CN101949819A - 一种基于图像识别的细胞计数方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于图像识别的细胞计数方法。本发明以计算机视觉的方式，通过传感器将实体切片信息转化为数字图像信息，再经由图像处理完成细胞计数。计数准确率在98％以上，并具备优良的可扩展性，可以对免疫细胞之外的各类细胞进行检测，具备通用性，并可以根据细胞特征对细胞进行分类等等。

Description

一种基于图像识别的细胞计数方法

技术领域

本发明属于医学检验科领域，更具体地说，本发明涉及一种免疫细胞计数方法，即通过对整张玻片进行图像扫描，获取玻片的图像信息，并利用图像识别的方法识别图像中的免疫细胞，从而达到自动计数和形态分析的目的。

背景技术

CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞。由于艾滋病病毒攻击对象是CD4细胞，所以其检测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。正常成人的CD4细胞在每立方毫米500个到1600个，艾滋病病毒感染者的CD4细胞出现进行性或不规则性下降，标志着免疫系统受到严重损害，当CD4细胞小于每立方毫米200个时，可能发生多种机会性感染或肿瘤。

传统的CD4细胞计数，使用流式细胞仪。即以激光为光源，将被检细胞用荧光标记抗体结合后输入流式细胞仪，通过高速流动系统对细胞排列成行，一个一个的流经检测区，当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串均匀的小滴，每滴内最多只含有一个细胞，细胞经荧光探针的光反应和标记物的光散射能力中获取信息，进行计数。这种计数方法的准确率在±50个细胞上下，对于破损细胞、连体细胞，凋亡细胞不能很好地计数，并且无法直观地评估计数结果正确与否。

本发明公开的免疫细胞计数方法，以计算机视觉的方式，通过数字相机将实体切片信息转化为数字图像信息，再经由图像识别的方法完成细胞计数。计数准确率在98％以上，高于传统的流式细胞仪。更重要的是，可以通过对扫描的细胞图像进行复查，并对细胞形态做进一步的分析，这些都是流式细胞仪无法做到的。除了对免疫细胞CD3/CD4/CD8的检查，本发明公开的方法还可以对免疫细胞之外的各类细胞进行检测，具备通用性，并可以根据细胞特征对细胞进行分类等等。

发明内容

为解决传统的流式细胞仪在细胞计数方面的不足，本发明公开了一种基于图像识别的细胞计数方法。

本发明具体采用以下计数方案：

一种基于图像识别的细胞计数方法，所述方法使用全自动数字切片扫描设备对细胞玻片进行扫描，基于对细胞玻片的图像处理分析进行细胞的计数；其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制作方形细胞玻片，将待计数的细胞固定在一方形区域内，并将所述细胞玻片置于所述扫描设备扫描的玻片架上；

(2)通过所述扫描设备对所述细胞玻片进行扫描，采集所述细胞玻片的图像；

(3)根据待计数细胞的形态特征信息，对所述细胞玻片图像中的符合待计数细胞形态标准的细胞进行识别并统计数量。

通过本发明，不仅可实现对细胞准确计数，还可在单细胞水平实现细胞可视化，真正实现目标细胞实体保存、动态影像全记录，帮助科研人员直接洞察细胞数量、功能、状态，为临床疾病诊断提供新手段，这在整个免疫诊疗中具有开创性意义得免疫细胞数字化图片，弥补了流式细胞仪和ELISPOT等不能对细胞进行直接分析的缺陷

附图说明

图1是全自动扫描设备扫描过程的正视图；

图2是全自动扫描设备扫描过程的俯视图；

图3是扫描前进行黑框边角定位的过程；

图4是移动马达自动扫描玻片的过程；

图5是扫描过程采集的图像数据；

图6是细胞计数流程图；

图7是细胞检测流程图。

具体实施方案

下面根据说明书附图并结合优选实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

本发明公开的一种基于图像识别的细胞计数方法，该方法使用全自动数字切片扫描设备对细胞玻片进行扫描，基于对细胞玻片的图像处理分析进行细胞的计数；其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制作细胞玻片，将待计数的细胞固定在一方形区域内，并将所述细胞玻片置于所述扫描设备扫描的玻片架上(如图2所示)；

(2)通过所述扫描设备(如图1所示)电机驱动控制玻片在X/Y/Z三个方向上的移动，经物镜、镜筒、相机组成的光学成像系统，当玻片移动到物镜正下方时，采集所述细胞玻片的图像；

(3)根据待计数细胞的形态特征信息，对所述细胞玻片图像中的符合待计数细胞形态标准的细胞进行识别并统计数量。

免疫细胞玻片在制作时通过黑色油墨将细胞固定在一个黑色的框内，如图3所示。通过在X，Y方向上移动玻片并识别黑框的方法找到黑色框的左上角，以此作为初始扫描点O。

从采集到的图像可以看出，黑框的灰度值非常低，因此可以设置一个固定的二值化阈值，例如50，将图像分成前景点(灰度值＞30)和背景点(灰度值＜30)两个部分。如果在图像左上方存在背景而右下方为前景则说明已经找到黑框的左上角位置。

玻片移动到起始扫描点后，可利用黑框的两条边缘进行自动对焦。自动对焦的过程实际上是使用数字相机连续采集多层玻片图像，通过比较每层图像的清晰度，选择清晰度最高的那一层作为初始焦平面位置。本发明中，称此位置为焦平面A。

这个问题实际上是图像清晰度度量问题。对一幅图像来说，如果上面的目标边缘(在本发明中，所述目标边缘指的是切片组织组织的边缘)非常锐化，看上去就很清晰；如果目标边缘梯度(本发明中的“目标边缘梯度”指的是切片组织组织边缘处的梯度，这个值大，边缘就清晰；反之就模糊)较小，看上去就比较模糊。因此，边缘梯度的度量可以用来评价一幅图像的清晰度差异。目前边缘梯度的度量方法有很多种，这里我们优选用边缘的平方和(S)来度量图像的清晰度。

$S=\underset{(i,j\∈I)}{\mathrm{\Σ}}C{(i,j)}^2$

其中C(i，j)表示图像中第i行j列像素的清晰度。

同时，

I(i，j)为图像中第i行，第j列上的数据灰度值。其中，i和j的取值范围是整幅图像中i行j列中的点。

这样，对采集到的每一幅图像都用上面的公式来计算清晰度，求出来的S最大的图像就是最清晰的焦平面。

如图4所示。以初始扫描点O开始扫描玻片，沿“Z”子形移动玻片可以使得扫描移动距离最小。当玻片从黑框的左上角移动到右下角，这样就完成了一个黑框内细胞图像的扫描过程。

在扫描图像的同时，可以通过图像识别的方法分析细胞图像，找到图像中的免疫细胞。扫描的中间过程图如图5所示，从图中可以明显地看到免疫细胞。

图像识别算法流程图6所示：

提取细胞候选区域(101)：

计算图像中各个点的灰度值，当一个点的灰度值小于整个图像平均灰度值的时候，即判定此点为前景点。通过对整幅图像的遍历，图像中所有像素点被分成前景点和背景点两部分。

区域生长(102)：

对每个步骤101确定的前景点，以其为中心对图像进行区域生长处理，即将相邻的前景点组成一个整体。如果该区域满足免疫细胞的大小范围(这个需事先测量确定)。就把这个区域当做细胞候选区域

细胞检测(103)：

对每一个细胞候选进行分析，判断其是否符合免疫细胞特征。

一般地，免疫细胞具备如下特征：

近似圆形；

细胞中心有亮斑，即细胞液的位置，一个正常细胞的图像中，其细胞液占据一定比例。样本统计数据表明，这个比例不会小于20％；

细胞边缘清晰，即细胞边缘灰度明显高于边缘外背景灰度。当细胞旁有水泡存在时，可能导致细胞边缘不明显；

细胞面积计算结果处于正常细胞大小范围内，10微米～20微米左右。

详细步骤请见后面的细胞检测流程描述。

细胞计数(104)：

对符合待计数细胞特征的每一个细胞候选区域进行统计计数。

其中，上述细胞计数过程又可以由以下步骤组成(如图7所示)。

最亮点检测检测(201)

对一个细胞候选图像，找到靠近细胞中心灰度值最高的那个点。

亮斑区域确定(202)

玻片下方是高亮度的LED光源，而细胞是近似球状的透明物体，细胞中心充满细胞液，对光线形成汇聚效果。这样，细胞中心部分就会形成亮度高于背景的亮斑。以最亮点为中心，由内向外计算像素灰度值，正常状态下细胞图像的灰度值以亮点为中心呈现对称分布。亮斑区域中，像素灰度值应大于背景的平均灰度。因此，以灰度最大亮点为中心向外扩散，灰度高于背景平均灰度的像素都可认为是细胞中心亮斑区域；

确定亮斑边缘(203)

对亮斑区域外缘附近的点进行边缘梯度计算，精确定位亮斑边缘，并依据边缘点的位置，计算亮斑圆度。其中，梯度的计算方法如下：

D＝G_R-1-G_R+1

其中，D表示梯度，G_R-1表示靠近中心的像素点灰度，G_R+1表示远离中心点的像素点灰度。从亮斑中心向外计算每个像素点的梯度，梯度最大的地方就是细胞中心亮斑边缘的位置。

确定细胞边缘(204)

以亮斑为中心，在正常细胞大小范围内，计算梯度的方法如下：

D＝G_R+1-G_R-1

其中，D表示梯度，G_R-1表示靠近中心的像素点灰度，G_R+1表示远离中心点的像素点灰度。从细胞中心亮斑边缘向外计算每个像素点的梯度，梯度最大的地方就是细胞边缘的位置。

精确定位细胞边缘。细胞壁位置的像素灰度大于背景平均灰度。

判断细胞圆度(205)

圆度的计算可以由各个细胞边缘点到细胞中心距离的标准差来定义。设每个细胞边缘点到细胞中心的距离为Si，所有Si的均值为S，那么细胞的圆度可定义为：

$p=1-\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{Si}-\stackrel{\‾}{S})}^2}{n}}$

p的取值范围在0-1之间，p越大表示细胞圆度越好，通常可以认为圆度大于0.9就可以作为细胞候选。

判断细胞对比度(206)

通过计算亮斑区域，和细胞壁环状区域的平均灰度值，可以得到对比度。对比度越大说明细胞形态特征好，在本发明的优选实施例中，例如可以选择对比度大于30作为细胞候选。

当一个细胞具备一定圆度、对比度，例如当细胞圆度大于0.9，并且细胞对比度大于30，作为细胞计数；细胞大小、亮斑和黑环比例正常时，认为其符合细胞特征。各项指标的阈值可以通过统计结果取得。本发明结合说明书附图对优选实施例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于图像识别的细胞计数方法，所述方法使用全自动数字切片扫描设备对细胞玻片进行扫描，基于对细胞玻片的图像处理分析进行细胞的计数；其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制作方形细胞玻片，将待计数的细胞固定在一方形区域内，并将所述细胞玻片置于所述扫描设备扫描的玻片架上；

(2)通过所述扫描设备对所述细胞玻片进行扫描，采集所述细胞玻片的图像；

(3)根据待计数细胞的形态特征信息，对所述细胞玻片图像中的符合待计数细胞形态标准的细胞进行识别并统计数量。

2.根据权利要求1所述的细胞计数方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，优先使用黑色油墨将细胞固定在一个黑色的框内，所述黑色的框形成所述的方形区域。

3.根据权利要求2所述的细胞计数方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，对所述细胞玻片的扫描优选采用以下方式：

在X，Y轴方向移动玻片识别所述黑色的框的一角，以该角作为玻片的起始扫描点，其中所述X，Y轴方向分别为在所述方形细胞玻片平面上两相邻垂直边的方向，Z轴方向为该玻片平面的垂直方向；

将所述玻片移动到起始扫描点后，所述扫描设备自动对焦，选择图像清晰度最高的初始焦平面；

以所述起始扫描点开始扫描玻片，移动玻片，一直扫描到所述所述黑色框的一角的对角处，完成所述玻片方形区域内细胞图像的扫描。

4.根据权利要求3所述的细胞计数方法，其特征在于：从初始扫描点开始对所述细胞玻片扫描时，优选沿“Z”字形在X、Y轴平面内移动玻片，以使得扫描移动距离最小。

5.根据权利要求1所述的细胞计数方法，其特征在于，在所述步骤(3)的细胞计数中，进一步包括以下内容：

提取细胞候选区域(101)：

计算所述细胞玻片图像中各个像素点的灰度值，当一个点的灰度值小于整个图像平均灰度值的时候，即判定此点为前景点，否则为背景点，通过对整幅图像的遍历，图像中所有像素点被分成前景点和背景点两部分；

区域生长(102)：

对确定的前景点，以其为中心对所述细胞玻片图像进行区域生长处理，即将相邻的前景点组成一个整体，如果该区域前景点的像素数满足免疫细胞的大小范围，就把这个区域当作细胞候选区域；

细胞检测(103)：

对每一个细胞候选区域进行分析，判断其是否符合待计数细胞的形态特征；

细胞计数(104)：

对符合待计数细胞特征的每一个细胞候选区域进行统计计数。

6.根据权利要求5所述的细胞计数方法，其特征在于，在所述细胞检测中，进一步优选通过以下方式判断其是否符合待计数细胞的形态特征：

中心亮斑检测(201)

对一个细胞候选区域，找到靠近细胞中心灰度值最高的那个点；

亮斑区域确定(202)

以最亮点为中心，由内向外计算像素灰度值，亮斑区域中，像素灰度值大于背景的平均灰度值；

确定亮斑边缘(203)

对亮斑区域外缘附近的点进行边缘梯度计算，即计算从亮斑中心沿半径方向的梯度，梯度最大的地方就定位成亮斑边缘，并依据边缘点的位置，计算亮斑圆度；

确定细胞边缘(204)

以亮斑为中心，在正常细胞大小范围内，计算从细胞中心沿半径方向的梯度，梯度最大的地方就定位成细胞外边缘，细胞壁位置的像素灰度大于背景平均灰度；

判断细胞圆度(205)

圆度的计算可以由各个细胞边缘点到细胞中心距离的标准差来定义，设每个细胞边缘点到细胞中心的距离为Si，所有Si的均值为

那么细胞的圆度可定义为：

$p=1-\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{Si}-\stackrel{\‾}{S})}^2}{n}}$

p的取值范围在0-1之间，p越大表示细胞圆度越好；

判断细胞对比度(206)

通过计算亮斑区域，和细胞壁环状区域的平均灰度值，得到细胞对比度；

当细胞圆度大于0.9，并且细胞对比度大于30，作为细胞计数。

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