剂、粉剂、可分散颗粒或小球、可湿性粉剂和可乳化浓缩物、烟雾剂或喷雾剂、浸渍颗粒、佐剂、可包被糊剂、胶体，以及另外用例如多聚物物质封装。可以通过常规手段制备所述配制的组合物，所述手段诸如干燥、冻干、均质化、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩包含所述多肽的细胞培养物。

可以通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、取食刺激剂、引诱剂、封装剂、黏合剂、乳化剂、染料、UV保护剂、缓冲液、流平剂或肥料、微营养供体或者影响植物生长的其它制备物，来获得以上公开的所述组合物。可以将一种或多种农用化学品与通常用于制剂领域的载体、表面活性剂或佐剂或者其它组分组合，以促进为特定靶害虫的产物处理和应用。适当的载体和佐剂可以是固体的或液体的，并且对应于通常用于制剂技术的物质，例如，天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、黏合剂或肥料。实施方式的活性成分通常以组合物形式应用，并且可以应用于待处理的作物区域、植物或种子。例如，可以在制备粮仓或筒仓等时，或者在粮仓或筒仓等储藏时，将实施方式的组合物应用于谷物。可以与其它化合物同时或连续应用实施方式的组合物。应用实施方式的活性成分或实施方式的农用化学品组合物的方法包括但不限于叶敷、种子包被和土壤施用，所述活性成分或农用化学品组合物包含实施方式的细菌菌株产生的至少一种杀虫蛋白。应用的数量和速率取决于对应害虫群袭的强度。

合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，诸如，例如金属羧酸盐；长链脂肪酸羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸和脂肪醇乙氧基化物的一元或二元酯或者所述酯的盐；脂肪醇硫酸盐，诸如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基脂肪醇硫酸盐；乙氧基烷基苯酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐，诸如烷基-苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如，丁基-萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；更为复杂的磺酸盐，诸如，酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛胆碱的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如二辛基琥珀酸酯的磺酸钠。非离子试剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪-烷基或烯基取代的苯酚与环氧乙烷的缩合产物、多元醇醚的脂肪酯，例如，山梨聚糖脂肪酸酯，所述酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷、炔二醇诸如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基炔二醇的嵌段共聚物。阳离子表面活性剂的实例包括，例如，脂肪族一元胺、二元胺或多聚胺的诸如醋酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或者含氧胺，诸如聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通过缩合羧酸和二元或多聚胺制备的酰胺键合的胺；或者季铵盐。

惰性材料的实例包括但不限于无机矿物质诸如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或者植物材料诸如软木、粉状玉米穗轴、花生壳、稻壳和胡桃壳。

实施方式的组合物能是用于直接应用或作为初始组合物浓缩物的适当形式，所述浓缩物在应用前需要用适量的水或其它稀释剂稀释。杀虫剂浓度依特定制剂的性质而变化，具体地，依它是浓缩物还是要直接使用而变化。所述组合物包含1％至98％的固体或液体惰性载体，以及0％至50％或0.1％至50％的表面活性剂。以商品标签上的比率施用所述组合物，例如干燥形式时每英亩约0.01lb-5.0lb，液体形式时每英亩约0.01pts.-10pts.。

在另一实施方式中，配制前能处理实施方式的组合物和转化的微生物及杀虫蛋白，从而在将其应用至靶害虫的环境时，延长杀虫活性，只要预处理对杀虫活性没有害处。可以通过化学和/或物理手段进行所述处理，只要所述处理不有害地影响一种或多种组合物的性质。化学试剂的实例包括但不限于卤化剂；诸如甲醛和戊二醛的醛；抗感染剂，诸如氯化苄烷氨；醇，诸如异丙醇和乙醇；以及组织学固定剂，诸如布安固定剂(Bouin’s fixative)和海利氏固定剂(Helly’s fixative)(参见，例如Humason(1967)Animal Tissue Techniques(动物组织技术)(W.H.Freeman and Co.)。

在其它实施方式中，可以有利地用例如胰蛋白酶的蛋白酶处理Cry毒素多肽，从而在将实施方式的杀虫蛋白组合物应用至靶害虫环境之前活化所述蛋白。本领域公知通过丝氨酸蛋白酶活化毒素原的方法。参见，例如，Cooksey(1968)Biochem.J.6：445-454和Carroll and Ellar(1989)Biochem.J.261：99-105，通过引用将其教导并入本文。例如，适当的活化操作步骤包括但不限于将待活化多肽，例如纯化的新的Cry多肽(例如，具有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列)，与胰蛋白酶在20nM NaHCO₃，pH 8中，以蛋白/胰蛋白酶重量比1/100相组合，并且将所述样品在36C消化3小时。

可以在害虫开始出现或在害虫出现前，将组合物(包含实施方式的所转化微生物和杀虫蛋白)作为保护措施应用于昆虫害虫环境，所述应用通过例如，喷洒、雾化、粉化、散布、包被或倾倒、引入土壤或引至土壤表面、引入灌溉水，其通过种子处理或通常的应用或粉化。例如，可以将实施方式的杀虫蛋白和/或转化的微生物与谷物混合，从而保护储藏期的谷物。通常重要的是在植物生长早期获得对害虫的良好控制，因为此时植物可以受到最为严重的损害。如认为有必要，实施方式的组合物可以方便地包含另一杀昆虫剂。在一个实施方式中，在种植时，将组合物直接应用至土壤，所述应用是以载体和芽孢杆菌菌株或实施方式所转化微生物的死细胞的组合的颗粒形式。另一实施方式是组合物的颗粒形式，所述组合物包含农用化学品，诸如，例如，除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体和芽孢杆菌菌株或实施方式的所转化微生物的死细胞。

本领域技术人员将认识到，不是所有化合物对全部害虫都具有同样效果。实施方式的化合物显示抗昆虫害虫的活性，所述害虫可以包括经济上重要的农艺学害虫、林业害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏品害虫、食物和纤维害虫、公众和动物健康害虫、家用和商用建筑害虫、家用品害虫和储物害虫。昆虫害虫包括选自鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等、特别是鳞翅目的昆虫。

鞘翅目的幼虫和成虫包括长角象鼻虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)以及象甲科(Curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：棉铃象甲(Anthonomus grandis Boheman，boll weevil)；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel，rice water weevil)；谷象(Sitophilus granarius Linnaeus，granary weevil)；米象(S.oryzae Linnaeus，rice weevil)；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius，clover leaf weevil)；向日葵茎象甲(Cylindrocopturus adspersus LeConte，sunflower stem weevil)；红色种子象甲(Smicronyx fulvus LeConte，red sunflower seed weevil)；灰色种子象甲(S.sordidus LeConte，gray sunflower seed weevil)；玉米象甲(Sphenophorus maidis Chittenden，maize billbug)；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫(包括但不限于：科罗拉多州马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say，Colorado potato beetle)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte，western corn rootworm)；巴氏根叶甲(D.barberi Smith & Lawrence，northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi Barber，southern corn rootworm)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer，corn flea beetle)；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze，corn flea beetle)；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea Fabricius，grape colaspis)；黑角负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus，cereal leaf beetle)；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius，sunflower beetle))；瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant，Mexican bean beetle)；蜣螂科(Scarabaeidae)的金龟子和其他的甲虫(包括但不限于：日本金龟子(popillia japonica Newman，Japanese beetle)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow，northern masked chafer，white grub)；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier，southern masked chafer，white grub)；欧洲金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky，European chafer)；蛴螬(Phyllophaga crinita Burmeister，white grub)；胡萝卜甲虫(Ligyrus gibbosus De Geer，carrot beetle))；皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹；叩甲科(Elateridae)的线虫：伪金针虫(Eleodes spp.)、金针虫(Melanotus spp.)、单叶叩甲(Conoderus spp.)、Limonius spp.、锥尾叩甲(Agriotes spp.)、Ctenicera spp.、Aeolus spp.；小蠹科(Scolytidae)的小蠹虫以及拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。

鳞翅目的幼虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和heliothine：秋粘虫(Spodoptera frugiperda JE Smith，fallarmyworm)；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner，beet armyworm)；斜纹夜蛾(S.litura Fabhcius，tobacco cutworm，cluster caterpillar)；蓓带夜蛾(Mamestra configurata Walker，bertha armyworm)；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus，cabbage moth)；黑切根虫(Agrotis ipsilon Hufnagel，black cutworm)；西部切根虫(A.orthogonia Morrison，western cutworm)；颗粒夜蛾(A.subterranea Fabricius，granulate cutworm)，木棉虫(Alabama argillacea Hübner，cotton leaf worm)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner，cabbage looper)；大豆夜蛾(Pseudoplusia includens Walker，soybean looper)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner，velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra Fabricius，green cloverworm)；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius，tobacco budworm)；一星粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth，armyworm)；粗皮夜蛾(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough，rough skinned cutworm)；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris，darksided cutworm)；埃及金钢钻(Earias insulana Boisduval，spiny bollworm)；翠纹金钢钻(E.vittella Fabricius，spotted bollworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner，Americanbollworm)；谷实夜蛾(H.zea Boddie，corn earworm或cotton bollworm)；纹蝶毛虫(Melanchra picta Harris，zebra caterpillar)；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote，citrus cutworm)；螟蛾科(Pyralidae)的钻孔虫、鞘蛾、结网毛虫、球果蛾以及斑蛾：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，European corn borer)；脐橙螟(Amyelois transitella Walker，naval orangeworm)；地中海粉斑螟(Anagasta kuehniella Zeller，Mediterranean flour moth)；干果斑螟(Cadra cautella Walker，almond moth)；二化螟(Chilo suppressalis Walker，rice stem borer)；斑禾草螟(C.partellus，sorghum borer)；米蛾(Corcyra cephalonica Stainton，rice moth)；玉米根结网毛虫(Crambus caliginosellus Clemens，corn root webworm)；蓝草结网毛虫(C.teterrellus Zincken，bluegrass webworm)；稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee，rice leaf roller)；葡萄卷叶虫(Desmia funeralis Hübner，grape leaffolder)；甜瓜野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus，melon worm)；泡菜虫(D.nitidalis Stoll，pickleworm)；西南玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar，southwestern corn borer)；小蔗螟(D.saccharalis Fabricius，surgarcane borer)；墨西哥水稻螟(Eoreuma loftini Dyar，Mexican rice borer)；烟草粉螟(Ephestia elutella Hübner，tobacco(cacao)moth)；蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus，greater wax moth)；野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker，sod webworm)；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum Hulst，sunflower moth)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller，lesser cornstalk borer)；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius，lesser wax moth)；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus，beet webworm)；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker，tea tree web moth)；豆野螟(Maruca testulalis Geyer，bean pod borer)；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner，Indian meal moth)；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker，yellow stem borer)；温室螟(Udea rubigalis Guenee，celery leaftier)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫：黑头卷叶蛾(Acleris gloverana Walsingham，Western blackheaded budworm)；黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald，Eastern blackheaded budworm)；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker，fruit tree leaf roller)；欧洲卷叶蛾(A.rosana Linnaeus，European leaf roller)；以及其他的黄卷蛾属(Archips)物种：棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana Fischer vonsummer fruittortrix moth)；条纹向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham，banded sunflower moth)；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham，filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus，coding moth)；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens，variegated leafroller)；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham，omnivorous leafroller)；欧洲葡萄小卷叶蛾(Lobesia botrana Denis & Schiffermüller，European grape vine moth)；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller，eyespotted bud moth)；萄果实蛀虫(Endopiza viteana Clemens，grape berry moth)；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner，vine moth)；巴西苹果卷叶蛾(Bonagota salubricola Meyrick，Brazilian apple leafroller)；梨小食心虫(Grapholita molesta Busck，oriental fruit moth)；向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley，sunflower budmoth)；条卷蛾(Argyrotaenia spp.)；尾蛱蝶(Choristoneura spp.)。

鳞翅目的所选其它农艺害虫包括但不限于：秋星尺蠖(Alsophila pometaria Harris，fall cankerworm)；桃枝麦蛾(Anarsia lineatella Zeller，peach twig borer)；犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith，orange striped oakworm)；柞蚕(Antheraea pernyi Guerin-Meneville，Chinese Oak Silkmoth)；家蚕(Bombyx mori Linnaeus，Silkworm)；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck，cotton leaf perforator)；苜蓿黄蝶(Colias eurytheme Boisduval，alfalfa caterpillar)；胡桃黄蝶(Datana integerrima Grote & Robinson，walnut caterpillar)；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov，Siberian silk moth)；白尺蠖(Ennomos subsignaria Hübner，elm spanworm)；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris，linden looper)；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus，browntail moth)；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guerin-Meneville，grapeleaf skeletonizer)；范围毛虫飞蛾(Hemileuca oliviae Cockrell，range caterpillar)；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury，fall webworm)；番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham，tomato pinworm)；二尾蛱蝶(Lambdina fiscellariafiscellaria Hulst，Eastern hemlock looper)；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst，Western hemlock looper)；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus，satin moth)；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus，gypsy moth)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth，five spotted hawk moth，tomato hornworm)；烟草天(M.sexta Haworth，tomato homworm，tobacco hornworm)；冬尺蠖(Operophtera brumata Linnaeus，winter moth)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck，spring cankerworm)；大凤蝶(Papilio cresphontes Cramer，giant swallowtail，orange dog)；加州株虫(Phryganidia californica Packard，California oakworm)；柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella Stainton，citrus leafminer)；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius，spotted tentiform leafminer)；大菜粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus，large white butterfly)；小菜粉蝶(P.rapae Linnaeus，small white butterfly)；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus，green veined white butterfly)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley，artichoke plume moth)；菱斑饿(Plu tella xylostella Linnaeus，diamondback moth)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders，pink bollworm)；南方菜蛾(Pontia protodice Boisduval & Leconte，Southern cabbageworm)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenee，omnivorous looper)；康辛蠊(Schizura concinna J.E.Smith，red humped caterpillar)；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier，Angoumois grain moth)；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller，pine processionarycaterpillar)；结网衣蛾(Tineola bisselliella Hummel，webbing clothesmoth)；番茄斑潜蝇(Tutaa aboluta Meyrick，tomato leafminer)；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus，ermine moth)；Heliothis subflexa Guenee；天幕毛虫(Malacosoma spp)；以及毒蛾(Orgyia spp)。

双翅目的成虫和幼虫包括：诸如玉米斑潜叶蝇(Agromyza parvicornis Loew，corn blotch leafminer)的潜叶蝇；蚊(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett，sorghum midge)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say，Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana Gehin，wheat midge)；葵花籽蚊(Neolasioptera murtfeldtiana Felt，sunflower seed midge))；果实蝇(实蝇科(Tephritidae))，瑞典秆蝇(Oscinella frit Linnaeus，frit flies)；蛆(包括但不限于：灰地种蝇(Deliaplatura Meigen，seedcom maggot)；麦种蝇(D.coarctata Fallen，wheat bulb fly)；以及其它地种蝇(Delia spp.)，美洲秆蝇(Meromyza americana Fitch，wheat stem maggot)；舍蝇(Musca domestica Linnaeus，house flies)；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)，小舍蝇(F.femoralis Stein，lesser house flies)；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus，stable flies))；秋家蝇、角蝇、丽蝇、金蝇(Chrysomya spp.)；伏蝇(Phormia spp.)；以及其他的苔藓蝇害虫，马蝇，虻(Tabanus spp.)；胃蝇，胃蝇(Gastrophilus spp.)；狂蝇(Oestrus spp.)；牛皮蝇，皮蝇(Hypoderma spp.)；斑虻，斑虻(Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus，keds)；以及其他的短角亚目(Brachycera)，蚊子，伊蚊(Aedes spp.)；按蚊(Anopheles spp.)；库蚊(Culex spp.)；黑蝇，原蚋(Prosimulium spp.)；蚋(Simulium spp.)；咬蠓、白蛉、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。

半翅目和同翅目的成虫和若虫包括昆虫，诸如但不限于：球蚜科(Adelgidae)的球蚜、盲蝽科(Miridae)的盲蝽、蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉科(Cicadellidae)的叶蝉、小绿叶蝉(Empoasca spp.)；菱飞虱科(Cixiidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、圆飞虱科(Issidae)以及稻虱科(Delphacidae)的飞虱；角蝉科(Membracidae)的角蝉；木虱科(Psyllidae)的木虱；粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱；蚜科(Aphididae)的蚜虫；根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧；链介壳虫科(Asterolecanidae)、软介壳虫科(Coccidae)、洋红蚧科(Dactylopiidae)、盾介壳虫科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)以及硕介壳虫科(Margarodidae)的介壳虫；网蝽科(Tingidae)的网蝽；蝽科(Pentatomidae)的九香虫；长蝽科(Lygaeidae)的麦长蝽，长椿(Blissus spp.)；以及其他的蝽类(seed bugs)，沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽、以及红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。

同翅目中农艺上重要的成员还包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris，pea aphid)；豇豆蚜(Aphis craccivora Koch，cowpea aphid)；黑豆蚜(A.fabae Scopoli，black bean aphid)；棉蚜(A.gossypii Glover，cotton aphid，melon aphid)；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer，apple aphid)；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch，spirea aphid)；茄沟无网蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach，foxglove aphid)；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell，strawberry aphid)；麦双尾蚜(Diuraphis noxiaKurdjumov/Mordvilko，Russian wheat aphid)；玫瑰苹果蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini，rosy apple aphid)；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus，cabbage aphid)；桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy，mealy plum aphid)；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜(Metopoloph ium dirrhodum Walker，cereal aphid)；大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas，potato aphid)；烟桃蚜(Myzuspersicae Sulzer，peach-potato aphid，green peach aphid)；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley，lettuce aphid)；瘿绵蚜(Pemphigus spp.，root aphids和gall aphids)；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，corn leaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus，bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani，greenbug)；黄色甘蔗蚜(Sipha flava Forbes，yellow sugarcane aphid)；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grain aphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfa aphid)；黑色柑橘蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe，black citrus aphid)以及褐色桔蚜(T.citricida Kirkaldy，brown citrus aphid)；球蚜(Adelges spp.，adelgids)；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande，pecan phylloxera)；甘薯粉虱(Bemisia tabaci Gennadius，tobacco whitefly，sweetpotato whitefly)；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows & Perring，silverleaf whitefly)；柑桔粉虱(Dialeurodes citri Ashmead，citrus whitefly)；烟粉虱(Trialeurodes abutiloneus，bandedwinged whitefly)以及温室白粉虱(T.vaporariorum Westwood，greenhouse whitefly)；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris，potato leafhopper)；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen，smaller brown planthopper)；紫菀叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes，aster leafhopper)；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler，green leafhopper)；二条黑尾叶蝉(N.nigropictus Stal，rice leafhopper)；褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal，brown planthopper)；玉米飞虱(Peregrinus maidis Ashmead，corn planthopper)；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，white-backed planthopper)；稻飞虱(Sogatodes orizicola Muir，rice delphacid)；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee，white apple leafhopper)；葡萄叶蝉(Erythroneoura spp.，grape leafhoppers)；十七年蝉(Magicicada septendecim Linnaeus，periodical cicada)；吹绵蚧(Icerya purchasi Maskell，cottony cushion scale)；梨园盾蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock，San Jose scale)；柑桔臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso，citrus mealybug)；粉蚧的种(Pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsylla pyricola Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmon psylla)。

半翅目中农艺上重要的物种包括但不限于：稻绿蝽(Acrosternum hilare Say，green stink bug)；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer，squash bug)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say，chinch bug)；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius，cotton lace bug)；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant，tomato bug)；棉蝽(Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer，cotton stainer)；褐臭蝽(Euschistus servus Say，brown stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois，one-spotted stink bug)；长蝽(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seed bugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois，tarnished plantbug)；豆荚草盲蝽(L.Hesperus Knight，Western tarnished plant bug)；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus，common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius，European tarnished plant bug)；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus，common green capsid)；水稻稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus，southern green stink bug)；稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius，rice stink bug)；突角长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas，large milkweed bug)；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)。

半翅目中包括的害虫包括：草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin，strawberry bug)；Orthops campestris Linnaeus；苹盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen，apple capsid)；番茄蝽(Cyrtopeltis modestus Distant，tomato bug)；烟草小盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant，suckfly)；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter，whitemarked fleahopper)；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say，honeylocust plant bug)；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight，onion plant bug)；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius，four-lined plant bug)；拟麦长蝽(Nysius ericae Schilling，false chinch bug)；茶黄蓟马(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻青蝽(Nezara viridula Linnaeus，Southern green stink bug)；扁盾蝽(Eurygaster spp.)；缘蝽(Coreidae spp.)；红蝽(Pyrrhocoridae spp.)；谷蛾(Tinidae spp.)；负子蝽(Blostomatidae spp.)；猎蝽(Reduviidae spp.)；以及臭蝽(Cimicidae spp.)。

螨(Acari)(螨(mites))目的成虫和幼虫包括：小麦卷叶螨(Aceria tosichella Keifer，wheat curl mite)；褐色小麦螨(Petrobia latens Müller，brown wheat mite)；叶螨科(Tetranychidae)的蛛螨和恙螨，欧洲叶螨(Panonychus ulmi Koch，European red mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch，two spotted spider mite)；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor，McDaniel mite)；朱砂叶螨(T.cinnabarinus Boisduval，carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski，strawberry spider mite)；细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨，葡萄短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor，citrus flat mite)；瘿螨科(Eriophyidae)的锈螨和芽廮螨以及其他的食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即蜻科(Epidermoptidae)中的锈螨，蠕形螨科(Demodicidae)中的毛囊虫，食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的扁虱，黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say，deer tick)；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann，Australian paralysis tick)；美国狗壁虱(Dermacentor variabilis Say，American dog tick)；美洲壁虱(Amblyomma americanum Linnaeus，lone star tick)；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。

缨尾目(Thysanura)中的虫害包括：西洋衣鱼(Lepisma saccharina Linnaeus，silverfish)；小灶衣鱼(Thermobia domestica Packard，firebrat)。其他的节肢害虫包括蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如棕色隐遁蜘蛛(Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik，brown recluse spider)；和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans Fabricius，black widow spider)；和蚰蜒目(Scutigeromorpha)中的蜈蚣，如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus，house centipede)。

可以在发育早期，例如，如幼虫或其它未成熟形式，测试实施方式的组合物对虫害的杀虫活性。可以在完全黑暗条件下，于约20℃至约30℃，在约30％至约70％的相对湿度中培养昆虫。可以如Czaplaand Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6)：2480-2485所述进行生物分析。本领域技术人员公知培养昆虫幼虫和进行生物分析的方法。

本领域技术人员已知各种生物分析技术。通常的程序包括向封口容器中的饮食来源添加实验化合物或生物体。可以通过但不限于取食和暴露适当长时间后的死亡率变化、体重减少、吸引、驱性和其它行为和物理变化，来测量杀虫活性。可以对幼虫期或成虫期的任何取食虫害使用本文所述的生物分析。

通过说明而非限制的方式陈述下列实施例。

实施例

实施例1：测试苏云金芽孢杆菌毒素对所选昆虫的杀虫活性的生物分析

进行生物分析以评价如SEQ ID NO：2所述的Bt杀昆虫毒素肽对西方玉米根虫的作用。对包含杀昆虫蛋白的人工饮食进行取食分析。使用鞘翅目特异性人工饮食来局部应用杀昆虫蛋白。以每容器每25μl样品1.0μg的比例应用毒素，并将其干燥。该蛋白包含在pH 10的10mM碳酸盐缓冲液中。每一容器放置一个新生幼虫，以随意取食5天。如果有诸如萎缩和或死亡的幼虫反应，则结果为阳性。如果幼虫与食用仅应用上述缓冲液的饮食的阴性对照相似，则结果为阴性。

表1：SEQ ID NO：2的取食生物分析结果

实施例2：确定LC₅₀和EC₅₀

进行生物分析以确定如SEQ ID NO：2所述的杀昆虫毒素肽对西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)的LC₅₀和EC₅₀。对包含杀昆虫蛋白的人工饮食进行取食分析。杀昆虫蛋白用pH 10的10mM碳酸盐缓冲液和昆虫饮食稀释，以达到50000，5000，500，50和5ppm的毒素终浓度。每一容器放置一个新生幼虫，以随意取食5天。在每一剂量下，一式八份进行每一生物分析，将所述生物分析重复三次。通过死亡率将结果示作LC₅₀和/或通过称量每一毒素浓度下的存活幼虫将其示作EC₅₀。

实施例3：通过粒子轰击和再生转基因植物转化玉米

用含有毒素核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的DNA分子轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚，所述毒素核苷酸序列与泛素启动子和可选择的标志物基因PAT(Wohlleben et al.(1988)Gene 70：25-37)可操作连接，其赋予对双丙氨磷除草剂的抗性。可选择地，在单独的DNA分子上提供可选择标志物基因。如下进行转化。培养基配方如下。

靶组织的制备

给穗去皮，用30％CLOROX^TM漂白剂加0.5％微去垢剂将其表面杀菌20分钟，用蒸馏水漂洗两次。切下并放置未成熟胚，胚轴一侧向下(子叶盘一侧向上)，每板25个胚，于560Y培养基放置4小时，随后将其在2.5cm的靶区域内排列，以备轰击。

DNA的制备

制备包含与泛素启动子可操作连接的毒素核苷酸序列(例如SEQID NO：1)的质粒载体。例如，适当的转化载体包含与PinII终止子组合的玉米UBI1启动子、UBI1的5’UTR和UBI1内含子。该载体另外包含CAMV35S启动子驱动的PAT可选择标志物基因，并包含CAMV35S终止子。任选地，可选择标志物可以位于单独的质粒上。使用如下的CaCl2沉淀程序，将包含毒素核苷酸序列和PAT可选择标志物的DNA分子沉淀至1.1μm(平均直径)钨球：

100μL含所制备钨粒的水

10μL(1μg)溶于Tris EDTA缓冲液的DNA(1μg总DNA)

100μL 2.5M CaCl₂

10μL 0.1M亚精胺

将每一试剂顺次加入钨粒悬浮液，同时置于多管涡旋器上。将最终混合物短暂超声破碎，并使其在持续涡旋下孵育10分钟。在沉淀期后，短暂离心所述管，移除液体，用500mL 100％乙醇清洗，离心30秒。再移除液体，将105μL 100％乙醇添加至最终钨粒小球。为粒子枪轰击，将该钨/DNA粒短暂超声处理，并将10μL点至每一大载体(macrocarrier)中心，并使其干燥约2分钟，随后进行轰击。

粒子枪处理

用粒子枪#HE34-1或#HE34-2在水平#4下轰击样品板。所有样品接受650PSI下的单次射击，总共一式十份，其取自具有所制备粒/DNA的每一管。

随后的处理

轰击后，将胚置于560Y培养基2天，随后将其转至含有3mg/升双丙氨磷的560R选择培养基，每2周传代培养。选择约10周后，将抗选择的愈伤克隆转至288J培养基，以起始植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)后，将发育良好的体细胞胚转至出芽培养基，并转至光照培养室。约7-10天后，将发育中的苗转至管中的272V无激素培养基，培养7-10天，直至苗得到良好建成。随后将植物转至含有盆栽土的浅箱(等同于2.5″盆)的垫子上，使其在生长室内生长1周，随后再在温室中生长1-2周，接着将其转移至典型的600盆(1.6加仑)，并使其生长至成熟。通过本领域已知的或如上所述的分析，监测并评分植物的毒素表达。

轰击和培养的培养基

轰击培养基(560Y)包含4.0g/L N6基本盐(SIGMA C-1416)，1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HCl，120.0g/L蔗糖，1.0mg/L 2，4-D和2.88g/L L-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后，用dl H₂O定容)；2.0g/L Gelrite^TM(用dl H₂O定容后添加)；和8.5mg/L硝酸银(将培养基灭菌并冷却至室温后添加)。选择培养基(560R)包含4.0g/L N6基本盐(SIGMA C-1416)，1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HCl，30.0g/L蔗糖，和2.0mg/L 2，4-D(用KOH调至pH 5.8后，用dl H₂O定容)；3.0g/LGelrite^TM(用dl H₂O定容后添加)；和0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨磷(均在将培养基灭菌并冷却至室温后添加)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)，5.0mL/L MS维生素母液(0.100g烟酸，0.02g/L硫胺HCl，0.10g/L吡哆醇HCl和0.40g/L甘氨酸，用精制D-I H₂O定容)(Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)，100mg/L肌-肌醇，0.5mg/L玉米素，60g/L蔗糖，和1.0mL/L的0.1mM脱落酸(调至pH 5.6后，用精制dI H₂O定容)；3.0g/L Gelrite^TM(用dl H₂O定容后添加)；和1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙氨磷(均在将培养基灭菌并冷却至60℃后添加)。

无激素培养基(272V)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)，5.0mL/L MS维生素母液(0.100g烟酸，0.02g/L硫胺HCl，0.10g/L吡哆醇HCl，和0.40g/L甘氨酸，用精制dl H₂O定容)，0.1g/L肌-肌醇，和40.0g/L蔗糖(调pH至5.6后，用精制dl H₂O定容)；和6g/L细菌琼脂粉(用精制dl H₂O定容后添加)，将其灭菌并冷却至60℃。

实施例4：农杆菌介导的玉米转化和转基因植物再生

对于用毒素核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的农杆菌介导的玉米转化，可以使用Zhao的方法(美国专利第5,981,840号和PCT专利公开WO98/32326；其内容通过引用并入本文)。简言之，从玉米分离未成熟胚，使该胚与农杆菌悬浮液接触，所述接触在所述细菌能够将毒素核苷酸序列(SEQ ID NO：1)转移至至少一个未成熟胚的至少一个细胞的条件下进行(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，可以将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液以起始接种。将胚与农杆菌共培养一定时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在该共培养期后，涉及任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，在存在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素但不添加用于植物转化体的选择试剂下，孵育所述胚(步骤3：静息步骤)。为清除农杆菌和为所感染细胞的静息期，将未成熟胚在具有抗生素但无选择试剂的固体培养基上培养。接下来，将所接种胚在含有选择性试剂的培养基上培养，并将生长中的转化愈伤组织恢复(步骤4：选择步骤)。将未成熟胚在具有选择性试剂的固体培养基上培养，导致所转化细胞的选择性生长。随后使愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上培养，以再生植物。

实施例5：转化大豆胚

如下用含有与pinII启动子可操作连接的SEQ ID NO：1毒素核苷酸序列的质粒轰击大豆胚。为诱导体细胞胚，将从适当大豆栽培种的表面杀菌的未成熟种子所切割的长3-5mm的子叶在光照或黑暗中于26℃在适当的琼脂培养基培养6-10周。随后切下产生次级胚的体细胞胚，并将其置入合适的液体培养基中。在重复选择如早期、球形期胚倍增的体细胞胚细胞团后，如下维持所述悬浮液。

将大豆胚发生悬浮液培养物在150rpm旋转振摇器上的35mL液体培养基中于26℃维持，所述维持在16:8小时的昼/夜时间表的荧光下进行。通过将约35mg的组织接种至35mL液体培养基，每两周传代培养培养物。

随后通过粒子枪轰击方法(Klein et al.(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利第4,945,050号)，转化大豆胚发生悬浮液培养物。可以将杜邦基因枪PDS1000/HE设备(氦加装)用于这些转化。

可以用于促进大豆转化的可选择标志物基因是由如下所构成的转基因：花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812)、质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz et al.(1983)Gene 25：179-188)的潮霉素磷酸转移酶基因和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA的胭脂碱合酶基因3’区。可以将包含与pinII启动子可操作连接的毒素核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的表达盒作为限制性片段分离。随后可以将该片段插入携带标志物基因的载体的独特限制性位点。

向50μL的60mg/mL 1μm金粒悬浮液(依次)加入5μL DNA(1μg/μL)，20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl₂(2.5M)。随后将该粒制备物振摇3分钟，在微型离心机中旋转10秒，将上清液移除。随后用400μL 70％乙醇将DNA包被的粒子清洗一次，并将其在40μL的无水乙醇中重悬。可以将DNA/粒悬浮液超声破碎3次，每次1秒。随后将5微升DNA包被的金粒上样至每一大载体盘。

将约300-400mg的两周龄悬浮液培养物置于空的60×15mm陪替氏培养皿，并用移液器将残留液体从组织中移除。对每一转化实验，通常轰击约5-10个板的组织。将膜破坏压力设在1100psi，将该室抽真空至28英寸水银真空。在离阻滞筛约3.5英寸远处放置组织，将其轰击三次。在轰击后，将组织切成两半，并将其放回液体，并如上所述进行培养。

在轰击后5-7天，可以用新鲜培养基更换液体培养基，在轰击后11-12天，可以用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基来更换。可以每周更新该选择性培养基。轰击后7-8周，可以观察自未转化的坏死胚性细胞团生长的绿色转化组织。可以移除分离的绿色组织，并将其接种至单个烧瓶，以生成新的、克隆增殖的、转化的胚发生悬浮液培养物。可以将每一新系作为独立的转化事件来处理。随后可以传代培养这些悬浮液，并将其作为未成熟胚的细胞团来维持，或者通过个体体细胞胚的成熟和萌发，将其再生成整体植物。

本申请文件提及的所有出版物、专利和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。通过引用将所有出版物、专利和专利申请并入本文，以达到如同每一单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明为通过引用而并入的程度。

虽然为清楚理解的目的，已经通过说明和实例在一定细节上描述了上文的发明，但是很明显可以在实施方式的范围内实践某些变化和修饰。

Claims (23)

1.分离的核酸分子，选自：

a)包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的核酸分子或其全长互补体；

b)与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核酸分子或其互补体；

c)编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核酸分子；和

d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是设计为在植物中表达的合成序列。

3.DNA构建体，包含如权利要求1所述的核酸分子。

4.如权利要求3所述的DNA构建体，还包含编码异源多肽的核酸分子。

5.宿主细胞，包含如权利要求3所述的DNA构建体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，所述细胞是细菌细胞。

7.如权利要求5所述的宿主细胞，所述细胞是植物细胞。

8.转基因植物，包含如权利要求7所述的宿主细胞。

9.如权利要求8所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。

10.如权利要求9所述的植物的转化的种子，其中所述种子包含所述DNA构建体。

11.具有杀虫活性的分离的多肽，选自

a)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO：2具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽；

c)由SEQ ID NO：1核苷酸序列编码的多肽；和

d)由与SEQ ID NO：1核苷酸序列至少80％一致的核苷酸序列编码的多肽。

12.如权利要求11所述的多肽，还包含异源氨基酸序列。

13.组合物，包含如权利要求11所述的多肽。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物选自粉末、粉剂、小球、颗粒、喷雾剂、乳剂、胶体和溶液。

15.如权利要求13所述的组合物，其中通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞培养物来制备所述组合物。

16.如权利要求13所述的组合物，包括以重量计约1％至约99％的所述多肽。

17.控制鞘翅目害虫群体的方法，包括使所述群体与杀虫有效量的如权利要求11所述的多肽接触。

18.杀死鞘翅目害虫的方法，包括使所述害虫与杀虫有效量的如权利要求11所述的多肽接触，或向所述害虫喂食杀虫有效量的如权利要求11所述的多肽。

19.产生具有杀虫活性的多肽的方法，包括将如权利要求4所述的宿主细胞在表达编码所述多肽的核酸分子的条件下培养，所述多肽选自：

a)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO：2具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽；

c)由SEQ ID NO：1核苷酸序列编码的多肽；和

d)由与SEQ ID NO：1核苷酸序列至少80％一致的核苷酸序列编码的多肽。

20.植物，所述植物使DNA构建体稳定整合至其基因组，所述DNA构建体包含编码具有杀虫活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的核酸分子或其全长互补体；

b)与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核酸分子或其互补体；

c)编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核酸分子；和

d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；

其中所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中表达的启动子可操作连接。

21.如权利要求20所述的植物，其中所述植物是植物细胞。

22.保护植物免于害虫的方法，包括将至少一种包含编码杀虫多肽的核苷酸序列的表达载体引入所述植物或其细胞，其中所述核苷酸序列选自：

a)包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的核酸分子或其全长互补体；

b)与SEQ ID NO：1核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核酸分子或其互补体；

c)编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的核酸分子；和

d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述植物产生具有针对鞘翅目害虫的杀虫活性的杀虫多肽。