CN109478230A - 通过分割概览图像来检查分布式对象的方法 - Google Patents
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Abstract
通过使用分布有多个分布式对象(1)的区域(2)的概览图像(200)来检查多个分布式对象(1)的方法，其中，借助于关于概览图像(200)的像素(201)的强度值(202)在预定阈值(208)的近侧或远侧对强度值(202)进行分类(202a，202b)，将概览图像(200)转换(110)为二值图像(210)；针对小于对象(1)的结构(219)清理(120)二值图像(210)，使得产生清理后的图像(220)；并且使清理后的图像(220)在形态上闭合(130)，使得产生二值对象掩模(230)，该二值对象掩模(230)指示区域(2)中的哪些位置属于对象(1)以及区域(2)中的哪些位置属于无对象。一种计算机程序产品，其包括具有指令的机器可读程序，当该程序在计算机上执行时，所述指令使计算机和与该计算机连接的任何测量设备执行根据本发明的方法。
Description
本发明涉及用于检查统计分布在区域中的对象的方法。
背景技术
在检查生物样品时，研究各个细胞的属性是必要的。这些样品通常包括基板上细胞的统计分布。在可以检查细胞之前，必须首先将细胞定位在基板上。
到目前为止，细胞已经在视觉上定位，并且已经手动启动了单个细胞的局部检查，例如拉曼光谱(Raman spectroscopy)。这是非常耗时的并且导致下述事实：能够检查仅少量细胞。检查的细胞越多，获得的结果的统计容量越好。
根据(R.Ali,M.Gooding、T.Szilgyi、B.Vojnovic、M.Christlieb、M.Brady的“Automatic segmentation of adherent biological cell boundaries and nucleifrom brightfield microscopy images”,Machine Vision and Applications 23(4),607-621,doi:10.1007/s00138-011-0337-9(2011))，根据(F.Buggenthin、C.Marr、M.Schwarzfischer、P.S.Hoppe、O.Hilsenbeck、T.Schroeder、F.J.Theis的“An automaticmethod for robust and fast cell imaging in bright field images from high-throughput microscopy”,BMC Bioinformatics 14,297-308(2013))和(C.Zhang、J.Yarkony、FA Hamprecht的Cell Detection and Segmentation Using CorrelationClustering,Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention-MICCAI2014,Lecutre Notes in Computer Science 8673,9-16(2014))，已知用于在基板上定位细胞的各种方法。
问题和解决方案
本发明的目的是进一步开发上述方法，并且从而改进对多个分布式对象的检查。
该目的通过根据主权利要求的根据本发明的方法和通过根据从属权利要求的计算机程序产品来实现。根据从属权利要求，其他有利的实施方式将是明显的。
发明内容
在本发明的范围内，已经开发了一种使用分布有多个分布式对象的区域的概览图像来检查多个分布式对象的方法。
例如，该区域可以位于对象被应用于的基板上。例如，对象可以是例如溶液中或作为溶剂中的悬浮液的、应用在基板上的生物细胞，特别是真核细胞。在这样做时，细胞可以粘附到基板上，即与基板结合，或者将仅通过弱的物理力在基板上保持就位从而保持与基板分开的单元。可选地，还可以通过对基板施加涂层来调整如何将细胞粘合到基板上。例如，聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸涂层可以使细胞不粘附到基板上和/或使细胞保持在基板上的特定位置处，尽管细胞不会粘附到那里。
另一方面，对象不一定必须具有生物学性质。例如，对象也可以是例如利用过滤器或粘性膜收集的灰尘颗粒。
概览图像有利地是其中分布有对象的整个区域被并行捕获并显示的图像。特别地，概览图像可以是该区域的显微明场图像。这样的图像容易获得，并且成像不影响对象本身或对象在该区域中的位置。然而，在原则上，也可以通过任何其他方法来获得概览图像，例如通过荧光显微镜或扫描探针显微镜来获得概览图像。然后仅选择操作参数，使得对象基本保持不变并且不改变对象在该区域中的位置。
特别地，概览图像可以是灰度图像，在该灰度图像中，每个像素被分配刚好一个强度值。然而，概览图像也可以是例如彩色图像。彩色图像可以被理解为多个通道的聚合，其中，类似于灰度图像，每个通道的特定属性在像素之间变化。例如，彩色图像可以是多个子图像的叠加，每个子图像与诸如RGB彩色图像中的红色、绿色和蓝色或CMYK彩色图像中的青色、品红色、黄色和黑色的基色相关联。在HSV颜色空间中存在三个子图像，这三个子图像描述类似于灰度图像的三个属性颜色值(色调)、饱和度(饱和度)和亮度值(值)的空间分布。为了进一步检查，现在可以在每种情况下使用这些子图像中的单个子图像或几个或所有子图像到灰度图像的计算。不失一般性，下面假设存在灰度图像。
对象可以以任何浓度分布在区域内。有意义的浓度取决于特定应用。例如，在生物细胞中可能的病理变化的检查中，重要的是单独地检查细胞。如果细胞的浓度仅大到使得该区域中的至少大部分细胞仍然可以清楚地彼此区分开，则是有意义的。另一方面，例如，如果为了寻找石棉而检查灰尘颗粒，则发生颗粒聚集就不太重要。
特别地，对象的分布可以是统计的。然而，分布也可以是例如自组织的，或者例如对象也可以全部或部分地布置在基板上的限定位置处，这些位置先前已经在基板上相应地构造。
根据本发明，首先通过关于概览图像的像素的强度值在该侧还是超出预定阈值对强度值进行分类来将概览图像转换为二值图像。因此，二值图像根据每个像素属于两个类“该侧”或“超出”中的哪一类来给每个像素分配两个可能值0或1中的每一个。例如，不受一般性限制，“该侧”可以表示“小于或等于阈值”并且被分配值0，而“超出”可以表示“大于阈值”并且被分配值1。
二值图像是关于对象在哪里的第一线索。例如，为了确定对象的轮廓并且因此例如确定相关联的中心，二值图像并不足够。因此，由于离散化为仅两个类，因此直接从二值图像所取的轮廓通常具有间隙。这些间隙利用称为“闭合”的形态上闭合的数学运算来闭合。这创建了二值对象掩模，该二值对象掩模指示概览图像中描绘的区域的哪些位置属于对象以及该区域的哪些位置不属于任何对象，而是可以分配给空基板表面。
然而，真实生活中的概览图像通常不存在例如基于噪声的误差或伪像。这种误差和伪像会创建比对象小的结构。如果形态上闭合被应用到这些结构，则它们可以生长到与所寻找对象相当的尺寸。二值对象掩模中的误差和伪像将不再可以与真实对象区分开。
为了避免这种情况，根据本发明，针对小于对象的结构清理二值图像，使得产生清理后的图像。只有该清理后的图像才会进一步被处理成二值对象掩模。因此，在生成二值图像之后，为了将这些对象与误差和伪像区分开，利用关于所寻找的对象至少具有哪种尺寸的附加信息。发明人已经认识到，此时在该过程中考虑这些附加信息是最有效的并且允许特别可靠的区分。因此，所获得的二值对象掩模是在概览图像中映射的区域的哪些位置属于对象的特别可靠的指示符。
当二值对象掩模用于确定在哪些位置时，例如采集拉曼光谱时，清理尤其重要。清理之前的扰动和伪像的数目通常比待检查的对象的数目高许多倍。如果这些扰动和伪像被错误地识别为对象，则可以记录多个不相关的拉曼光谱。这不仅花费了不必要的时间，而且使光谱的统计分析变得复杂或者甚至使得该分析变得不可能。
从二值对象掩模中已经可以导出关于对象的许多信息。例如，可以从二值对象掩模中观察到对象的精确大小和形状。此外，根据属于对象的位置(像素)的比例，该区域中的对象的浓度变得明显。然而，二值对象掩模也可以用作初步产品，以确定正在被执行进一步检查的那些位置。
为了限定预定阈值，在发明人的试验中发现三种方法特别有利和可靠。所有三种方法都基于对概览图像的像素的强度值的直方图的评估。这些强度值通常被离散为一定数目的可能值，例如，对于8位分辨率为从0到255的整数值，而对于16位分辨率为从0到65535的整数值。
根据第一种方法，阈值被设定成使得阈值位于概览图像的像素(201a)的在阈值以下的所有强度值的第一平均值m0与概览图像的像素的高于阈值的所有强度值的第二平均值m1之间的中点。这可以被理解为阈值的自洽条件，因为平均值m0和m1又取决于阈值。该方法的优点特别是在显微明场图像作为概览图像的情况下在于：光照条件对最终获得的二值对象掩模具有特别低的影响。
例如，可以通过测试对于阈值的所有可能的离散值满足自洽条件的程度来确定正确的阈值。选择该条件被最佳满足的阈值。为此所需的计算时间取决于概览图像的强度值被离散化的精细程度，因为许多阈值是可能的，因为存在可能的强度值。如果强度值被非常精细地离散化，则使用满足自洽条件作为质量度量的优化算法也可以用作测试所有可能值的替选方案。
根据第二种方法，阈值被设定成使得利用概览图像的像素的在阈值以下的所有强度值的数目进行加权的在阈值以下的所有强度值的第一方差与利用概览图像的像素的高于阈值的所有强度值的数目进行加权的高于阈值的所有强度值的第二方差之和被最小化。如果ω0，1(s)是取决于使像素的强度值属于类0或1的阈值的值s的概率，并且如果是这些类中的像素的方差，其中该方差也取决于阈值的值s，则加权和由下式给出：
即使使该加权和最小化是自洽条件，因为哪些强度值高于或在阈值以下在每种情况下同样取决于阈值。在这种情况下，由实验确定的概览图像的典型形状启示的基本假设是，在概览图像中，在一方面的对象与另一方面的属于无对象的区域之间建立最大对比度，而在对此进行测量时，每个分开进行的测量的属于无对象的区域以及对象是相对均匀的。因此，类内方差的最小化是貌似合理的指示符，其中在概览图像中表示的由概览图像的像素表示的位置被有用地划分为两个类“对象”和“无对象”。
根据Otsu的工作，这个条件等同于以下事实：使一方面的在阈值以下的强度值与另一方面的高于阈值的强度值之间的类间方差最大化。类间方差由下式给出：
式中——类似于第一种方法——m0(s)和m1(s)也是取决于阈值的值s的类平均值。可以用比两个类内方差之和更少的计算量来确定类间方差。
根据第三种方法，阈值被设定成使得二值图像的至少一个统计矩与概览图像的对应统计矩的匹配最大化。例如，该统计矩可以是平均值或方差。与第二种方法类似，该方法基于以下基本假设：概览图像中的对比度应基本上出现在对象与属于无对象的区域之间，而对象本身以及属于无对象的区域分别应该是相对均匀的。因此，理想的概览图像应该近似为可以直接用作二值对象掩模的二值图像。真实的概览图像被认为是通过成像处理被模糊(褪色)的这种理想的二值概览图像的版本，其中模糊对统计矩没有影响。因此，通过将统计矩选择为守恒量，不会改变关于对象与属于无对象的区域之间的区别的信息内容，而是使其更清楚。因此，如果概览图像仅具有低对比度，则第三种方法特别有利。
所有三种方法也可以结合使用，和/或对于阈值的确定值s可以用于针对彼此偏移到应用到二值图像的一个总值。
在本发明的特别有利的实施方式中，通过利用基本上去除对象的强度进行模糊来从概览图获得背景估计，并且在转换成二值图像之前用其与背景估计的差异替换概览图像。以这种方式，进一步抑制了不均匀照射对最终获得的二值对象掩模的影响。因此，在形成差异图像之后，所有进一步的操作然后仅从该差异图像开始而不再从原始概览图像开始。
可替选地或结合地，可以通过记录无对象的第二概览图像来获得背景估计。然后可以将背景估计作为背景图像。然后例如可以将该背景图像的每个像素归一化为背景图像的最大强度。然后可以在通过归一化背景估计转换成二值图像之前逐点划分概览图像。
在本发明的另一个特别有利的实施方式中，相邻对象的至少一个公共边界被分裂成二值对象掩模中的第一对象的第一边界和第二对象的第二边界。以这种方式，即使概览图像中成像的区域中的对象的浓度太高以至于对象被聚结，也可以分别识别和研究对象。出于此目的，例如，可以使用分水岭变换，分水岭变换将二值对象掩模的像素值0和1解释为高度信息，并且在连续的“泛洪”中，详细说明相邻对象之间的分水岭。
有利地是，根据二值对象掩模评估至少一个对象的中心点。这个点对于对象的许多进一步检查很重要。
在本发明的另一个特别有利的实施方式中，利用光束照射区域中的、根据二值对象掩模对象被定位的至少一个位置，并且评估对象对照射的反应。在这种情况下，光束可以特别是激光束。利用光束的检查是非侵入性的并且可以以高空间分辨率执行，直到所使用的光束的衍射极限。如果需要，可以通过使用近场光来规避衍射极限。
相反，光束也可以被加宽，使得照射整个对象。在此特别有利的是，选择对象的中心作为光束位置的中心。为了防止边缘效应，例如，通过叠加几种模式(“模式加扰”)，可以均匀化光束的强度分布。可替选地或结合地，光束可以被进一步加宽，使得其光束轮廓的照射对象的那部分近似均匀。这又是以牺牲强度为代价的。
在本发明的另一个特别有利的实施方式中，借助于二值对象掩模相对于对象来扫描光束。扫描可以通过相对于对象移动激光束、相对于激光束移动对象或者通过移动激光束和对象两者来完成。
考虑到光束的空间强度分布，扫描的定时程序被选择为使得在对象上总接收光剂量的空间分布均匀化。例如，激光束在第一近似中具有横跨其光束横截面的高斯光束轮廓。如果该光束以对象的中心为中心，则对象以不均匀的强度照射。如果对象没有被均匀地构造，而是例如在中间具有与在边缘处不同的材料成分，则在对由对象所接收的照射的反应中，由于不均匀的照射强度，该材料对比度叠加有伪像。这尤其在作为对象的真核生物细胞中发生，该真核生物细胞中，细胞核由与细胞其余部分不同的材料构成。通过定时程序有利地使这种伪像最小化，该定时程序使在对象上接收的光剂量均匀化。
在本发明的特别有利的实施方式中，根据对照射的反应来评估对象的至少一个拉曼光谱。在拉曼散射中，光子在分子上非弹性地散射，使得能量在光子与分子的激发态之间交换。由于这些激发态是每个分子的特征，因此拉曼散射提供了被照射区域的、分子特定“指纹”。因此，特别是在生物样品的细胞——例如可能由癌症引起的细胞——中，可以使病理变化可见。
拉曼光谱与二值对象掩模的提取的结合使得可以使在生物样品的各种细胞上的拉曼筛选自动操作。到目前为止，这些检查只能对样品的少许细胞执行，因为在可以在下一个关注细胞处记录下一个拉曼光谱之前必须重复记录拉曼光谱，并且然后必须相对于激发激光的焦点手动移动样品。通常，在这样的研究中检查显著少于100个细胞。通过使连续检查概览图像中可见的所有细胞变得切实可行，可以对100,000个或更多个细胞执行检查。
然后，检查的结果在统计上更具复原力，并且由于人员减少，检查更便宜。甚至可以进行一些检查，从而有增加的吞吐量。例如，如果使用统计方法将细胞划分成不同的类，则分类变得越可靠，可以检查的细胞越多。特别地，统计分类方法的可靠性在很大程度上取决于在该方法的训练阶段检查了多少细胞。例如，可以根据细胞类型或者它们是健康细胞还是肿瘤细胞来对细胞进行分类。例如，也可以制作白细胞的血象。
如果要检测到例如每1,000个或每10,000个细胞中仅在一个细胞处发生的罕见的变化，则根据本发明增加的吞吐量也是必要的，以能够做出关于在生物样品中是否存在具体变化的可靠的声明。
另外，可以从细胞获得其他信息，例如蛋白质、核酸和脂质的相对含量或甚至细胞周期的当前状态。
同时，快速临床试验是可能的，因为从一个细胞到下一个细胞的变化率不受人类反应时间的限制。根据本发明的被布置用于执行该方法的分析器可以继续全自动地工作而无需手动检查图像或设置参数，并且因此可以在没有先验知识的情况下由工作人员在临床领域中操作。所需要的只是：细胞必须被置于合适的载玻片上，并且必须将载玻片递送到装置。
作为基板的载玻片本身不需要根据先前的检查修改。例如，载玻片可以由玻璃、石英或CaF2制成。
当然，一旦已经检查了二值对象掩模中识别的所有对象，就可以利用新区域自动重复该过程。例如，可以连续检查较大生物样品上的在尺寸上与概览图像的空间覆盖区域相对应的区域。根据概览图像，可以以所描述的方式在每种情况下获得二值对象掩模，并且在该二值对象掩模中识别的所有对象(细胞)可以自动地进入激发激光的焦点中并依次检查。
对于接收拉曼光谱，可替选地或结合地，例如，材料样品也可以由激光束从对象上蒸发并且被馈送到质谱仪。以这种方式，可以元素特定地分析对象的材料。
在本发明的另一个特别有利的实施方式中，基板上的细胞暴露于影响之下并且用光束反复照射。在每种情况下，评估细胞对照射的反应。
例如，可以研究在化学物质、同位素或对分子振动模式有影响的其他物质的掺入、以及电离辐射或营养物减少、或基板上存在的各种细胞类型之间的相互作用的影响下细胞的发育。然而，例如，可以研究在细胞培养基、环境温度或升高的孵化温度的影响下的自然过程，例如生长和增殖过程。此外，可以研究由孵化气体的成分诱导的细胞的变化。
已经认识到，本发明提供的以自动方式分析基板上的分布式细胞的能力如此大地降低了测量不确定性，使得可以有足够的统计学意义地确定源自对照射的反应的对细胞的影响的作用。在现有技术中，必须为每次测量手动定位分布式细胞，并且然后必须为每个细胞手动触发局部照射。一方面，这是非常劳动密集型的，使得检查的统计基础中包含的细胞数目从开始就受到限制。到目前为止，总是检查统计学上细胞的显著数目，例如，在对白细胞或显著更多的其他细胞群中的少量存在的细胞的检查中的诸如检测现有的细胞群的各种检查第一次成为可能。此外，所描述的方法允许快速分析细胞过程，该细胞过程非常快速地发生，并且因此仅有非常短的时间窗口可以用于测量。另一方面，手动执行检查的可重复性是有限的。有许多生物过程也在相对缓慢地运行，使得在暴露于不同剂量的影响之后在基板上执行的两次检查之间可以是数小时或数天。在现有技术中，手动执行的测量的实验变化通常大于由于对细胞的影响引起的对照射的反应的变化。当在切换操作中工作时，波动甚至变得更大，并且操作员在各次测量之间改变。另一方面，到目前为止，没有实验可以以很长的时间尺度执行，例如数天甚至数周，因为用户不可能在如此长的时间段内手动跟踪大量的细胞并且在该时间段内观察这些细胞。
到目前为止能够自动重新定位并且检查细胞，例如，可以在始终相同的实验条件下以固定的时间间隔全天候地重复检查。
这同样适用于本发明的另一个特别有利的实施方式，在该实施方式中，利用光束照射多个基板上的细胞，其中，跨基板将细胞对照射的反应结合起来。此处，在手动执行测试程序时增加了进一步的不确定性，因为，例如，每次在安装新基板之后，显微镜被稍有不同地清理。
在本发明的另一个特别有利的实施方式中，利用多变量分析关于细胞的哪些属性在所施加的影响下以统计学上显著的方式变化以及/或者从一个基板到另一个基板以统计学上显著的方式变化来评估全部反应。特别地，此处可以确定高光谱量值，即，可以自动确定细胞的哪些属性以相关联方式变化。多变量分析特别地可以在没有先验假设(“无指导”)的情况下执行。
在多变量分析中，为了最终合并部分结果，部分结果决不是在每个基板上单独确定的。相反，分析是在一次操作中对从所有基板上的细胞获得的所有反应执行的。为了不稀释分析的结果，重要的是，在相同的实验条件下获得所有反应。因此，通过本发明使其成为可能的检查各种细胞的机械化使得多变量分析首先是有意义的。
这种分析的结果可以是，例如，细胞在药理学物质的持续作用下经历某些可测量的变化，其中，这些变化随时间线性或非线性地进展，但是药理学物质的浓度越大，变化就越快。那么相反，例如，以这种相关联方式变化的细胞特征可以被认为是细胞凋亡或坏死发生的早期标志。然而，也可以考虑将以不同浓度存在的物质掺入细胞中，并且得出关于这些物质的动力学属性和细胞动力学的结论。这些可以是同位素标记的分子或其他生物化学物质，例如脂肪酸和蛋白质。这些变化可能导致关于细胞吸收动力学的结论。
有利地是，选择主成分分析PCA作为多变量分析。此处，例如，后方交会模型中的响应于照射而获得的拉曼光谱可以被视为几个部分光谱的加权叠加，每个部分光谱由不同的贡献(“装载”)产生。PCA最终将原始数据转换为坐标系，该坐标系的维度被简化为线性独立的主要成分，并且因此导致原始数据的强压缩。可替选地或与其结合，可以使用最小二乘拟合将纯成分的光谱拟合到测量的光谱。
在本发明的另一个特别有利的实施方式中，根据多变量分析来评估分类器，该分类器对在另一基板上的细胞处接收的照射的反应分配适用于该基板的属性的至少一个值。
例如，通过检查具有来自不同癌症患者的细胞的各种基板结合关于在去除该细胞后患者已经存活多长时间的信息，该存活时间可以作为疾病严重性的指示。然后，根据多变量分析，例如可以评估分类器，该分类器首先一定概率地将是否存在癌症的属性分配给另一基板上的细胞，并且可能分配例如在1至5范围的类别中的严重性。然而，也可以利用该方法分析血液的成分以及血液中细胞类型的比例的变化。此外，该方法可以用于确定不同药理学物质对患者细胞的影响，例如，在用于患者的个性化药物的意义上确定正确的治疗剂。关于药理学物质对细胞的影响的分析，还可以确定高于其则物质对细胞具有毒性作用的浓度。这种方式可以指定物质有效性的阈值。然而，所提出的方法还使得可以分析外部添加物质或在生物过程发生中出现的物质的累积。所提出的方法还使得可以在诸如温度、细胞培养基的成分等不同的影响因素下检测细胞中物质的累积。
例如，可以通过线性判别分析LDA或支持向量机SVM来评估分类器。还可以进行多变量回归研究。此外，还可以使用最小二乘拟合确定基板上的先前明确定义的一种或更多种物质的存在或改变。
在每种情况下，可以以有机的方式将结果与已经施加在细胞上的影响相关联。
本发明还涉及一种具有机器可读程序的计算机程序产品。当程序在计算机上执行时，使得计算机和与该计算机连接的任何测量设备执行根据本发明的方法。这样的计算机程序产品可以特别地用于自动化现有的测量站，在该测量站上手动评估先前的概览图像，并且随后在该测量站上手动触发各个细胞处的拉曼光谱的记录。因此，该测量站的吞吐量可以按数量级增加，这在手动处理中会是不现实的。
附图说明
下面将参照附图说明本发明的主题，而本发明的主题不限于此。附图中示出：
图1：根据本发明的方法的实施方式。
图2：用于自动确定阈值208的示例性实施方式。
图3：相邻对象1a、1b的共同边界1c的分裂240的草图。
图4：利用激光4对对象1的照射160以及对拉曼光谱6的反应5的评估170。
图5：通过根据基于其光束轮廓4a的定时程序来扫描165激光束4对由对象1接收的总光剂量进行的均匀化。
图6：位于不同基板10至12上的对象1对照射160的反应5的跨基板合并190。
图7：用于确定相关属性21至22、分类器30的评估194和该分类器30的应用195的多变量分析192。
图1概览了根据本发明的方法的实施方式的顺序。在基板10上，应用多个细胞作为对象1。为了清楚起见，下面这些对象1的图示也将由相同附图标记1表示。
该方法从分布有对象1的区域2的概览图像200开始。概览图像200被细分为像素201，每个像素201被分配有强度值202。在概览图像200中，对象1出现在背景3上。首先在第一步骤105中通过模糊来从该概览图像200获得背景3的估计205。该估计205可以可替选地或结合地从无对象1的第二概览图像200a获得。在下一步骤106中利用背景估计205通过减法或通过逐点划分对原始概览图像200进行偏移。
根据对象1的对比度显著增加的结果，在下一步骤110中获得二值图像210。在该二值图像210中，不再有强度等级，而是仅有两个值0和1。该离散化最初具有下述结果：在二值图像210中出现对象1的表示中的间隙218。此外，还根据图像记录的误差和伪像生成小于对象1的结构219。
为了使进一步处理中的结构219不会以被误解为另外的对象1的方式生长并且生长到一起，在下一步骤120中，通过这些结构219清理二值图像210。生成清理后的图像220。
在下一步骤130中，使该清理后的图像220在形态学上闭合。在得到的二值对象掩模230中，对象1显示为实心区域。如果这些表面彼此邻接，则可以在另一个可选步骤140中将这些表面彼此分离。在另一个可选步骤150中，还可以评估对象的中心点。
图2通过示例的方式示出了对概览图像200的像素201的强度值202的直方图的评估。概览图像200中的像素201的携带强度值i的出现频率h(i)被绘制在每个可能的强度值i上方。用于将像素201分成两个类别“属于对象1”和“不属于对象1”的阈值208的值s位于在值s以下的那些强度值202a的第一平均值m0与高于值s的那些强度值202b的第二平均值m1之间的中点。平均值m0和m1两者又取决于阈值208的值s。因此，值s是自洽的，以便例如通过测试最小和最大的可能强度值202之间的所有可能的离散值来确定，和/或利用使用自洽条件的满足的优化算法作为质量的度量。
图3示出了步骤240，在步骤240中，将二值对象掩模230中的两个相邻对象1a和1b彼此分开。为了清楚起见，图3中的对象1a和1b不被绘制成实心区域，而是仅示出其轮廓。另外，绘制了在可选的步骤250中确定的中心点250a和250b。
对象1a和1b沿线1c彼此邻接。该公共边界1c被分裂成间隔开的第一对象1a的第一边界1d和第二对象1b的第二边界1e。在以这种方式适配的二值对象掩模230中，对象1a和1b的轮廓不再接触，而是存在至少一个像素的间隙。在二值对象掩模230的进一步使用中，两个对象1a和1b因此被正确地识别为单独的对象1。
图4示出了对对象1的进一步检查，对象1已经通过分布有对象1的区域2中的二值对象掩模230进行了定位。在第一步骤160中，利用激光束4照射对象1。这在图4所示的示例性实施方式中实现为：分布有对象1的基板10经由利用相关联的定位台160a的X-Y-定位控制来移动，使得从物镜41射出的激光束4撞击先前识别的对象1。
这样做时，是物镜41还是基板10被移动，对于许多应用都没有区别。然而，如果要在对象1上检查拉曼散射，则激光束4应尽可能精确地在光轴上从物镜射出，是因为否则色差(“空间反应”)可能会使测量结果失真。则有利的是保持激光束4被精确地调节到物镜41的光轴并且替代地移动基板10。原则上，也可以将激光器和物镜41作为一个单元一起移动，使得激光束4不会离开物镜41的光轴。然而，这更复杂，因为特别是具有较高功率的激光器比基板10重得多并且体积更大。
在第二步骤170中，评估对象1的反应5，在这种情况下是拉曼散射光。结果是对象1的分子特定拉曼光谱6。绘制相对于波数k的强度I。
可选地，根据步骤180，可以对对象1施加影响20。例如，如果对象1是细胞，则对象1可能被暴露于例如物质、温度、照射或营养缺乏之下。例如，相对慢作用的影响20可以继续起作用，并且同时可以利用步骤160和170重复检查基板10上的对象1。例如，施加更快作用的影响20可以与根据步骤160和170的检查交替进行。
图5示出了根据基于激光束4的强度分布4a的定时程序的激光束4的扫描165。该示图中的对象1是基板10上的长形的扩展结构。类似于图4，再次进行扫描165，在扫描时基板10在定位台165a上移动。从物镜41射出的激光束4具有光束轮廓4a，光束轮廓4a在第一近似中是高斯分布的。如果物镜41以及还有激光束4保持在一个位置，则不会照射整个对象1。即使焦点宽到足以完全捕获对象1，对象1的各个区域也将被非常不同地照射。结合对象1内的材料对比度可能会导致对象1的检查中的伪像。扫描165补偿光束轮廓4a的影响，并且因此避免伪像。
原则上，激光束4的光束轮廓4a还可以通过扩展激光束4和/或通过叠加几种模式(“模式加扰”)来均匀化。然而，使用高斯光束提供的优点是，可以使用共焦成像技术，特别是还可以创建对象1的深度轮廓。
图6示意性地示出了在多个基板10至12处获得的信息的结合。图6a示出了三个基板10、11和12，这三个基板分别包含例如从不同的血液样品中获取的或者已经暴露于不同的物质之下的对象1的不同分布。
根据图6b，在步骤160之后首先用光4照射第一基板10上的对象1，并且在步骤170之后评估对照射160的反应5。在步骤190中，合并从所有对象1获得的反应5。
根据图6c，现在以类似的方式检查第二基板11上的对象1，并且在步骤190中将获得的反应5与先前获得的反应5结合，在图6c中以与图6b相比反应5的增加的水平来指示。
根据图6d，现在还检查第三基板12上的对象1，并且在步骤190中将获得的反应5与到目前为止获得的所有反应5结合。图6d以与图6c相比再次增加的反应5的水平示出。
图7示意性地示出了通过重复执行步骤190而对从所有三个基板10至12上的对象1收集的反应5的进一步评估。
在步骤192中，通过多变量分析来评估反应5。该分析的结果是，若干属性与施加在基板10至12上的影响20相关联，或者以其他方式与将分别被检查的对象1从属于基板10至12中的一个相关联，在图7中以示例的方式描绘了若干属性中的两个属性21和22。
根据步骤194，通过进一步评估在步骤192中获得的多变量分析，获得分类器30。借助于分类器30，可以分析另外的基板13上的对象1。类似于图6b至6d获得的这些对象1对照射160的反应5提供了来自图7所示的示例中的分类器30的声明，即基板13上的对象1的属性21的值等于x。同样地，分类器30可以提供例如以下声明：基板13上的对象1与基板10上的对象1最相似，但是与基板11上的对象1最不相似。
附图标记列表
1、1a、1b 对象
1c 相邻对象1a、1b之间的边界
1d 对象1a的新边界
1e 对象1b的新边界
2 对象1分布的区域
3 背景
4 光束
4a 光束4的强度分布
5 对象1对光束的反应
6 拉曼光谱
10-13 基板
20 影响
30 分类器
41 物镜
105 获得背景3的估计205
106 估计205的计算和概览画面200
108 阈值208的定义
110 二值图像210的生成
120 清理二值图像210
130 形态上闭合
140 分裂边界1d和1e中的公共边界1c
150 评估中心点250a、250b
160 利用光束4照射对象1
160a 用于照射160的定位台
165 扫描光束4
165a 用于扫描165的定位台
170 对象1对光束4的反应5的评估
180 对对象1施加影响20
190 反应5的跨基板合并
192 多变量分析
194 分类器30的评估
195 由分类器30分配属性
200 区域2的概览图
200a 无对象1的区域2的第二概览图像
201 像素200的概览图像
202 像素201的强度值
202a 在阈值208的该侧上的强度值202
202b 超出阈值208的强度值202
205 背景3的估计
208 阈值
210 二值图像
218 二值图像210中的对象1的轮廓中的间隙
219 二值图像210中的小于对象1的结构
220 清理后的图
230 二值对象掩模
250a、250b 对象1a、1b的中心点
h(i) 像素201中的强度值i的频率
i 强度值
I 强度
k 波数
m0 强度值202a的第一平均值
m1 强度值202b的第二平均值
s 阈值208的值
Claims (20)
1.一种使用分布有多个分布式对象(1)的区域(2)的概览图像(200)来检查所述多个分布式对象(1)的方法，其特征在于，
通过关于所述概览图像(200)的像素(201)的强度值(202)是在这一侧还是超出预定阈值(208)对强度值(202)进行分类(202a，202b)，将所述概览图像(200)转换(110)为二值图像(210)；
针对小于所述对象(1)的结构(219)清理(120)所述二值图像(210)，使得产生清理后的图像(220)；以及
使所述清理后的图像(220)在形态上闭合(130)，以形成二值对象掩模(230)，所述二值对象掩模(230)指示所述区域(2)的哪些位置属于对象(1)以及所述区域(2)的哪些位置属于无对象。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阈值(208)被设置(108)成使得所述阈值(208)位于所述概览图像(200)的像素(201a)的在所述阈值(208)以下的所有强度值(202a)的第一平均值m0与所述概览图像(200)的像素(201b)的高于所述阈值(208)的所有强度值(202b)的第二平均值m1之间的中点。
3.根据权利要求1至2中的一项所述的方法，其特征在于，所述阈值(208)被确定(108)成使得
利用所述概览图像(200)的像素(201a)的在所述阈值(208)以下的所有强度值(202a)的数目进行加权的在所述阈值(208)以下的所有强度值(202a)的第一方差与利用所述概览图像(200)的像素(201b)的高于所述阈值(208)的所有强度值(202b)的数目进行加权的高于所述阈值(208)的所有强度值(202b)的第二方差之和被最小化，以及/或者
一方面的在所述阈值(208)以下的强度值(202a)与另一方面的高于所述阈值(208)的强度值(202b)之间的类间方差被最大化。
4.根据权利要求1至3中的一项所述的方法，其特征在于，所述阈值(208)被设置(108)成使得所述二值图像(210)的至少一个统计矩与所述概览图像(200)的对应统计矩的一致性被最大化。
5.根据权利要求1至4中的一项所述的方法，其特征在于，选择所述区域(2)的优选散焦的显微明场图像作为概览图像(200)。
6.根据权利要求1至5中的一项所述的方法，其特征在于，通过利用基本上去除(105)所述对象(1)的强度进行模糊来从所述概览图像(200)获得背景估计(205)，并且在转换(110)成二值图像(210)之前用所述概览图像(200)与所述背景估计(205)的差异替换(106)所述概览图像(200)。
7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法，其特征在于，通过记录没有对象(1)的第二概览图像(200a)来获得(105)背景估计(205)，并且在所述转换(110)之前通过所述背景估计(205)将所述概览图像(200)逐点划分(106)成二值图像(210)。
8.根据权利要求1至7中的一项所述的方法，其特征在于，在所述二值对象掩模(230)中，相邻对象(1a，1b)的至少一个公共边界(1c)特别地通过分水岭变换被分裂(140)成间隔开的第一对象(1a)的第一边界(1d)和第二对象(1b)的第二边界(1e)。
9.根据权利要求1至8中的一项所述的方法，其特征在于，根据所述二值对象掩模(230)来评估(150)至少一个对象(1)的中心点(250a，250b)。
10.根据权利要求1至9中的一项所述的方法，其特征在于，利用光束(4)，优选地利用激光束，照射(160)所述区域(2)中的、根据所述二值对象掩模(230)对象(1)被定位在的至少一个位置，并且评估(170)所述对象(1)对所述照射(160)的反应(5)。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，基于所述二值对象掩模(230)来相对于所述对象(1)扫描(165)所述光束(4)，其中，考虑到所述光束(4)的空间强度分布(4a)，扫描的定时程序被选择为使得总接收光剂量的空间分布在所述对象(1)上均匀化。
12.根据权利要求10至11中的一项所述的方法，其特征在于，根据对所述照射(160)的反应(5)来评估(170)所述对象(1)的至少一个拉曼光谱(6)。
13.根据权利要求1至12中的一项所述的方法，其特征在于，选择分布在基板(10)上的生物细胞，优选地真核细胞，作为对象(1)。
14.根据权利要求10和13以及可选地根据权利要求11和/或权利要求12所述的方法，其特征在于，所述基板(10)上的细胞(1)暴露(180)于影响(20)之下，其中，利用所述光束(4)反复照射(160)所述细胞(1)，并且在每种情况下评估(170)所述细胞(1)对所述照射(160)的反应(5)。
15.根据权利要求10和13以及可选地根据权利要求11、12或14中的一项所述的方法，其特征在于，利用所述光束(4)照射(160)若干基板(10-12)上的细胞(1)，并且跨所述基板(190)合并所述细胞(1)对所述照射(160)的反应(5)。
16.根据权利要求14至15中的一项所述的方法，其特征在于，根据全部反应(5)，使用多变量分析来评估(192)所述细胞(1)的哪些属性(21-22)在所述影响(20)下以统计学上显著的方式变化以及/或者从一个基板(10-12)到另一个基板以统计学上显著的方式变化。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，选择主成分分析PCA作为多变量分析，以及/或者通过最小二乘拟合将纯成分的光谱拟合到测量的光谱。
18.根据权利要求16至17中的一项所述的方法，其特征在于，根据所述多变量分析(192)来评估(194)分类器(30)，所述分类器(30)对在另一基板(13)上的细胞(1)处获得的对所述照射(160)的反应(5)分配(195)适用于该基板(13)的属性(21-22)的至少一个值。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，借助于线性判别分析LDA或支持向量机SVM(194)来评估所述分类器(30)。
20.一种计算机程序产品，其包括具有指令的机器可读程序，当所述程序在计算机上执行时，所述指令使所述计算机和与所述计算机连接的任何测量设备执行根据权利要求1至19中的任一项所述的方法。
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