CN101948506A

CN101948506A - 一种非那甾胺缀合物及其在制备治疗前列腺药物中的应用

Info

Publication number: CN101948506A
Application number: CN2010102525612A
Authority: CN
Inventors: 赵爽; 王恩思
Original assignee: Jilin Innovation Medicine Public Service Platform Co Ltd
Current assignee: Jilin Innovation Medicine Public Service Platform Co Ltd
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2011-01-19

Abstract

本发明属于化学制药技术领域，具体涉及一种通过肽化(或蛋白化)方法制备的非那甾胺缀合物及该缀合物在制备治疗前列腺药物中的应用。非那甾胺缀合物的结构式如下所示。动物实验表明本发明所述的非那甾胺缀合物对于动物整体的机能影响比非那甾胺要小，毒性效果有所减弱，提示这种药物的毒性和安全性可能更为优越，可以作为一种治疗良性前列腺增生的5α-还原酶抑制剂进行进一步的新药开发。

Description

一种非那甾胺缀合物及其在制备治疗前列腺药物中的应用

技术领域

本发明属于化学制药技术领域，具体涉及一种通过肽化(或蛋白化)方法制备的非那甾胺缀合物及该缀合物在制备治疗前列腺药物中的应用。

背景技术

药物中有一些功能团属于糖苷基团，尽管糖类似乎没有治疗作用，但其物理、化学和生物学的特性及其在自然中存在的结构和拟态的性质，可用于修饰其他功能团的生物活性。目前关于糖苷的生物活性和药理活性报道的文献并不多。糖苷配基本身虽无活性，例如很多含有糖苷的抗生素——即乙琥红霉素、道诺霉素、两性霉素B发挥药效的并不是糖苷部分，但是糖类似乎起到药物和其受体连接的作用，可以显著提高药物的代谢能力。

传统上，糖配体的聚糖链是药物的药代动力学的分子的基础，参与吸收、分布、新陈代谢和排泄。例如很多经两性分子糖基化的胆汁酸类固醇衍生物，可以显著加强细胞膜的通过性。此外，葡糖苷酸是药物和异生物体排出体外的最终形式，起到了解毒的功能。当新药开发时在毒理学和临床试验中，经常需要可信的、高纯度的葡糖苷酸样品作为评价指标。抗肿瘤抗生素在DNA水平发挥作用，就是因为其基团中含有碳水化合物，脱氧糖部分对于细胞生长抑制或者促进细胞膜通透性都起到了重要作用。在结晶学研究中已经证明了双链DNA和糖配体的碳水化合物部分有直接的相互作用。

综上所述，糖苷对药物的代谢具有重要的意义。目前甾体的糖苷化已经开始受到广泛的重视。在结构上和生物上不同类的动物和植物分子，通过甾体糖苷化可以达到显著的治疗效果。这类物质如强心苷和皂苷，因其生理学和药理学的活性，最近得到了广范的关注。近年来，糖生物学的发展已经显示糖苷在免疫应答，病毒和细菌感染，炎症和细胞内信号转导起到了重要作用。在很多种中药内，甾体糖苷化合物经常是主要有效成分。在西药中，有治病的功能的甾体化合物也越来越多的被发现，如度他甾胺、非那甾胺等。对甾体和糖苷的化学连接方法报道也逐渐增多。

倍感甾体糖苷化思想的启迪，考虑到生物膜的结构特点，我们创新的选择了甾体的肽化(或蛋白化)作为研究目标，考查多肽和甾体两种不同的结构拼合在一个分子内，使新形成的化合物是否兼具两者的性质——即是否能够起到强化药理作用，减小各自相应的毒副作用；或两者能否取长补短，发挥各自的药理活性，协同完成治疗过程。

在此思想指导下，我们设计了度他甾胺和非那甾胺分别与一些小肽例如：匹多莫德、胸腺五肽或胸腺七肽拼合在一起，并检测其新形成的先导化合物是否具有某些特殊的生物活性。如果这种想法能够实现，将为新药的发现奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是设计与合成一种具有独特结构的非那甾胺缀合物及提供该缀合物在制备治疗前列腺药物中的应用。

非那甾胺是一种合成的甾体类化合物，系雄激素睾酮代谢为双氢睾酮过程中细胞内酶II型5α-还原酶的特异性抑制剂，临床上主要用于治疗良性前列腺增生。匹多莫德(Polimod，Pidotimod)是一种人工合成的二肽，系一种具有口服生物活性的免疫促进剂，不仅促进非特异性免疫反应，且可促进特异性免疫反应。本发明受甾体糖苷化及肽化思想的启迪，根据“拼合原理”，将非那甾胺和匹多莫德两种不同分子拼合成一个新的非那甾胺缀合物分子，并对该非那甾胺缀合物进行抑制5α-还原酶活性的体外实验及抑制大鼠良性前列腺增生(BPH)的体内实验研究，发现非那甾胺缀合物这个新型化合物能够兼具两者的性质——既能够强化非那甾胺的药理作用，同时又能增强机体免疫调节能力，减小毒副作用。同时也为治疗前列腺增生(BPH)的新药开发奠定了基础，开拓了新的思路。

本发明所述的一种非那甾胺缀合物，其结构式如下所示：

1合成反应

为了实现非那甾胺与匹多莫德的肽化反应，首先考查了非那甾胺与乙酰氯的酰化反应。结果表明，在该反应条件下，非那甾胺的乙酰化反应产物主要是化合物2。见下图：

非那甾胺与乙酰氯的模型反应

在确立非那甾胺的N-酰基化反应条件后，进而考查非那甾胺与匹多莫德的酰化反应。结果表明，在该反应条件下，非那甾胺不能与匹多莫德反应生成预期的缀合物10。这是因为在该反应条件下，匹多莫德不能有效的形成酰氯的缘故。为此，设计先形成匹多莫德酰胺4，再与非那甾胺衍生物反应的合成路线，最终得到缀合物10。见下图：

非那甾胺缀合物(10)的合成路线

2实验部分

2.1合成仪器与药品

熔点采用XT4显微熔点测定仪(北京电子光学设备厂)测定。红外光谱采用FTS-135型(美国BIO-RAD公司)红外光谱仪测定，KBr压片。¹H NMR，¹³CNMR采用UNITY-600型(美国Varian公司)核磁共振仪测定，TMS为内标。质谱采用美国LCQ电喷雾质谱仪测定。日本岛津SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度仪；Himac CR-21G高速冷冻离心机；Beckman Coulter超速冷冻离心机(Optima Max Ultercentrifige 130.000rpm)；组织匀浆机T25，ultra-turrax德国；常规的试剂和溶剂为国产分析纯；柱色谱用硅胶G(200～300目)青岛海洋化工厂分厂生产。

匹多莫德：99.5％，台州医药原料厂生产；

非那甾胺：按照我们已发表的“《非那雄胺的合成研究》，吉林大学，生物化学与分子生物学(专业)硕士论文，2006年度”论文介绍的方法制备。

另外还可根据我们已发表的“新型抗前列腺增生药物度他雄胺的合成[J].吉林大学学报(理学版).2007，45(6)”文章介绍的方法，以国内来源方便的孕烯酮酸为原料，采用碳-17位上羧基的酰胺化反应为关键步骤，以廉价易得的还原剂NaBH₃CN替代价格较贵的PtO₂催化氢化还原碳碳双键，最后以二氯二氰苯醌、双(三甲基硅烷基)氟乙酰胺为氧化剂进行1，2位脱氢合成非那甾胺，该合成的总收率为23％。该合成的特点是具有工艺路线短、总收率高、操作简单、成本较低等优点，适合工业化生产。

2.2非那甾胺与乙酰氯酰化反应

取10-20g(0.032mol)非那甾胺1，200-300mL乙酰氯，20-30mL吡啶置于四颈瓶中，在0℃下滴入草酰氯2.5-5mL(0.032mol)和甲苯10-15mL的混合液，室温搅拌反应2-4h，冷却后冰浴下加叔丁胺6-12mL(0.057mol)和甲苯5-10mL的混合液，室温搅拌反应8-16h。加氯仿100-150mL，有机层分别用1mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，粗品用乙酸乙酯重结晶得淡黄色固体2，产率不低于80％；mp 252～254℃。

2.3化合物4的制备

取匹多莫德315-30g(0.048mol)置于四颈瓶中，加入叔丁胺12-24mL，DCC25-50g，DMF 200-300mL，室温搅拌反应24-36h，过滤，硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷1∶10)，得油状物4，产率不低于58％。

2.4化合物6的制备

将孕烯酮酸516-32g(0.05mol)溶于160-320mL叔丁醇中，加入含14-28g(0.1mol)无水碳酸钾的水溶液72-144mL，升温至40℃，滴加含0.29-0.59g(58mmol)高锰酸钾和70-140g(3.28mol)高碘酸钠的水溶液240-360mL，回流反应1-2h，冷却至室温，抽滤，滤液减压回收绝大部分叔丁醇后，冰浴冷却，用盐酸溶液调pH＝2，二氯甲烷提取(50mLx3)，有机层用饱和氯化钠溶液(30mLx2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂得白色固体，干燥得化合物6，产率不低于68％。mp195～197℃。

2.5化合物7的制备

将60-120mL乙二醇在冰盐浴下通氨气，加入12-24g(0.03mol)化合物6，在40min内升温至120℃，并保温1h，升温至140℃，保持30min，冷却至室温，加人100mL水稀释，用盐酸调pH＝2，析出固体，抽滤，固体用水洗至中性，干燥得浅棕色固体7，产率不低于92％。mp＞250℃分解。

2.6化合物8的制备

将化合物710-20g(31.5mmol)溶于500-800mL甲醇中，用2mol/L HCl调pH＝2后，加入NaBH₃CN，常压室温搅拌反应，待反应结束，用2mol/L HCl调pH＝2，加水，用二氯甲烷萃取有机层，无水硫酸镁干燥，硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷1∶10)得白色固体化合物8，产率不低于76％。mp＞250℃分解。

2.7化合物9的制备

取化合物83-6g(9.4mmol)，1，4-二氧六环100-200mL，搅拌下加入二氯二氰苯醌(DDQ)2.5-5g(11.0mmol)，之后滴加双(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(BSTFA)12-24mL(9.4mmol)，滴毕室温搅拌反应12-36h，再升温至101℃，回流反应20-30h，蒸除溶剂，加1％的NaHSO₄溶液20-40mL，CH₂Cl₂80-160mL，搅拌0.5-1h，过滤，用CH₂Cl₂萃取，提取液依次用1mol/L HCl、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，粗品用乙腈重结晶得黄色固体化合物9，产率不低于58％。mp＞250℃分解。

2.8非那甾胺缀合物10的制备

取化合物90.6-1.2g(1.8mmol)，二氯亚砜0.5-1mL，二氯甲烷10mL，室温搅拌反应12-24h，减压蒸干溶剂后加无水THF10mL，化合物40.4-0.8g(1.3mmol)，NaH1.0-2.0g(3.6mmol，60％)，室温搅拌反应2-5h，加水20mL终止反应，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干，硅胶柱层析(展开剂：甲醇∶二氯甲烷1∶20)，得白色固体非那甾胺缀合物10，产率不低于50％。mp136～138℃。

3非那甾胺及缀合物体外实验：抑制5α-还原酶活性

3.1 Tris缓冲液(Tris 121.4mg，EDTA 1.8mg，MCl₂102mg，二巯基乙醇40pL，NaCl 292mg，蔗糖4.5g，加蒸馏水至100mL，用盐酸调pH＝7.0)

3.2 甾体5α-还原酶的制备：取四只雌性Wistar大鼠，禁食过夜后断颈处死，取肝脏。称重后用预冷的Tris缓冲液反复洗涤，除去残余血液及结缔组织。将处理后的肝脏置于干净的表面皿中，在冰上用剪子剪成2mm左右的小块后移入组织匀浆器中。加入5倍体积的Tris缓冲液，于低温下以4000g×3min匀浆三次。将匀浆液于4℃下离心，12000g×10min后吸去上层脂肪层，再将上清部分超速离心，105,000g×1h。去掉上清，将沉淀部分用Tris缓冲液重悬，得肝微粒体悬浊液。置于-80℃冰箱保存，可保存一个月。

3.3 睾丸酮(T)Sigma公司生产。用无水乙醇(AR)配制成终浓度为0、2、4、5、6、8、12、24μmol/L系列浓度。

3.4 NADPH Sigma公司生，Tris-HCl缓冲液配制成50μmol/L。

3.5 测试药品非那甾胺及非那甾胺缀合物均由吉林大学药学院提供。非那甾胺用无水乙醇(AR)配制成终浓度为0、40、80、160nmol/L系列浓度。非那甾胺缀合物用无水乙醇(AR)配制成终浓度为0、40、80、160nmol/L系列浓度。

3.6 NADPH标准曲线的测定

由于NADPH在340nm处有特征吸收，因此我们可以通过测定NADPH在340nm处的吸收值变化来检测NADPH浓度的改变。将已配制好的200μM NADPH溶液稀释至终浓度分别为0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55μM的梯度溶液，分别加缓冲液至200μl，温度37℃，340nm波长下测定各浓度NADPH溶液所对应的吸光值。以NADPH浓度(x)对吸光度值(y)做直线回归(表1)得标准曲线，其回归方程为y＝0.0028x+0.002，R²＝0.9984。

3.7 酶活性及抑制剂对5α-还原酶活性的影响

将实验分成3组：空白对照组(睾丸酮系列浓度+NADPH终浓度50μM+酶液浓度120μg/ml，加缓冲液至200μl)、阳性对照组(非那甾胺系列浓度+睾丸酮系列浓度+NADPH终浓度50μM+酶液浓度120μg/ml，加缓冲液至200μl)和实验组(缀合物系列浓度+睾丸酮系列浓度+NADPH终浓度50μM+酶液浓度120μg/ml，加缓冲液至200μl)。各组分别于37℃孵育10min。根据NADPH标准曲线方程折算出做为酶学反应底物NADPH的10min内的浓度下降数率，扣除空白的下降数率，即为酶活性。计算得Km值为4.087±0.102μM，Vmax为0.6509±0.0096μM·min^-1。据各浓度管中酶活性对T浓度通过SigmaPlot软件作图。根据Lineweaver_Burk双倒数作图法求出非那甾胺及缀合物对该酶的抑制常数Ki、和半数抑制常数IC₅₀，见表2、3。

表1：0D₃₄₀对NADPH(μM)标准曲线数据

表2：非那甾胺抑制大鼠5α-还原酶活性(nM·min^-1)

表3：非那甾胺缀合物抑制大鼠5α-还原酶活性(nM·min^-1)

实验结果表明，在测定抑制剂对5α-还原酶的抑制能力时，非那甾胺对5α-还原酶活性的抑制能力很好，其IC₅₀为147.49±2.84nM，这与已有文献报道的结果基本一致。非那甾胺缀合物对5α-还原酶活性的抑制能力要比非那甾胺强，其IC₅₀为87.98±1.76nM。

4非那甾胺及缀合物体内实验：抑制大鼠良性前列腺增生(BPH)

4.1大鼠前列腺增生模型的建立

大鼠去势：将雄性Wistar大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮进行肌肉麻醉，剂量为100mg/kg。过2min左右后等大鼠软倒，四肢不再抽动后将大鼠四肢固定于手术台上，用酒精棉擦拭阴囊及其周围部位进行消毒。在无菌条件下将阴囊表皮用镊子夹住提起，用手术剪依次剪开阴囊表皮、提睾肌、睾丸表膜，暴露双侧睾丸后沿根部剪下。缝合伤口两侧皮肤后擦净伤口及其周围血迹，放入装有干净垫料鼠笼中进行饲养，自然恢复一周。

4.2分组条件(n为大鼠数目)

①对照组：

空白对照组：仅切开阴囊表皮但不切除睾丸(以下各组均正常切除睾丸)，术后正常缝合，常规条件饲养，n＝8。

去势对照组：每天仅皮下注射橄榄油，常规条件饲养，n＝8。

BPH对照组：每天皮下注射丙酸睾酮(TP)，剂量为5mg/kg/day，常规条件饲养，n＝8。

非那甾胺对照组(阳性对照)：每天皮下注射给药TP(5mg/kg/day)及非那甾胺(10mg/kg/day)，常规条件饲养，n＝8.

②给药组：

将非那甾胺缀合物(目标筛选药物)分为三个梯度组(2mg/kg/day、10mg/kg/day、50mg/kg/day)每天皮下注射给药，同时注射TP，正常饲养，n＝8。

空白对照组每天仅进行抓放处理，其余每组按既定剂量给药、饲养，持续14天。

4.3前列腺组织结构观察

于末次给药后第二天记录各只大鼠体重，断颈处死大鼠，打开腹腔，取出前列腺、精囊及心、肝、脾、肾等器官。对心、肝、脾、肾等器官进行称重。将大鼠前列腺及精囊置于盛有0.9％生理盐水的玻璃表皿中。用眼科镊、剪小心剥离，除去结缔组织和脂肪组织。取剥离干净后的前列腺及精囊置于滤纸上，吸干表面水分后用电子天平称其湿重(mg)，并计算前列腺指数(表4，表5)。前列腺指数＝前列腺湿重(mg)/大鼠体重(g)。

将各组大鼠前列腺分组固定于4％多聚甲醛中进行固定，经脱水处理、石蜡包埋、切片、H.E.染色后用光学显微镜进行观察。采用SPSS11.0统计软件对相关数据进行处理，所有试验数据以均数±标准差

表示，多个样本均数的比较采用ANOVA检验，组间均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异有显著意义。

表4：空白对照组和BPH造模组的大鼠前列腺湿重和前列腺指数

注：与空白对照组比较，^*P＜0.05

结果显示BPH造模组大鼠的前列腺湿重及前列腺指数与空白对照组相比均存在显著差异(P＜0.05)，实际观察可见前列腺组织体积也有显著增大，增生症状明显。由此可见丙酸睾酮皮下注射促大鼠前列腺增生法是成功的。

表5：各组大鼠前列腺湿重、精囊湿重以及前列腺指数的比较

注：①非那甾胺组给药剂量为10mg/kg/day；②目的药物为非那甾胺肽化产物，I组给药剂量为2mg/kg/day；③目的药物II组给药剂量为10mg/kg/day；④目的药物III组给药剂量为20mg/kg/day。与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

小结：与非那甾胺相比，非那甾胺缀合物对于5α-还原酶活性有良好抑制效果，如图15、16、17、18所示，对于大鼠良性前列腺增生也表现出了较好的抑制作用，同时用药动物较对照药物非那甾胺组表现出更好的生活状态，去势对照组和非那甾胺给药组大鼠的活动状况有所减少，精神状态比较萎靡，皮肤弹性下降，毛发色泽发暗。而与之相比非那甾胺缀合物组大鼠未出现以上情况。这说明非那甾胺缀合物对于动物整体的机能影响比非那甾胺要小，毒性效果有所减弱。提示这种药物的毒性和安全性可能更为优越，可以作为一种治疗良性前列腺增生的5α-还原酶抑制剂进行进一步的新药开发。

综上所述，本发明首次创新的通过肽化反应将甾体(非那甾胺)和二肽(匹多莫德)这两种不同的结构拼合成一个全新的且生物活性更高更有意义的非那甾胺缀合物，并提供了该缀合物可以在制备治疗前列腺药物中得到应用。

附图说明

图1：本发明合成的化合物1的一维¹H NMR谱图；

图2：本发明合成的化合物1的一维¹³C NMR谱图；

图3：本发明合成的化合物4的一维¹H NMR谱图；

图4：本发明合成的化合物4的一维¹³C NMR谱图；

图5：本发明合成的化合物6的一维¹H NMR谱图；

图6：本发明合成的化合物6的一维¹³C NMR谱图；

图7：本发明合成的化合物7的一维¹H NMR谱图；

图8：本发明合成的化合物7的一维¹³C NMR谱图；

图9：本发明合成的化合物8的一维¹H NMR谱图；

图10：本发明合成的化合物8的一维¹³C NMR谱图；

图11：本发明合成的化合物9的一维¹H NMR谱图；

图12：本发明合成的化合物9的一维¹³C NMR谱图；

图13：本发明合成的化合物10的一维¹H NMR谱图；

图14：本发明合成的化合物10的一维¹³C NMR谱图；

图15：空白对照组前列腺组织(HE×40)切片HE染色结果图；

图16：BPH造模组前列腺组织(HE×40)切片HE染色结果图；

图17：非那甾胺组前列腺组织(HE×40)切片HE染色结果图；

图18：非那甾胺缀合物组前列腺组织(HE×40)切片HE染色结果图；

如图1、2所示，为采用本发明所述方法合成的化合物1的核磁氢谱、碳谱，

其中，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.13(d，J＝10.0Hz，1H，＝CH-)，6.87(s，1H，＝NH)，5.81(d，J＝10.0Hz，1H，＝CH-)，3.61(dd，J＝12.4Hz，J＝3.2Hz，1H，＝CH-)，2.50(t，J＝1.6Hz，1H，＝CH-)，2.31(s，3H，CH₃-CO-)，2.20～1.95(m，3H，-CH₂-，＝CH-)，1.80～1.66(m，2H，-CH₂-)，1.64～1.49(m，4H，2×-CH₂-)，1.35～1.29(m，3H，＝CH-，-CH₂-)，1.24(s，9H，3×CH₃-)，1.21～1.02(m，2H，-CH₂-)，0.92(s，3H，-CH₃)，0.57(s，3H，-CH₃)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：176.6，171.1，166.0，154.4，121.9，64.9，55.4，55.0，49.9，47.2，43.5，40.1，37.4，34.4，29.6，28.7，28.3，24.0，23.8，22.9，20.7，13.5，12.7；IR(KBr)v cm^-1：3430 3241(v_NH)；3116 3047(v_＝CH)；2969 2868 2847(

)；16881669(v_C＝O)；1600(v_C＝C)；ESI-MS m/z(％)：[M⁺+1]373(100)。证明合成化合物1结构正确。

如图3、4所示，为采用本发明所述方法合成的化合物4的核磁氢谱、碳谱。其中，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：7.77(s，1H，NH)，7.5(s，1H，NH)，4.90(d，1H，J＝8.4，-CH)，4.71(m，1H，-CH)，4.55(m，1H，-CH)，4.36(d，1H，J＝8.4，-CH)，3.25(m，1H，-CH)，2.93(m，1H，-CH)，2.34(m，1H，-CH)，2.10(m，2H，-CH₂-)，1.96(m，1H，-CH)，1.23(s，3H，-CH₃)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：117.1，169.9，168.5，62.0，53.9，50.2，48.3，32.9，28.9，28.3，24.4。证明合成化合物4结构正确。

如图5、6所示，为采用本发明所述方法合成的化合物6的核磁氢谱、碳谱。其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：11.96(m，2H，-COOH)，2.61-2.65(m，1H，-CH)，2.26-2.31(m，2H，-CH₂-)，2.04-2.11(m，3H，-CH，-CH₂-)，1.94-1.99(m，3H，-CH，-CH₂-)，1.86-1.90(m，2H，-CH₂-)，1.67-1.72(m，4H，2×-CH₂-)，1.41-1.44(m，4H，2×-CH₂-)，1.04(s，3H，-CH₃)，0.69(s，3H，-CH₃)；³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：213.8，174.6，174.6，54.5，54.4，49.8，46.7，43.1，37.5，37.3，34.2，30.6，29.4，28.9，24.0，23.1，20.8，20.1，13.1。证明合成化合物6结构正确。

如图7、8所示，为采用本发明所述方法合成的化合物7的核磁氢谱、碳谱。其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：11.91(br，1H，-COOH)，9.28(s，1H，NH)，4.82-4.84(m，1H，＝CH)，2.23-2.36(m，3H，-CH，-CH₂-)，1.94-2.02(m，3H，-CH，-CH₂-)，1.64-1.81(m，2H，-CH₂-)，1.53-1.64(m，5H，-CH，2×-CH₂-)，1.21-1.36(m，5H，-CH，2×-CH₂-)；¹³C-NMR(100MHz，D₂O)δ：174.7，167.8，140.7，101.0，55.3，54.5，47.5，43.1，37.5，33.5，31.2，31.2，29.2，28.2，24.0，23.2，20.3，18.4，13.1。证明合成化合物7结构正确。

如图9、10所示为采用本发明所述方法合成的化合物8的核磁氢谱、碳谱。其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：11.89(br，1H，-COOH)，7.25(s，1H，NH)，2.92-2.95(m，1H，-CH)，2.24-2.29(m，1H，-CH，)，2.13-2.17(m，2H，CH₂-)，1.92-1.96(m，2H，-CH₂-)，1.71-1.72(m，2H，-CH₂-)，1.51-1.64(m，4H，2×-CH₂-)，1.16-1.34(m，6H，3×-CH₂-)，0.78(s，3H，-CH₃)，0.62(s，3H，-CH₃)，¹³C-NMR(100MHz，D₂O)δ：174.1，169.8，59.5，54.6，54.3，50.5，43.0，37.5，34.8，34.5，32.8，28.9，28.1，26.1，23.6，23.0，20.3，12.8，10.8。证明合成化合物8结构正确。

如图11、12所示为采用本发明所述方法合成的化合物9的核磁氢谱、碳谱。其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：11.95(br，1H，-COOH)，7.39(s，1H，NH)，6.82(d，J＝12Hz，1H，＝CH-)，5.62(d，J＝12Hz 1H，＝CH-，)，3.32(s，1H，-CH)，2.26-2.30(m，1H，-CH)，1.9-2.0(m，2H，-CH₂-)，1.67-1.76(m，2H，-CH₂-)，1.59-1.64(m，3H，-CH，-CH₂-)，1.39-1.45(m，3H，-CH，-CH₂-)，1.10-1.28(m，4H，2×-CH₂-)，0.96(s，3H，-CH₃)，0.63(s，3H，-CH₃)；¹³C-NMR(100MHz，D₂O)δ：174.6，165.0，150.3，123.1，59.0，54.8，54.7，54.4，47.0，43.3，37.6，34.8，29.0，25.0，23.8，23.1，20.5，13.3，11.8。证明合成化合物9结构正确。

如图13、14所示，为采用本发明所述方法合成的化合物10的核磁氢谱、碳谱。其中，¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：7.51(s，1H，NH)，7.37(s，1H，NH)，6.81(dd，1H，J＝10Hz，J＝2Hz，＝CH)，5.61(d，1H，J＝10Hz，＝CH)，5.13～5.17(m，1H，CH)，4.96(d，1H，J＝8Hz，-CH)，4.69～4.72(m，1H，CH)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，-CH)，3.98(m，1H，-CH)，3.30(m，1H，-CH)3.19(m，1H，-CH)，2.95(m，1H，-CH)，2.55(m，1H，-CH)，2.26(m，1H，-CH)2.12(m，1H，-CH)，1.98(m，1H，-CH)，1.86(m，2H，-CH₂)，1.55～1.78(m，10H，5×-CH₂-)，1.18～1.27(m，9H，3×CH₃)，0.93～1.03(m，2H，-CH₂-)，0.84(s，3H，-CH₃)，0.77(s，3H，-CH₃)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ：174.8，173.8，170.1，168.5，165.0，150.3，123.0，61.8，59.6，59.0，57.4，55.4，51.7，50.2，48.6，39.4，36.2，34.9，33.1，32.2，29.2，28.4，28.1，26.2，25.0，24.1，20.4，19.7，13.6，13.8，11.8。证明合成化合物10结构正确。

如图15、16、17、18所示，为各组去势大鼠前列腺组织切片HE染色结果图，注：(1)除空白对照组外，其余每组均给予5mg/kg/day剂量的TP。(2)非那甾胺组和非那甾胺缀合物(目的药物)组的给药剂量为10mg/kg/day。可以看出正常对照组大鼠的前列腺腺体排列清楚，腺体上皮呈单层柱状，可见少许基底细胞及基膜，腺腔内无或有少许分泌物，腺腔无扩张，间质无增生(图15)，BPH造模组大鼠前列腺腺体排列比较紧密，腺腔体积明显减小，腺体上皮细胞呈单层柱状排列，多数上皮区域呈假复层，厚度增加，排列紊乱，部分腺上皮呈乳头状或锯齿状突向腔内，间质纤维组织增多(图16)，非那甾胺组大鼠前列腺腺体排列恢复得比较规则，腺腔体积逐渐恢复正常，腺体上皮细胞假复层现象减少，腺上皮突起情况显著改善，间质纤维组织增生减少(图17)，与其相比，非那甾胺缀合物组对前列腺增生的抑制效果有明显加强。腺体排列更加规则、腺体上皮细胞假复层情况基本消失，腺上皮乳头状突起消失，间质纤维组织增生情况也得到进一步改善(图18)。

具体实施方式

实施例1：非那甾胺与乙酰氯酰化反应

取非那甾胺110g(0.032mol)，乙酰氯200mL，吡啶20mL置于四颈瓶中，在0℃下滴入草酰氯2.5mL(0.032mol)和甲苯10mL的混合液，室温搅拌反应3h，冷却后冰浴下加叔丁胺6.6mL(0.057mol)和甲苯5mL的混合液，室温搅拌反应12h。加氯仿100mL，有机层分别用1mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，粗品用乙酸乙酯重结晶得淡黄色固体210.2g(87％)；mp 252～254℃。

实施例2：化合物4的制备

取匹多莫德315g(0.048mol)置于四颈瓶中，加入叔丁胺12.5mL，DCC 25g，DMF 200mL，室温搅拌反应24h，过滤，硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷1∶10)，得油状物410.5g(60％)。

实施例3：化合物6的制备

将孕烯酮酸516g(0.05mol)溶于160mL叔丁醇中，加入含14g(0.1mol)无水碳酸钾的水溶液72mL，升温至40℃，滴加含0.29g(58mmol)高锰酸钾和70g(3.28mol)高碘酸钠的水溶液240mL，回流反应1h，冷却至室温，抽滤，滤液减压回收绝大部分叔丁醇后，冰浴冷却，用盐酸溶液调pH＝2，二氯甲烷提取(50mLx3)，有机层用饱和氯化钠溶液(30mLx2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂得白色固体，干燥得化合物612g(70％)，mp195～197℃。

实施例4：化合物7的制备

将60mL乙二醇在冰盐浴下通氨气，加入12g(0.03mol)化合物6，在40min内升温至120℃，并保温1h，升温至140℃，保持30min，冷却至室温，加人100mL水稀释，用盐酸调pH＝2，析出固体，抽滤，固体用水洗至中性，干燥得浅棕色固体79.1g(93.5％)，mp＞250℃分解。

实施例5：化合物8的制备

将化合物710g(31.5mmol)溶于500mL甲醇中，用2mol/L HCl调pH＝2后，加入NaBH₃CN，常压室温搅拌反应，待反应结束，用2mol/L HCl调pH＝2，加水，用二氯甲烷萃取有机层，无水硫酸镁干燥，硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷1∶10)得白色固体化合物87.9g(78.5％)mp＞250℃分解。

实施例6：化合物9的制备

取化合物83g(9.4mmol)，1，4-二氧六环100mL，搅拌下加入DDQ 2.5g(11.0mmol)，之后滴加BSTFA12.8mL(9.4mmol)，滴毕室温搅拌反应12h，再升温至101℃，回流反应20h，蒸除溶剂，加1％的NaHSO₄溶液20mL，CH₂Cl₂ 80mL，搅拌0.5h，过滤，用CH₂Cl₂萃取，提取液依次用1mol/L HCl、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，粗品用乙腈重结晶得黄色固体化合物91.8g(59.8％)mp＞250℃分解。

实施例7：非那甾胺缀合物10的制备

取化合物90.6g(1.8mmol)，二氯亚砜0.5mL，二氯甲烷10mL，室温搅拌反应12h，减压蒸干溶剂后加无水THF10mL，化合物40.4g(1.3mmol)，NaH1.0g(3.6mmol，60％)，室温搅拌反应2h，加水20mL终止反应，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干，硅胶柱层析(展开剂：甲醇∶二氯甲烷1∶20)，得白色固体非那甾胺缀合物100.4g(50％)，mp136～138℃。

Claims

1.一种非那甾胺缀合物，其结构式如下所示：

2.权利要求1所述的非那甾胺缀合物在制备治疗前列腺药物中的应用。