CN101945992A

CN101945992A - 无蛋白质配子和胚胎处理及培养基产品

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Publication number: CN101945992A
Application number: CN2008801273437A
Authority: CN
Inventors: 贾法·阿里宾M·阿布杜拉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2028-12-19
Also published as: KR101316650B1; RS52840B; DK2235160T3; JP2011507530A; BRPI0821797A2; AP2010005292A0; AU2008345661C1; CA2708507A1; EP2235160B1; WO2009086191A1; HK1148773A1; IL206253A0; NO331476B1; CN101945992B; KR20100101156A; PT2235160E; IL206253A; AP2827A; PL2235160T3; AU2008345661B2

Abstract

本发明公开一种用于辅助生殖技术(assisted reproductive technologies)的含14kDa甲基纤维素的基本上无蛋白质的细胞培养基。

Description

无蛋白质配子和胚胎处理及培养基产品

发明领域

本发明涉及专门用于人类生殖和生育程序，并且针对该程序经过优化的无蛋白质培养基(PFM)。本文中描述的基本上无蛋白质的培养基产品可用于防止结合于蛋白的病原体(特别是朊病毒等)传播给正在接受不孕症治疗的患者、通过辅助生殖技术(ART)怀育的新生儿、和这些领域的从业人士，特别涉及在人ART中的应用。

发明背景

用于人类ART程序(procedures)的传统市售胚胎培养基含有从人血液和组织来源获得的人血清白蛋白(HAS)。在一些实验室中，也使用类似地从牛血液和组织来源获得的牛血清白蛋白(BSA)作为人类胚胎培养程序中蛋白质的来源(Loutradis et al.，1992；Quinn，1994)。含有HSA和BSA的培养基的效力据报道是相似的(Staessen et al.，1998)。在培养基中使用从供体(人类或牛)获得的蛋白质有将疾病传播给接受辅助怀孕治疗的患者的潜在可能。

近年来尚未有人描述过在化学限定的(没有添加的蛋白质或白蛋白、或动物或人来源的蛋白提取物)培养系统中，从收集卵母细胞开始，随后进行精子冲洗(sperm washing)、授精、受孕到卵裂胚阶段，最后进行胚胎移植，产生活的人类胚胎的过程。尽管近年来报道了用于小鼠、家兔和灵长类动物的化学限制培养基(Spindle，1995；Li et al.，1996；Schramm and Bavister，1996)，。先前声称的用于人类的化学限定无蛋白质培养基(PFM)实际上不是真的没有蛋白质，因为用于受精的精子仍然是在含有血清蛋白的培养基中制备的(Mohr & Trounson，1986；Serta and Kiessling 1997(Abst)；Parinaud et al.1999)。因此，迄今为止尚未描述过用于ART程序的完全无蛋白质的培养基。

本领域中需要有用于产生活的早期分裂阶段的人类胚胎的化学限定培养基，以避免使用潜在有危险的供体蛋白，保证正在进行辅助生殖治疗的患者的安全。人们对可能传播病原性疾病(pathogenic disease)，特别是病毒性疾病，例如人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和肝炎，或者由血源产物中的朊病毒等传播的Creutzfeldt-Jakob病(CJD)等的担忧，已经促使全世界ART领域内的许多医疗服务供应商开始搜寻供体蛋白的替代物来用于胚胎培养和处理程序。

致死性病毒疾病(AIDS)通过血源产品对血友病患者的传播已经有大量的文献记录(见例如Craven et al.，1997，Med.Sci.Law 37：215-227；Keshavjeeet al.，2001，Soc.Sci.Med.53：1081-1094；Weinberg et al.，2002，Ann.Intern.Med.136：312-319；Evatt，2006，Semin.Hematol.43：S4-9)。从垂体提取的人类生长激素已被发现能够向人体传播CJD(Esmonde et al.，1994)，并且人促性腺激素注射也能够在人与人之间传播CJD(CDC，1985)。CJD可以通过血液传播(尽管CJD朊病毒的滴度在血液中较低；Heye et al.，1994)。过去曾在大约200名IVF患者在接受了在含有被乙型病毒污染的混合血清(pooled sera)的培养基中培养的胚胎后发生了乙型肝炎流行(van Os et al.，1991)。最近，科学界面临着这样的难题，即必须通知他们的患者，用于胚胎培养和处理的市售培养基制剂可能被由后来死于CJD的人捐献的白蛋白所污染(Kemmann，1998)。

有大量报道在无蛋白质培养基中从受精卵和卵裂阶段育成了小鼠胚泡。最早的报道包括Brinster(1965)和Cholewa and Whitten(1970)，后者使用高分子量胶体聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为润滑剂和用于增加培养基的粘度。该项工作之后，许多其它的工作者在无蛋白质培养基中成功培养了小鼠以及其它哺乳动物胚胎(Dandekar and Glass，1990；Spindle，1995；Li et al.，1996；Schramm and Bavister，1996)。近些年，除了PVP之外，聚乙烯醇(PVA)(Bavister，1995)也被用于替代培养基中的血清蛋白质。例如，Biggers等(1997)研究了用聚乙烯醇(PVA)和/或氨基酸代替牛血清白蛋白(BSA)对小鼠受精卵发育的影响。他们评论到(observed)，PVA不能完全代替小鼠胚胎培养基中的BSA。PVA对胚泡发育速度的影响仅比BSA略低，但是部分孵化(partial hatching)的速度却显著降低。用PVA代替BSA会降低整体响应，但不会导致大的干扰。

除了其许多生物学作用之外，血清蛋白可带来许多有用的物理性质，例如培养基的润滑和粘度。为了容易处理和操作胚胎并防止其附着于培养盘和胚胎移植导管(embryo transfer catheter)的壁上，需要增加培养基的润滑和粘度。PVP和PVA的加入仅仅是提供与血清蛋白一样的物理属性。然而，PVP和PVA不是固定化氮的来源，并且它们也不执行蛋白质的各种生物学作用。此外，PVP和PVA的致畸性质(teratological properties)尚没有得到完全检查，使其在人类治疗性辅助生殖中的使用存在疑问(Gardner and Lane，1998a)。

一些研究人员已经尝试在无蛋白质培养系统中产生活的人类胚胎，最近的是Serta等(1997)和Parinaud等(1998a)。然而，Serta与其合作者(1997)用于授精的精子是通过沿BSA柱下游(swim-down)制备的(尽管随后的培养在无蛋白质培养基中进行)。这些工作者实现了31％(n＝45)的怀孕率，其中一些怀孕足月产下了正常后代。Parinaud等(1998a)用在无蛋白质培养基中制备的精子进行受精，授精在相同的培养基中进行。然而，得到的受精卵是在BM1培养基中培养的，尽管该参考文献没有详述其BM1培养基是否含有蛋白质，但是该研究组的先前出版物提示，BM1培养基含有1％HSA(Parinaud et al.，1998b)。

一些工作者已经显示，在小鼠和人类中，用单一的抗氧化剂和螯合剂例如EDTA代替血清蛋白(Mehta and Kiessling，1990；Serta et al.，1997)不会破坏受精和活胚胎的分裂(cleavage)。然而，Serta等(1997)建议用无蛋白质培养基充分漂洗胚胎移植导管，这暗示胚胎易于粘附到胚胎移植导管内壁。血清蛋白质还具有保持培养基pH的作用(Moessner et al.，1993)。除了其作为生物系统中营养物的作用之外，蛋白质还具有许多其它的作用，例如链断裂性抗氧化剂(chain-breaking antioxidant)和金属离子螯合剂(Barber，1961；Vidlakova et al.，1972；Wayner et al.，1987)。

白蛋白和血浆蛋白的一般生理学功能已经有大量文献证明。白蛋白在防止膜过氧化中的作用表明其在膜稳定性中具有直接的作用。它参与毛细管膜渗透性和渗透压调节。白蛋白提供了血浆中总胶体渗透压的80％。白蛋白参与二氧化碳的运输并发挥pH缓冲剂的作用；白蛋白占据血浆中非碳酸氢盐缓冲剂值的最大部分(95％)。蛋白质还作为能量的来源。脱氨基的丙氨酸是丙酮酸盐，其可以被转化成乙酰-CoA或葡萄糖和糖原。白蛋白可以辅助溶解脂质和运输激素、维生素和金属。它充当这些组分释放和使用的蓄池。

因此，替换培养基中血清白蛋白的任何尝试都应当考虑到这些有用于在体外进行胚胎处理和操作的体内作用和物理性质。单一的组分不可能满足血清蛋白质的所有功能。

尽管先前已经描述了支持大量动物物种发育的无蛋白质培养基，但是这些无蛋白质培养基均没有成功地用于人类，也无法假定这些培养基可以支持或者人类胚胎发育或者对于人类胚胎发育而言是最优的。因此，仍然非常需要有特别适用于人类ART和IVF的限定的无蛋白质培养基。

相关技术背景

先前已知有用于处理和培养哺乳动物细胞，特别是来自啮齿类动物(小鼠、大鼠、豚鼠等)的细胞的推定“无蛋白质”培养基，也可用于人类体外受精中的受精、胚胎发育和妊娠。

Caro等已经描述过一种这样的用于人类的“无蛋白质”培养基，然而它们不能克服精子制备培养基对蛋白质的需要，因为蛋白质是诱导精子获能所需要的，没有它们，精子不能获得穿透和/或使卵子受精的能力。因此，Caro与其合作者的培养基系统不是完全没有蛋白质的。类似地，Serta等(1997；摘要)和Parinaud等(1998a，摘要；1999)也描述了用于人类ART的“无蛋白质”培养基，但是他们与之前的Caro等(1986)一样，在其培养系统的至少一个阶段内使用了蛋白质。

如这些参考文献中描述的，用含有外加蛋白的培养基冲洗先前制备的精子不能完全确信可除去污染的感染原，特别是病毒和朊病毒。此外，这也是不利的，因为它使精子经历不必要的压力(stressful)清洗过程，并需要消耗多余的人力和资源。

在例如下列文献中公开了与IVF无关的用于培养哺乳动物特别是人细胞的“无蛋白质”培养基：Kovár et al.，1987，Biotechnology Letters，vol.9no.4，p.259-264“Iron Compounds at high Concentrations Enable Hybridoma Growth in a Protein-free Medium”；Keen，1995，Cytotechnology，vol.17：193-202“The culture of rat myeloma and rat hybridoma cells in a protein-free medium”；Stoll et al.，1996，J.Biotechnology，vol.45，p.111-123“Systematic improvement of a chemically defined protein-free medium for hybridoma growthand monoclonal antibody production.”。该工作具体地涉及单克隆抗体产生，而没有公开将这种培养基用于IVF或ART用途。其它出版物公开了无蛋白质生长介质，但不适宜或适合于人类IVF程序，这些出版物包括：Zang et al.，1995，Biotechnology，vol.13，p.389-392，“Production of Recombinant Proteins in Chinese Hamster Ovary Cells Using A Protein-Free Cell Culture Medium”；和国际专利申请公开no.WO 2005/120576A2。

本发明概要

本发明涉及新型无蛋白质培养基配方，其用于人类卵子获取(retrieval)(i.“冲洗培养基”)，精子操作和保存(ii.“配子处理培养基”)，人类卵子受精(iii.“胚胎培养培养基”)，配子和胚胎处理(iv.“配子和胚胎操作培养基”)，以及受精卵在培养条件下经过1-2个分裂周期的发育(v.胚胎培养基)，在使用ART程序治疗和减轻生育力低下和不孕的人体应用中使用。本发明包括配制单一培养基溶液，该溶液能够代替(replace)上述的所有新培养基溶液，和/或可以用作上述所有新培养基溶液的替换品(replacement)/介质(medium)。本发明的基本上没有蛋白质的培养基与先前由相同发明人报道的无蛋白质培养基(彼处称作ART-7和ART-7b系列)(Ali，1997；Ali et al.，2000)截然不同。在先前报道中，发明人描述了他们所进行的系统性研究，该研究导致他们配制出了三种前驱(precursor)培养基，称作ART-1、ART-2和ART-3。在同一报道中，这些发明人描述了基本上无蛋白质的培养基系列ART-7和ART-7b是如何从ART-1培养基演变而来的。通过在基本上无蛋白质的ART-7和ART-7b培养基系列中进行胞质内精子注射(ICSI)产生的胚胎被成功地用于治疗11/21名(52.4％)39岁以下的妇女，实现了临床妊娠。ART-1、ART-7和ART-7b培养基系列的配方尚没有公开。本发明提供了基本上无蛋白质的培养基，其从前驱ART-3培养基配制而来，但又与之不同。本发明人已经描述了前驱ART-3培养基的开发，但没有描述其组成(Ali，1997；Ali et al.，2000)。

在本发明的举例实施方案中，具体公开了一系列基本上无蛋白质的培养基，这里称作PFM-11系列。这些培养基具有明确的优点，即成分均匀，没有潜在有危险的不均一的(non-uniform)生物成分，这些不均匀生物成分可能危害配子和胚胎，并可能向正在进行ART治疗的患者、通过这种治疗受孕的婴儿和参与ART治疗程序的卫生工作者传播目前已知或者迄今未知的致死性疾病，该培养基符合管理体外受精技术和方法的严格的新标准和规章。

本发明基本上无蛋白质的培养基配方的完全被限定的性质，也使得它可以用来帮助进行对胚胎植入前的胚胎代谢的研究。目前可用的胚胎培养基配方没有限定，而且成分不均匀，阻碍了这方面的研究。使用连续超小液滴(cUMD)(continuous ultramicrodroplet)培养技术在这些基本上无蛋白质的培养基(PFM)中产生的第2天人类胚胎的质量与在含有血清蛋白质的对照商业培养基配方中发育的胚胎相当或者更好。所述PFM培养基对人类精子无毒。通过传统IVF和胞质内精子注射(ICSI)进行受精和随后人类胚胎的发育与对照相当。

本发明基本上无蛋白质的培养基还适用于基本上无蛋白质的人类胚胎培养和操作培养基，并可保证不会向患者和新生儿传播蛋白质结合的疾病(protein-bound diseases)。本发明的基本上无蛋白质的培养基可以在-20℃冷冻保存长达2年，而不会损失效力。

本发明成功地克服了在培养系统中添加供体蛋白质的需要，并提供了用于人类ART应用的基本上无蛋白质的培养基系统，所述人类ART应用使用基本上无蛋白质的培养基产品，从卵子获取开始，经过精子制备、授精(insemination)、受精(fertilization)、所得胚胎培养和胚胎移植。这个特征有利地将本发明的培养基与先前描述的“无蛋白质”培养系统区分开，先前系统在程序的某些点上使用含有蛋白质的培养基产品，因此不是完全无蛋白质的。结果，这些先前的培养基可能被感染原(infectious agent)污染，并可能面临法规限制。在本文中提出了本发明的组成、范围、优选范围和各种成分的具体规格。

本发明是通过研究能够在体内和体外部分代替蛋白质的各种作用的单个成分(例如氨基酸、抗氧化剂和螯合剂、渗透物、维生素、营养物和替代能量源)的效果(effect)、耐受性(tolerance)；并确定它们的最佳水平而获得的；其例示了蛋白质在本发明的没有供体血清蛋白质的各种无蛋白质操作培养基(例如精子和卵子操作培养基，和ICSI培养基)和胚胎培养基中的作用。利用上述成分的最佳浓度配制多种胚胎培养基。随后，鉴定了这些培养基中显示最佳胚胎发育和显著更高胚泡孵化率的培养基，并进一步优化，以在不添加血清蛋白质的条件下支持人类胚胎发育。本发明基本上无蛋白质的培养基能够支持用在相同培养基中制备的精子对人类卵子授精。所得的配子随后在基本上无蛋白质的培养基中发育形成活的早期卵裂阶段的人类胚胎。移植这些胚胎，可实现正常的妊娠和活产。

因此，本发明成功地提供了可用于整个IVF/ART程序(卵子获取、精子制备、播种、授精、所得胚胎的培养和胚胎移植)的培养基，其克服了在培养系统中添加蛋白质的需要。

本发明某些实施方案的详细说明

本发明提供了一系列营养溶液，一般地称作胚胎操作培养基和培养培养基，其没有任何蛋白质和类蛋白质成分。这些培养基可用于人类卵子的受精和随后受精卵在体外发育达2-6天。这些营养溶液称作“胚胎培养培养基”。除了IVF和ART之外，可有利地使用基本上无蛋白质的营养生长培养基的其它方法和技术包括干细胞技术和治疗、细胞/组织再生和移植治疗程序。技术人员可意识到如何将本文中所述培养基加以改造用于这些用途。

如将在下面进一步详细公开的，通过将本发明的基本上无蛋白质的培养基用于人类配子和胚胎，增加了IVF和ART的效力。例如，使用基本上无蛋白质的培养基(PFM-11)进行常规IVF获得的临床怀孕率在所有年龄组中均增加到了50％(14/28)，而且在年龄低于40岁的妇女中高达53.8％(14/26)；相比之下，目前可得的含蛋白质胚胎培养基对于组合的所有年龄组仅有33％的怀孕率(如Ali，2004中所引述)。使用本发明基本上无蛋白质培养基的ICSI临床怀孕率在所有年龄组中同样增加到46.2％(12/26)，在年龄低于40的妇女中高达54.5％(12/22)。该差异是统计学上显著的，其优势在本发明的基本上无蛋白质的培养基一方，表明本发明的基本上无蛋白质的培养基至少等同于(并可能优于)目前市场上可得的商业含蛋白质培养基。从通过常规IVF在PFM-11培养基中产生的胚胎出生的婴儿数量为12，而通过ICSI出生的婴儿数量为12。从在本发明PFM-11中产生的胚胎出生的婴儿外观正常、聪明、健谈并且活泼(根据父母报告)。这些统计数据从一个包含至少24个这样出生的孩子的样本中产生。

如这里所使用的，术语“无蛋白质”、“实质上无蛋白质”和“基本上无蛋白质”意图表示所述培养基是用不含蛋白质的组分(如本文将更详细描述的)制备的，并且没有向培养基中添加蛋白质或含蛋白质的组分。

本发明的举例实施方案包括一系列基本上无蛋白质的培养基，称作PFM-11系列。这些培养基系列具有众多专门的培养基产品，即：

1.基本上无蛋白质的冲洗培养基

2.基本上无蛋白质的配子(精子)操作培养基

3.基本上无蛋白质的配子(卵母细胞/胚胎)操作培养基

4.基本上无蛋白质的胚胎培养基

这些培养基根据下文提出的方法加以使用，这些方法意图举例说明这些培养基的用途，但并不限制这些培养基的任何其它用途，例如在本领域技术人员已知的IVF或ART方法中的其它用途。在如这里提出的实验中开发本发明培养基时，每一个程序用常规的含蛋白质培养基和本发明的举例PFM平行地进行。

人类精子制备

男性患者通过自慰产生人类精液。通过标准上游技术(swim-up technique)制备精子，偶尔使用密度梯度离心。在密度梯度程序中，将回收的离心沉淀(pellet)清洗两次，并重新悬浮在培养基中。精子制备物用试验或对照培养基(视情况适宜)加以制备。具体地说，在基本上无蛋白质的培养基(PFM-11)中制备用于ICSI或IVF的精子，用于考察蛋白缺乏对胚胎发育的影响的实验。收集的精子在5％CO₂气氛下37℃温育，直到使用。

卵巢刺激和卵母细胞获得

通过皮下注射促性腺激素释放激素激动剂(Buserelin；Suprefact；Hoescht，Frankfurt，Germany)诱导卵巢刺激，从黄体中期开始，直到月经或者实现下调。当子宫内膜厚度为4mm或更少，并且当血液雌二醇、黄体酮和LH水平达到基线值时，认为实现了下调。注射促卵泡(follicle)激素(FSH；Metrodin；Serono，Rome，Italy)三天，以引发卵泡募集(recruitment of follicles)。之后，根据患者的响应施用人绝经期促性腺激素(Pergonal 500；Serono，Rome，Italy)，以刺激卵泡发育。在卵泡大小达到16mm或者更大后，通过注射10,000IU人绒毛膜促性腺激素(hCG；Pregnyl；Organon，Oss，Holland)诱导排卵。36h后通过超声引导阴道抽吸(ultrasound guided vaginal aspiration)进行卵母细胞抽取(OR)。

授精和培养技术

在经过平衡和胚胎测试的(equilibrated and embryo tested)矿物油(M8410，Sigma Chemicals，and USA)下，卵母细胞用在经平衡的培养培养基微液滴中100,000个/mL的活动精子个别授精。受精的卵母细胞在含5％CO₂的空气的气氛下37℃培养。第二天早上，卵母细胞用剥露移液器(denuding pipettes)(

，MidAtlantic Diagnostics，USA)剥露。

胞质内精子注射(ICSI)

在一种可选择的程序中(用于例如克服人类男性因素生育率低下)，执行ICSI。通过暴露于透明质酸酶溶液30秒(80IU/mL；Cat No.10110010，Medi-Cult A/S，Parkalle 42，2100 Copenhagen，Denmark)制备用于ICSI的卵母细胞，然后转移到平衡的Medi-Cult^TM或本发明基本上无蛋白质的培养基中。将人类卵母细胞在含5％CO₂的空气的气相中于培养基中37℃温育5-7分钟，然后用剥露移液器(ART No.1670，International Medical Products BV，Zutphen，Holland)剥露。将剥露的人卵母细胞清洗，并最终在培养基中进一步温育30-60分钟。

使用商业上可得的ICSI移液器进行显微操作(注射针头，Cat No.130340B；手持移液器(holding pipette)，Cat No.13030013；Laboratoire CCD，60Rue Pierre Charron，75008Paris，France或注射针头，Cat.No.10-MIC；手持移液器，Cat.No.10-MPH-120；Humagen，Charlottesville，Virginia 22911，USA)。将5μL PVP(Cat No.1089001，Medi-Cult A/S，Denmark)超微液滴在一个培养皿(Cat No.1006，Falcon Plastics，Becton Dickinson，Rutherford，New Jersey，07070，USA)的中心薄薄展开。将展开的PVP用最多5个10μL HEPES缓冲的IVF培养基(Gamete-1009Scandinavian IVF Sciences AB，Gothenberg，Sweden)微液滴包围。将这些微液滴用经平衡和胚胎测试的矿物油(M8410，Sigma Chemicals，USA)覆盖。将精子制备物(1-2μL)加入到展开的PVP的中心。以常规方式进行成熟卵母细胞的ICSI(例如，Palermo等，1992所述)。

超微液滴培养

在事先充满平衡矿物油的4孔培养皿中制备培养基的超微液滴(UMD；1.5-2μL用于3-7个人类胚胎的培养)。将培养皿在含5％CO₂的空气中37℃温育。在预备试验中(preliminary experiment)，每天用精细拉制的巴斯德吸管(finely drawn out Pasteur pipette)用平衡的培养基更换培养基(UMD技术)，但在后来的实验中则培养3天后才更换(cUMD；或连续UMD)。

受精的确定

在ICSI或IVF后18h-20h确定受精。当可以见到两个迥然不同的原核时，认为卵母细胞已经受精。将受精的卵母细胞在5％CO₂气氛下在37℃平衡培养基的微液滴或超微液滴中培养。在24h后评估分裂和胚胎质量。

受精卵阻滞率(Zygote Arrest rate)

这个参数用于确定本发明的培养培养基是否导致发育在一细胞期发生停滞。培养基的效力可以用该测定方法加以确定。发育停滞于一细胞期的比例高，表明培养基有缺陷或效力低。

确定第二日分裂胚胎质量

采用两个参数确定第二日胚胎的胚胎质量，也就是：平均卵裂球得分和平均胚胎等级。它们如下确定：

因为大多数健康的第二日人类胚胎一般会达到四细胞期，平均卵裂球得分为4或者更高(范围在2-6)被认为是优秀的。胚胎根据1-4的级别进行分级，其中数字1表示质量差，4表示质量优秀。胚胎根据至少3个(但优选地4个)实验人员的结果综合进行分级。此外，还包含两个其它的参数用于确定卵裂期胚胎发育速率的差异。它们是：在人类研究中培养第二日(i)处于四细胞期或者更高阶段的胚胎的比例和(ii)等级为3或者更高的胚胎的比例。

培养基配方

这里描述的一种作为示例的本发明的基本上无蛋白质的培养基的配方如下。白蛋白，人们已经知道它是固定氮和营养物的来源，是一种抗氧化剂，还具有许多其它作用，包括膜稳定化。因此，本发明地基本上无蛋白质的培养基用其它培养基组分代替白蛋白，这些组分可以在培养中单独地或组合地发挥白蛋白的功能。用于这些目的的单个胚胎培养培养基组分包括氨基酸(包括但不仅限于丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸)、抗氧化剂和螯合剂(例如EDTA、还原性谷胱甘肽、生育酚)、替代能量源(例如果糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠)、渗透质(包括甘露醇和肌醇)、维生素(抗坏血酸、氰钴维生素、叶酸、生育酚等)和元素铁。

各个组分的支持最高卵泡发育的浓度被认为是最佳的。在本发明的研发过程中制备了三种培养基(ART-1、ART-2和ART-3)。本发明人先前描述了为了从培养培养基ART-1(Ali，1997；Ali et al.，2000)配制基本上无蛋白质培养基ART-7和ART-7b系列而进行的各种实验。本发明，PFM-11无蛋白质的培养基系列，是从培养基ART-3(Ali，1997；Ali et al.，2000)配制而得的。

PFM-11系列的各种培养基产品的最终配方在下面的表中列出。HEPES和碳酸氢盐在这些培养基制备物中的浓度有不同，本文对此进行了说明。

本发明的基本上无蛋白质培养基包括矿物盐、氨基酸、抗氧化剂、抗生素、能量组分和缓冲剂组分(HEPES和碳酸氢盐，用于在补充CO₂的条件下温育)，它们与市售的含蛋白质的培养基相似，但细节上不同。本发明的基本上无蛋白质的培养基独特地包含大分子物质(甲基纤维素和相关聚合物)，和任选的非代谢性糖醇(D-甘露醇)。

构成本发明基本上无蛋白质的培养基的大分子是具有化学式I的甲基纤维素：

其中，每个R独立地为CH₃或H，且n为大约34-大约43。

在上述甲基纤维素的化学式中，R可以是H或CH₃。甲氧基取代的范围是以重量计27.5-31.5％。取代度(Degree of substitution)(D.S.，连接于环羟基上的取代基团的平均数目)为1.5-1.9。这个范围提供最大的水溶性。甲氧基取代越低，在水中的可溶性越高，越优选。编码“n”指明聚合的水平，最好相当于14,000道尔顿的分子量，后者相关于(relating to)20℃下2％水溶液大约15cPS的粘度指数(具有这些规格的甲基纤维素可以从Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO USA购买；www.sigmaaldrich.com)；这相当于“n”值在大约34-大约43之间，优选地36-39。PFM中这一组分的范围是0.01-0.15g/L，最优选的范围是0.09-0.1g/L。最优浓度是0.1g/L。

甲基纤维素可以发挥抗氧化剂和渗透质的作用，它无毒、抗酶解并且不能渗透细胞(Stewart et al.，1995)。它有助于保护配子和胚胎免于环境侵扰，特别是自由基和渗透压改变的攻击。它保护细胞膜免于损伤，并有助于保持动态平衡。它还是一种表面活性剂和润滑剂。它有利于增加培养基的粘度，从而使配子和胚胎不会粘着于培养皿侧壁和吸管和导管的内部。这些物理性质是在没有血清蛋白质(这些功能通常由血清蛋白质来执行)的条件下提供的。该物质是惰性的并且对人类应用是安全的。

甲基纤维素在人类药品和食品工业中的其他方面使用已经超过25年，在人类或动物研究中均无任何副作用。FAO/WHO和EU的指令允许消费甲基纤维素，而且它已经在癌症研究中用作阴性对照，因为已知它是非致癌的。

甲基纤维素也在各种食品和化妆品中用作增稠剂(thickener)和乳化剂，并且可医用，例如用于治疗便秘。它不可消化、无毒并且不会引起过敏反应。它在药物/临床上是用作赋形剂和载体材料。它在滴眼剂中被用作膨胀剂(bulking agent)，还用作轻泻剂用于治疗功能性肠病的腹泻，控制回肠造口输出(ileostomy output)，和吸收可导致传染性腹泻的毒性物质的作用剂。它还是一种抗氧化剂。

本发明的基本上无蛋白质培养基还包括D-甘露醇。该化合物吸收差，在尿液中几乎没有任何变化地被排泄。作为抗氧化剂和渗透质，该物质能够保护胚胎免于有害环境作用的伤害。因此，它可以进一步部分地代替血清蛋白质，保护胚胎免于不良条件的伤害。有趣的是，D-甘露醇在体外即使是在培养基中存在蛋白质时也会对小鼠胚泡发育发挥积极的作用。

在本发明的作为示例的基本上无蛋白质的培养基(PFM-11)中，D-甘露醇的优选存在浓度为2.8微摩尔(最优选的浓度)，范围在0.056-6.9微摩尔之间。更优选的范围是1.4-5.5微摩尔；进一步更优选的范围是2.5-3.0微摩尔。最优选的浓度是大约2.7微摩尔。D-甘露醇的经验式是C₆H₁₄O₆，具有如下的结构式：

D-甘露醇是一种食品添加剂，在糕点、甜食和糖果中使用；比蔗糖甜，被认为是糖尿病患者的甜味剂替代品。它是渗透质和抗氧化剂。高浓度的D-甘露醇用于治疗急性中风已有超过30年的历史。高摩尔浓度的D-甘露醇被用于治疗严重的脑损伤和颅内压升高。它是一种利尿剂，用于在中毒事件中解毒(dieresis)，或者用于测量细胞外液空间。它还在哺乳动物包括人体内具有轻泻作用。在临床上应用D-甘露醇作为治疗剂时，没有报道它在人体内具有副作用。它在数种物种中也是无毒和非致突变的。D-甘露醇吸收差，并被排泄(Milde，1965；Widdowson and Dickerson，1965)。当培养基中包含该物质时，甚至在存在血清蛋白质的情况下也可增加小鼠胚泡发育，提示它作为抗氧化剂和渗透质在胚胎培养中有积极作用(Ali，unpublished observations)。其使用已经得到FDA和EU允许，并且FAO/WHO已经断定它对人类使用是安全的。

在本发明的溶液和配方中，具有化学式II的D-甘露醇的存在浓度为大约0.05微摩尔-大约6.9微摩尔。更优选的范围是1.4-5.5微摩尔。最优选的浓度时大约2.8微摩尔。

技术人员会意识到，血清蛋白质的作用是多方面的，在没有血清蛋白质时，一种或两种组分本身可能不能完全代替培养基中的蛋白质。因此，技术人员会认识到，本发明不是仅仅提供了补充有甲基纤维素和D-甘露醇的培养基，而是提供了这样的培养基，它们还含有由附加组分组成的复杂的混合物，这些组分优选地处于最佳浓度，并选择性地排除了已经证明对培养中的胚胎有害的通常使用的培养基组分。这些中的一些包括：

(i)包含独特浓度的两种氨基酸(L-牛磺酸和谷氨酰胺)，它们是营养和渗透平衡的主要提供者。这些氨基酸的提供浓度为1mM-30mM L-牛磺酸和1mM-50mM L谷氨酰胺，更优选地10mM-30mM L-牛磺酸和10mM-30mM L谷氨酰胺，最优选地L-牛磺酸和L谷氨酰胺分别为20mM。

(ii)包含导致人类胚胎发育停滞的可能性较低的任何一种或多种化合物(包括D-葡萄糖、果糖或丙酮酸盐)作为能量源。果糖的最佳浓度为大约0.5mM-6.0mM果糖，更优选的浓度为大约1mM-5.6mM，最优选的浓度为大约5.1mM。其余两种能量源的最佳浓度在本文的其它地方给出。

(iii)包含如下浓度的某些氨基酸。

(iv)包含如下浓度的水溶维生素。

名称最佳范围优选范围最优选浓度

(mM) (mM) (mM)

氯化胆碱 0.004-0.007 0.004-0.005 0.004

D-生物素 0.0024-0.004 0.0024-0.003 0.0024

叶酸 0.0014-0.0023 0.0014-0.0016 0.0014

肌醇 0.0067-0.011 0.0067-0.0078 0.0067

烟酰胺 0.005-0.008 0.005-0.0057 0.005

D-泛酸.1/2Ca 0.0025-0.004 0.0025-0.003 0.0025

吡哆醇HCl 0.003-0.005 0.003-0.0034 0.003

核黄素 0.00016-0.00027 0.00016-0.00019 0.00016

硫胺HCl 0.0018-0.003 0.0018-0.002 0.0018

维生素B12的范围如下：

(v)包含维生素E(维生素E 6型，Sigma Chemical Co.)，浓度为5微摩尔-20微摩尔，更优选地8微摩尔-12微摩尔，再更优选地10微摩尔。

(vi)不含L-天冬酰胺、L-天冬氨酸和L-丝氨酸，它们可能对受精卵和早期分裂期胚胎的发育有害。

(vii)不含元素铁，其可能对胚胎发育有害。

(viii)包含还原型谷胱甘肽(GSH)，浓度为60微摩尔-500微摩尔，更优选地250微摩尔-350微摩尔，再更优选地300微摩尔。

其它化合物

最终溶液中的浓度

^＊碳酸氢钠

在受精和培养培养基中：2.2g/L(26.2mM) 2.2g/L(26.2mM) 2.2g/L(26.2mM)

在配子操作培养基中： 2.2g/L(26.2mM) 2.2g/L(26.2mM) 2.2g/L(26.2mM)

在冲洗培养基中： 2.2g/L(26.2mM) 2.2g/L(26.2mM) 2.2g/L(26.2mM)

^＊＊HEPES

在受精和培养基中： 0mM

在配子操作培养基中： 15mM

在冲洗培养基中： 25mM

这里说明的PFM-11培养基系列与常规的胚胎培养基至少在如下方面中有不同：

1.不存在向培养基添加供体血清蛋白质——这消除了疾病传播的可能，使本发明的PFM-11培养基系列无危险。

2.存在甲基纤维素和D-甘露醇。

3.在氨基酸、抗氧化剂、维生素、能量源和矿物盐的种类和浓度方面对培养基的组成进行了改变，所有均是对胚胎培养最优化的。

对患者/卫生保健工作者的风险降低是在本发明培养基的优点之一。本发明的基本上无蛋白质培养基也是有利的，因为它降低了对暴露于该培养基的患者、其婴儿和卫生保健工作者的风险。尽管仍然存在一些风险，但是与通过使用本发明基本上无蛋白质的培养基而得以避免的感染风险相比，它们是次要的。这些风险包括对所用的组分过敏。发生过敏的机会很小，因为除抗生素之外的成分大多数是惰性和无反应性的。所有的成分均处于极小的浓度，不太可能引发过敏反应。

临床试验

一项关于移植在PFM-11培养基系列的最终配方中产生的胚胎的临床试验得到了批准。临床试验还研究了当通过常规的IVF或ICSI进行受精时PFM-11培养基系列的效力差异。

统计分析

统计学比较用2样本t-检验或二乘二表格(two by two table)执行。p值＜0.05或者更低被认为在统计学上有差异。

结果

同胞人类卵母细胞(Sibling Human Oocytes)通过常规IVF在PFM-11无蛋白质培养基和MediCult^TM胚胎培养培养基中授精时的培养特征

经过常规IVF后，同胞卵母细胞的受精率在对照MediCult^TM和PFM-11培养基中相似(表A)。配子阻滞的比例在对照MediCult^TM培养基(8.1％)中比在PFM中(2.2％)更高，但在统计学上并不显著。就卵裂球数目和等级而言，通过在PFM-11超微液滴中培养产生的分裂第2日人类cIVF同胞胚胎的质量显著优于在对照培养基中产生的同胞胚胎。在PFM-11培养基中，平均卵裂球数目为3.4，平均胚胎等级为3.1(n＝116)。在对照培养基(MediCult^TM)中，平均卵裂球数目相似(p＝0.865)，为3.4，平均胚胎等级显著降低(p＝0.001)，为2.7(n＝118)。达到≥4期的胚胎的比例在两个组中相似，但是等级超过≥3的胚胎比例在PFM-11无蛋白质组中显著更高。

表A：在无蛋白质PFM-11培养基中通过常规IVF产生的第二天人类同胞胚胎的质量

[胚胎等级：4＝优秀；3＝良好；2＝中等；1＝差]；对照胚胎由ICSI或IVF产生；Blast＝卵裂球；发现：测试培养基优于对照

同胞人类卵母细胞通过常规ICSI在PFM-11无蛋白质培养基和MediCult^TM胚胎培养基中授精时的培养特征

经过ICSI后同胞卵母细胞的受精率在PFM-11培养基中比在对照MediCult^TM培养基中统计学显著地升高(77.8％对69.4％，p＝0.043；表B)。配子期发育阻滞的比例，在PFM-11培养基中比在MediCult^TM培养基中更低，但该差异在统计学上并不显著(分别为2.8和6.3％，p＝0.088)。就卵裂球得分而言，通过在PFM-11超微液滴中培养产生的分裂第2日人类ICSI同胞胚胎的质量显著优于在对照培养基中产生的同胞胚胎(分别为3.8和3.3，p＝0.001)。在PFM-11培养基中产生的胚胎的平均胚胎等级与在对照培养基中产生的胚胎相似(2.9对2.8，p＝0.080)。达到≥4期的胚胎比例在两个组中相似，但是等级超过≥3的胚胎比例在PFM-11无蛋白质组中显著更高。

表B：在无蛋白质PFM-11培养基中通过ICSI产生的第二天人类同胞胚胎的质量。

[胚胎等级：4＝优秀；3＝良好；2＝中等；1＝差]；Blast＝卵裂球；对照胚胎由ICSI/IVF产生；发现：测试培养基优于对照

临床试验

与目前可得的含蛋白质胚胎培养基相比(对于所有年龄组的综合，怀孕率为33％，引自Ali，2004)，使用基本上无蛋白质的PFM-11培养基的常规IVF临床怀孕率在所有年龄组中提高到了50.％(14/28)，在年龄低于40岁的妇女中则高达53.8％(14/26)。使用基本上无蛋白质的PFM-11培养基的ICSI临床怀孕率也类似地在所有年龄组中增加到46.2％(12/26)，在年龄低于40的妇女中高达54.5％(12/22)。这个差异是统计学上显著的，其优势在本发明的基本上无蛋白质的PFM-11培养基一方，表明本发明的基本上无蛋白质培养基至少与目前市场上可得的商业含蛋白质培养基相当(并可能优于它们)。对于通过常规IVF在PFM-11培养基中产生的胚胎，来自这些胚胎的出生婴儿数目为12个(30.8％，即26名接受处理的妇女中有8人分娩；或者61.5％，13名怀孕的妇女中有6人分娩；一名孕妇失访)，通过ICSI也出生了12个婴儿(36％，即22名接受处理的妇女中有8人分娩；或者66.7％，12名怀孕的妇女中有8人分娩)。来自在本发明的PFM-11中产生的胚胎的出生婴儿外观正常、聪明、健谈并且活泼(根据父母报告)。这些统计数据从一个包含至少24个由此出生的孩子的样品中产生。

结果的意义

如果能提供化学限定培养基用于产生活的早期分裂阶段人类胚胎，可提高接受辅助生殖治疗(ART)的患者的安全性，因为，除了其它原因之外，这样可以从培养基中除去潜在有害的供体蛋白质。病原性疾病——特别是病毒性疾病，例如人类获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和肝炎，或者由血源产品中的朊病毒和其它病毒传播的Creutzfeldt-Jakob病(CJD)——的传播是人们非常关注的问题，这已经促使全世界有大量的胚胎学者去寻找供体蛋白质的代用品(但未成功)，用于他们的胚胎培养和操作程序。危险是千真万确的：过去曾有大约200名IVF患者在接受了在含有被乙肝病毒污染的混合血清的培养基中培养的胚胎后，发生了乙型肝炎流行(van Os et al.，1991)。最近，科学界面临着这样的难题，即必须通知他们的患者，用于胚胎培养和处理的市售培养基制剂可能被由后来死于CJD的人捐献的白蛋白所污染(Kemmann，1998)。

除了病原体和朊病毒之外，血清来源的血清或蛋白质，例如白蛋白，还可能含有细胞毒性因子，它们存在于例如患有子宫内膜异位、反复流产、和原因不明性不孕的患者中(Miller et al.，1995)。这些细胞毒性因子的本质仍然不明，但已经显示在体外对胚胎有害(Miller et al.，1995；Fein et al.，1995)。而且，血清或白蛋白的使用引起了可重复性的问题，因为人们已经熟知血清或白蛋白不同批次之间存在差异。如果不能控制不同批次血清的质量，就可能会影响所产生胚胎的质量。若使用化学限定性培养基代替含有供体蛋白质的培养基，则当然可以避免由血清蛋白质的质量导致的胚胎毒性和/或不可重复性的相关问题。

当在相似培养条件下进行时，在PFM-11培养培养基超微液滴培养条件下产生的胚胎的质量与在含有蛋白质的对照培养基中产生的胚胎的质量相似或者更好。更重要的是，在该新颖的、基本上无蛋白质的PFM-11培养基中产生的胚胎的受精率、配子阻滞和质量，就所有被测试参数而言，不劣于在含有蛋白质的对照培养基中观察到的结果。而反过来，已经证明在一些测试参数上对照培养基劣于PFM-11培养基。临床试验显示，对于第二日胚胎，PFM-11培养基与含有蛋白质的对照胚胎培养培养基同样有效或者效果更好。而且，PFM-11培养基是完全安全的，因为它没有生物来源的有害供体蛋白质。

在先前已经揭示，在微液滴中产生的胚胎的质量改善，是从胚胎释放到培养基中的某些生长因子的自分泌和旁分泌作用的结果(Paria and Dey，1990；Paria et al.，1991；Canesco et al，1992)。确实，已发现向培养基添加hIGF-1可提高人类胚胎植入前发育，特别是胚泡形成显著提高(Lighten et al.，1998)。最近人类胚胎的群体培养(communal culture)被报道可在人类辅助生殖中导致更高的植入和怀孕率(Almagor et al.，1996)。Kane等(1997)广泛地评述了生长因子在胚胎植入前发育中的作用。来自先前关于生长因子作用的研究的证据表明，在体外胚胎发育没有明显的清晰的生长模式(growth pattern)。自分泌生长因子可能对应激培养条件下的胚胎发育是至关重要的。可能对胚胎植入前发育具有积极作用的生长因子包括CSF-1；IGF-I；IGF-II；TGF-α，并可能有LIF。

在PFM-11中，发现人类卵母细胞与在PFM-11中制备的精子发生受精。获能(Capacitation)不受影响。这里显示，PFM-11可在培养基中不存在血清蛋白质的条件下有效促进受精。在使用PFM-11的常规IVF中的高受精率表明，培养基中蛋白质的缺如未妨碍精子的获能、受精，和体外胚胎发育，以及随后在子宫内的生存能力。尽管培养基中缺少蛋白质，但是仍然发生了精子获能、精子渗透进入卵母细胞和受精。

与对照(使用常规的含蛋白质培养基)相比，测试组(使用本发明基本上无蛋白质培养基)中的临床怀孕、分娩和流产率显著更好。另外，测试组中分娩的孕妇的比例与报道的分裂期胚胎移植的世界平均水平相似(DeMouzon and Lancaster，1997)。

这里公开的实验结果显示：(i)本发明的基本上无蛋白质培养基PFM-11对于精子在常规IVF期间渗透进入卵母细胞、配子间相互作用和随后依照常规IVF或ICSI进行的人体内受精均不会造成妨碍，(ii)所得的早期分裂期胚胎有活力，并且能够引发临床妊娠，(iii)在PFM-11中产生的早期分裂期胚胎的质量总体上相似于或略好于在含有血清蛋白质的对照培养基中产生的早期分裂期胚胎。

对动物来源制备物进行严格提纯和灭菌并不能切实无疑地排除传播未知病原体的可能性(Truyen et al.，1995)。现在利用基本上无蛋白质培养基配方，并用重组透明质酸酶如

代替透明质酸酶，就可能进行整个实验室辅助生殖程序，而不会有明显的向IVF患者传播疾病的风险。

总之，本发明基本上无蛋白质PFM-11培养基被证明是有效的，而且对常规IVF中精子对卵母细胞的渗透和按照ICSI或常规IVF的受精没有损害。当在PFM中产生的胚胎移植时，也不会影响怀孕，在39岁及以下妇女中，临床怀孕率超过50％。总体上，在产生活的人类胚胎方面，PFM-11培养基与含有血清蛋白质的培养基同等有效或者更优。在人类辅助怀孕程序中常规地使用PFM可能消除通过蛋白质结合的病原体或危险朊病毒传播疾病的潜在风险。本研究显示，在无细胞培养系统中的未添加蛋白质的培养基中，有可能产生活的人类胚胎。

本发明PFM-11的制备

基础盐溶液(BSS)储液1：

待使用的基础盐储液(基础盐溶液-BBS)的制备物是PFM培养培养基、配子操作培养基和冲洗培养基的最终配方。

	原料组分	量(g/L)
			1.	氯化钙·2H₂O	2.65(23.8mM)

2.	硫酸镁(无水)	0.9767(8.1mM)
			3.	氯化钾	4.0(53.7mM)
4.	氯化钠	69.53(1.2M)
			5.	磷酸二氢钠(无水)	1.22(10mM)
6.	D-葡萄糖	10.517(58.4mM)
			7.	酚红	0.11(0.31mM)
8.	WFI(注射用水)	950mL

制备程序：

1.在制备储液之前用WFI(注射用水，电阻率18.2兆欧)漂洗混合容器。

2.向1000mL WFI水添加组分1，因为它极其吸水(hydroscopic)。

3.按顺序添加组分2-7，不断混合，用WFI补足到1000mL的最终体积。

4.在所有溶质完全溶解后立即进行灭菌过滤。如果仍然存在溶质，则不要过滤。可以使用0.1微米滤器，但过滤期间应避免过高的压力。储液1可以用0.2微米滤器预过滤，再使用0.1微米滤器过滤。

5.过滤后应当没有沉淀物或浑浊(cloudiness)。

6.装入容积合适的容器例如瓶子中。

7.封盖瓶子(优选地是防拆封(tamper-evident)密封瓶)。

8.在2-6摄氏度避光保存。

存储和保存期限

在2-6摄氏度保存时，基础盐溶液(BSS)储液可稳定2个月。使用之前，总是要仔细检查储存的BSS储液是否有沉淀物或浑浊。如果储存期间出现沉淀物或溶液变浑浊，则丢弃之。

最终产品中BSS储液1的包含体积

当碳酸氢钠是配方(培养基产品)中主要的活性缓冲组分时，在每1000ml所制备的最终配方中必须存在70ml**BSS。

当HEPES是配方(精子/冲洗培养基产品)中主要的活性缓冲组分时，每1000ml所制备的最终配方中添加50mL BSS。

用BSS或WFI水调节最终培养基的重量克分子渗透浓度(osmolality)，以增加或降低(分别地)培养基的重量克分子渗透浓度：

如果当最终体积小于1000ml(即，在添加了BSS、BAAS和BVS后)时最终培养基的重量克分子渗透浓度为285mOsmol；则用WFI单独地稀释少量BSS。使用1体积BSS与9体积WFI水，得到工作BSS(WBSS)。调节WBSS的重量克分子渗透浓度到285mOsmol。用经过调节的WBSS使最终培养基的最终体积达到1000ml。

来自所有储液的最终配方的成分见储液4说明。

基础氨基酸溶液(BAAS)储液2：

本规程用于制备1升基础氨基酸储液(基础5氨基酸溶液——BAAS)，包含在PFM培养基、配子操作培养基和冲洗培养基的最终配方内。

试剂

	原料组分	量(g/L)
			1.	L-精氨酸HCl	1.26(6.0mM)
2.	L-胱氨酸(L胱氨酸.2HCl)^*	0.313(1.0mM)
			3.	L-组氨酸HCl.H2O	0.42(2.0mM)
4.	L-异亮氨酸	0.52(4.0mM)
			5.	L-亮氨酸	0.52(4.0mM)
6.	L-赖氨酸.HCl	0.752(4.1mM)
			7.	L-甲硫氨酸	0.15(1.0mM)
8.	L-苯丙氨酸	0.32(1.9mM)
			9.	L-苏氨酸	0.48(4.0mM)
10.	L-色氨酸	0.1(0.49mM)
			11.	L-酪氨酸(L-酪氨酸.2Na 2H₂O)^*	0.519(2.0mM)
12.	L-缬氨酸	0.46(3.9mM)
			13.	WFI(注射用水)	1000mL

用于制备储液2BAAS的说明

1.用WFI(注射用水，18.2兆欧电阻率)漂洗混合容器。

2.在400mL WFI中溶解组分1、2和4-11。

需要遵循供应商推荐的存储方法，因为在非最优条件下可能会发生溶解困难。如果出现沉淀，抛弃之，并用25mL 0.11N NaOH和275mL WFI从新开始。氢氧化钠只用作最后的选项。

3.L-组氨酸HCl-H₂O和L-缬氨酸可能难以溶解，这种情况下，可以通过使用1N HCl实现溶解。组分3和12应当分别溶解在300mL体积的WFI中。使用尽可能小体积的1N HCl以实现溶解。在300mL WFI中，1N HCl(经胚胎测试的)的最大量应当为25mL。避免将水、碱质和酸加热超过37摄氏度以溶解全部组分。

4.一旦组分3和12完全溶解，通过将一份200mL的在步骤2中制备的水溶氨基酸以分步方式逐渐加入如下溶液中，使最终体积达到1000mL：

(a)300mL L-组氨酸HCl.H₂O溶液，使总体积达到500mL。

(b)300mL L-缬氨酸溶液，使总体积达到500mL。

5.混合这两个500mL体积，以逐步的方式持续混合，以避免沉淀。

6.立即用0.2微米滤器无菌过滤该溶液。

7.装入合适容积的容器内(例如瓶子)。

8.封盖瓶子(优选防拆封密封瓶)。

9.在2-6摄氏度避光保存。

存储和保存期限

在2-6摄氏度保存时，基础氨基酸溶液(BAAS)储液可保持2个月。使用之前，总是要仔细检查储存的BAAS储液是否有沉淀物或浑浊。如果储存期间出现沉淀物或溶液变浑浊，则丢弃之。

最终产品中BAA储液的包含体积：

在所有最终配方的制备中，每1000ml应当使用10ml BAA储液。

使用L-酪氨酸.2Na 2H₂O和L-胱氨酸.2HCl是因为游离形式的L-酪氨酸和L-胱氨酸无市售。

基础维生素溶液(BVS)储液3

根据本实施例的方案制备1升基础维生素储液(基础维生素溶液——BVS)，用于包含在PFM培养基、配子操作培养基和冲洗培养基的最终配方内。

试剂

	原料组分	量(g/L)
			1.	氯化胆碱	0.1(0.7mM)
2.	D-生物素	0.1(0.4mM)
			3.	肌醇	0.2(1.1mM)
4.	烟酰胺	0.1(0.82mM)
			5.	D-泛酸	0.1(0.46mM)
6.	吡哆醇HCl	0.1(0.49mM)
			7.	核黄素	0.01(26.5μM)
8.	硫胺HCl	0.1(0.33mM)
			9.	叶酸	0.1(0.23mM)
10.	WFI(注射用水)	1000mL

用于制备储液3(BVS)的说明

1.在800ml WFI水(注射用水，18.2兆欧电阻率)溶解组分1-7。如果任何组分不溶，作为最后的选项，可以使用少量0.1N或1N NaOH实现溶解。

2.在2.5mL 0.1N NaOH中溶解组分8，并在连续搅拌下逐步小心添加到含组分1-7的800mL溶液中。

3.在连续搅拌下用WFI使体积达到1000mL，并立即用0.2微米滤器无菌过滤到合适的容器内(例如60mL Nalgene瓶、防拆封瓶)。

4.将瓶子封盖。

5.在-20摄氏度避光保存。

存储和保存期限

在-20摄氏度以60mL等份保存时，基础维生素溶液(BVS)储液可稳定2个月。使用之前，总是要仔细检查融化的BVS储液，看是否有沉淀物或浑浊。如果出现沉淀物或融化的溶液变浑浊，则丢弃之。

最终产品中BVS储液的包含体积：

在所制备的所有最终配方的制备中每1000ml应当使用6.0ml BVS储液，——见储液4。

储液4溶液和最终配方组合

储液4的制备允许最终添加该配方中特有的化学品，以及添加特定体积的来自储液1基础盐溶液(BSS)、储液2基础氨基酸溶液(BAAS)和储液3基础维生素溶液(BVS)的溶液。规程描述了所制备的培养基配方(即培养、配子操作和冲洗培养基)特有的缓冲液和抗生素的添加。

如下的方案制备1升培养培养基、配子操作培养基或冲洗培养基的最终配方。可以通过适当地放大所用量以制备更大的批次。

试剂

	原料组分	量(g/l)
			1.	丙酮酸钠	0.02975(0.27mM)
2.	果糖	0.92125(5.1mM)
			3.	甘氨酸	0.01875(0.25mM)
4.	谷胱甘肽(还原型)	0.09225(0.30mM)
			5.	D-甘露醇	0.0911(0.5mM)
6.	EDTA(四钠盐)	0.04175(0.10mM)
			7.	L-丙氨酸	0.04455(0.5mM)

用于制备储液4和最终配方组合的说明

1.用WFI(注射用水，18.2兆欧电阻率)漂洗混合容器。

2.在700mL WFI中溶解组分1-11，添加时不断搅拌。

3.添加组分12-15，用WFI补充到900mL，并继续搅拌。

4.根据基础配方类型(即PFM培养培养基、PFM配子培养基操作培养基和PFM冲洗培养基)的制备添加组分16-21。

5.调节全部三种培养基的重量克分子渗透浓度，用0.2微米孔径滤器分别过滤灭菌，也可以使用0.1微米滤器，但避免使用压力。如果过滤溶液需要高压，则不要使用0.1微米滤器。

6.立即灭菌过滤到最终包装(Nalgene瓶)内：

PFM培养基填充进入60mL瓶子

PFM配子操作培养基填充进入60mL瓶子

PFM冲洗培养基填充进入125mL瓶子。

(所用瓶子优选地是防拆封瓶子)

7.封盖瓶子。

8.给瓶子贴标签。

9.在2-6摄氏度避光保存。

储液4和最终配方组合的脚注

检查重量克分子渗透浓度。如果重量克分子渗透浓度高，则通过添加WFI纯水将之调节到285mOsmol。添加量的计算如下：

[培养基的重量克分子渗透浓度-期望的重量克分子渗透浓度(即285)/培养基的重量克分子渗透浓度]×培养基的体积

举例：如果培养基的重量克分子渗透浓度是300，培养基的体积是900ml，如上，那么如下所示进行计算：

[300-285/300]×900＝15/300×900＝45

因此，如果向培养基中添加45ml水，然后再次测量重量克分子渗透浓度，理论上，重量克分子渗透浓度将为大约285+/-2或3个单位。要非常小心，不要添加太多水，因为培养基中重要的成分会被稀释，将影响培养基的效力，甚至通过添加更多储液1BSS溶液恢复培养基的重量克分子渗透浓度也是如此。

然而，如果重量克分子渗透浓度低于285mOSmol，仅向培养基中添加储液1BSS，每ml储液1BSS可大约增加2-3mOSmol，但是这不可能总是能够预测。因此要非常小心，不要添加太多。一次添加一点，并测量重量克分子渗透浓度。

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Claims

1.一种用于人类生殖细胞的基本上无蛋白质的细胞培养基，其适用于供体外受精和其它辅助生殖技术用的人类生殖细胞的体外处理的全过程中，该培养基包含矿物盐、氨基酸、抗氧化剂、维生素、营养物、抗生素、D-甘露醇，和分子量为14,000道尔顿的甲基纤维素。

2.根据权利要求1的基本上无蛋白质的培养基，其中所述甲基纤维素具有这样的特征，使得2％溶液在25℃具有15厘泊的粘度。

3.根据权利要求1的基本上无蛋白质的培养基，其中所述甲基纤维素具有化学式I：

其中每一个R独立地为H或CH₃，n是数值为大约34-大约43的整数，并且其中甲氧基取代以重量计为27.5％-31.5％。

4.根据权利要求4的基本上无蛋白质的培养基，其中在化学式I的化合物的每个糖模块上搭接的CH₃取代基的平均数目为1.5-1.9。

5.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中所述甲基纤维素在溶液中以0.01g/L(0.71微摩尔)-0.5g/L(0.036mM)的浓度存在。

6.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中所述甲基纤维素在溶液中的存在浓度为0.01g/L(0.71微摩尔)-0.15g/L(0.00011mM)。

7.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中所述甲基纤维素在溶液中以大约0.1g/L(0.0071mM)的浓度存在。

8.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中所述氨基酸是L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-牛磺酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺或甘氨酸，或其任意组合。

9.根据权利要求8的基本上无蛋白质的培养基，其中氨基酸的存在浓度为：L-精氨酸HCl，大约0.018mM-大约0.18mM；L-胱氨酸.2HCl，大约0.0025mM-大约0.025mM；L-组氨酸HCl.H₂O，大约0.005mM-大约0.05mM；L-异亮氨酸，大约0.01mM-大约0.1mM；L-亮氨酸，大约0.01mM-大约0.1mM；L-赖氨酸·HCl，大约0.0125mM-大约0.125mM；L-甲硫氨酸，大约0.0025mM-大约0.025mM；L-苯丙氨酸，大约0.005mM-大约0.05mM；L-苏氨酸，大约0.01mM-大约0.1mM；L-色氨酸，大约0.00125mM-大约0.0125mM；L-酪氨酸.2Na2H₂O，大约0.005mM-大约0.05mM；L-缬氨酸，大约0.01mM-大约0.1mM；L-丙氨酸，大约1.0mM-大约10mM；L-牛磺酸，大约1.0mM-大约30mM；谷氨酸，大约0.01mM-大约1.0mM；L-谷氨酰胺，大约1.0mM-大约50mM；或者L-甘氨酸，大约0.1mM-大约1.0mM。

10.根据权利要求9的基本上无蛋白质的培养基，其中氨基酸的存在浓度为：0.5mM L-精氨酸；0.01mM L-胱氨酸.2HCl；0.02mM L-组氨酸；0.04mM L-异亮氨酸；0.04mM L-亮氨酸；0.05mM L-赖氨酸·HCl；0.01mM L-甲硫氨酸；0.02mM L-苯丙氨酸；0.04mM L-苏氨酸；0.005mM L-色氨酸；0.02mM L-酪氨酸.2Na2H₂O；0.04mM L-缬氨酸；0.5mM L-丙氨酸；20mML-牛磺酸；0.5mM L-谷氨酸；和20mM L-谷氨酰胺或者0.25mM L-甘氨酸。

11.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中构成该培养基的矿物盐是氯化钙、硫酸镁、氯化钾、氯化钠和磷酸钠。

12.根据权利要求11的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的矿物盐的存在浓度为：大约3.0mM(0.23g/L)-3.6mM(0.27g/L)氯化钙；大约0.7mM(0.086g/L)-大约0.81mM(0.098g/L)硫酸镁；大约4.7mM(0.35g/L)-大约5.4mM(0.4g/L)氯化钾；大约0.1M(6.12g/L)-大约0.12M(6.95g/L)氯化钠和大约0.89mM(0.107g/L)-大约1.0mM(0.122g/L)磷酸二氢钠。

13.根据权利要求12的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的矿物盐的存在浓度为：3.1mM(0.235g/L)氯化钙；0.72mM(0.087g/L)硫酸镁；4.8mM(0.355g/L)氯化钾；0.11M(6.171g/L)氯化钠；和0.88mM(0.108g/L)磷酸二氢钠。

14.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的维生素是氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、吡哆醇HCl、核黄素、硫胺HCl、叶酸、维生素B12、维生素E，或其任意组合。

15.根据权利要求14的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的维生素的存在浓度为：大约0.004mM(0.0005g/L)-0.005mM(0.0007g/L)氯化胆碱；大约0.0024mM(0.0006g/L)-0.0028(0.0007g/L)D-生物素；大约0.0067mM(0.0012g/L)-0.0078mM(0.0014g/L)肌醇；大约0.005mM(0.0006g/L)-0.0057mM(0.0007g/L)烟酰胺；大约0.0025mM(0.0005g/L)-0.003mM(0.0007g/L)D-泛酸；大约0.003(0.0006g/L)mM-0.0034mM(0.0007g/L)吡哆醇HCl；大约0.00016mM(0.00006g/L)-0.00019mM(0.00007g/L)核黄素；大约0.0018mM(0.0005g/L)-0.0021mM(0.0006g/L)硫胺HCl；大约0.0014mM(0.006g/L)-0.0016mM(0.0007g/L)叶酸；大约443pM(600ng/L)-885pM(1.2mg/L)维生素B12；和0.008mM(0.003g/L)-0.012mM(0.005g/L)维生素E。

16.根据权利要求15的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的维生素的存在浓度为：0.004mM(0.0005g/L)氯化胆碱；0.0024mM(0.0006g/L)D-生物素；0.0067mM(0.0012g/L)肌醇；0.005mM(0.0006g/L)烟酰胺；0.0025mM(0.0005g/L)D-泛酸；0.003(0.0006g/L)吡哆醇HCl；0.00016mM(0.00006g/L)核黄素；0.0018mM(0.0005g/L)硫胺HCl；0.0014mM(0.006g/L)叶酸；616pM(800ng/L)维生素B12；和0.010mM(0.004g/L)维生素E。

17.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的营养物是D-葡萄糖、丙酮酸盐(或酯)、果糖、乳酸，或其任意组合。

18.根据权利要求17的基本上无蛋白质的培养基，其中构成所述培养基的营养物的存在浓度为4.3mM(0.78g/L)D-葡萄糖；0.3mM(0.02975g/L)丙酮酸钠；5.1mM(0.92g/L)果糖和10mM(1.13g/L)乳酸钠。

19.根据权利要求18的基本上无蛋白质的培养基，其中D-葡萄糖的存在浓度为3.0mM(0.75g/L)-5.6mM(1.0g/L)。

20.根据权利要求19的基本上无蛋白质的培养基，其中果糖的存在浓度为1mM(0.18g/L)-5.6mM(1.01g/L)。

21.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中溶液中的抗氧化剂是谷胱甘肽。

22.根据权利要求21的基本上无蛋白质的培养基，其中谷胱甘肽的浓度为大约0.25mM(0.077g/L)-0.35mM(0.11g/L)。

23.根据权利要求22的基本上无蛋白质的培养基，其中谷胱甘肽的浓度为0.3mM(0.092g/L)。

24.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，进一步包含EDTA。

25.根据权利要求24的基本上无蛋白质的培养基，其中EDTA的浓度为大约0.1mM(0.0416g/L)-0.103mM(0.043g/L)。

26.根据权利要求25的基本上无蛋白质的培养基，其中EDTA的浓度为0.1mM(0.0418g/L)。

27.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，进一步包含HEPES。

28.根据权利要求27的基本上无蛋白质的培养基，其中HEPES的浓度为15mM(3.6g/L)或25mM(5.96g/L)，并且D-葡萄糖的浓度为大约3.3mM(0.59g/L)-大约3.6mM(0.65g/L)。

29.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，进一步包括酚红或其它pH指示剂。

30.根据权利要求29的基本上无蛋白质的培养基，其中酚红的浓度为0.031mM(0.011g/L)。

31.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中溶液中存在浓度为大约1.5mg/L-大约4mg/L的硫酸庆大霉素。

32.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中存在浓度为75mg/L的青霉素G。

33.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，其中存在浓度为大约0.056微摩尔-大约6.9微摩尔的D-甘露醇。

34.根据权利要求33的基本上无蛋白质的培养基，其中存在浓度为2.8微摩尔的D-甘露醇。

35.根据权利要求1、2、3或4的基本上无蛋白质的培养基，进一步包含碳酸氢钠。

36.根据权利要求35的基本上无蛋白质的培养基，其中碳酸氢钠的存在浓度为26.2mM(2.2g/L)。

37.根据权利要求36的基本上无蛋白质的培养基，其中碳酸氢钠的存在浓度为4.0mM(0.336g/L)-26.2mM(2.2g/L)。

38.培养基在辅助生殖技术中的应用，包括使用权利要求36的基本上无蛋白质的培养基处理人生殖细胞的步骤。

39.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用，其中所述基本上无蛋白质的培养基是权利要求36的培养基。

40.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用，其中所述人类生殖细胞是未受精卵。

41.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用，其中所述人类生殖细胞是多个精子。

42.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用，其中所述人类生殖细胞是受精卵。

43.根据权利要求38的培养基在辅助生殖技术中的应用，其中该培养基专门用于子宫内授精。

44.根据权利要求1的用于人类生殖细胞的基本上无蛋白质的细胞培养基，其是从矿物盐、氨基酸、抗氧化剂、维生素、营养物、抗生素、D-甘露醇和分子量为14,000道尔顿的甲基纤维素的至少一种或多种储液制备的，其中将所述储液用水稀释以形成基本上无蛋白质的细胞培养基。

45.一种用于人类生殖细胞的基本上无蛋白质的细胞培养基，其适用于供体外受精和其它辅助生殖技术用的人类生殖细胞的体外处理的全过程中，所述培养基包含0.5mM L-精氨酸；0.01mM L-胱氨酸.2HCl；0.02mM L-组氨酸，0.04mM L-异亮氨酸；0.04mM L-亮氨酸；0.05mM L-赖氨酸.HCl；0.01mM L-甲硫氨酸；0.02mM L-苯丙氨酸；0.04mM L-苏氨酸；0.005mM L-色氨酸；0.02mM L-酪氨酸.2Na2H₂O；0.04mM L-缬氨酸；0.5mM L-丙氨酸；20mM L-牛磺酸；0.5mM谷氨酸(0.39mM)；20mM L-谷氨酰胺或0.25mML-甘氨酸；3.1mM(0.235g/L)氯化钙；0.72mM(0.087g/L)硫酸镁；4.8mM(0.355g/L)氯化钾；0.11M(6.171g/L)氯化钠；0.88mM(0.108g/L)磷酸二氢钠；0.004mM(0.0005g/L)氯化胆碱；0.0024mM(0.0006g/L)D-生物素；0.0067mM(0.0012g/L)肌醇；0.005mM(0.0006g/L)烟酰胺；0.0025mM(0.0005g/L)D-泛酸；0.003(0.0006g/L)吡哆醇HCl；0.00016mM(0.00006g/L)核黄素；0.0018mM(0.0005g/L)硫胺素HCl；0.0014mM(0.006g/L)叶酸；616pM(800ng/L)维生素B12；0.010mM(0.004g/L)维生素E；4.3mM(0.78g/L)D-葡萄糖；0.3mM(0.02975g/L)丙酮酸钠；5.1mM(0.92g/L)果糖；10mM(1.13g/L)乳酸钠；0.3mM(0.092g/L)谷胱甘肽；0.1mM(0.0418g/L)EDTA；0.031mM(0.011g/L)酚红；2.8微摩尔D-甘露醇；26.2mM(2.2g/L)碳酸氢钠；75mg/L青霉素G；和1.5mg/L硫酸庆大霉素。

46.权利要求45的基本上无蛋白质的细胞培养基，其中硫酸庆大霉素的浓度为4mg/L。

47.权利要求45的基本上无蛋白质的细胞培养基，其中D-葡萄糖的浓度为3.3mM(0.59g/L)-大约3.6mM(0.65g/L)，并进一步包含15mM(3.6g/L)HEPES。

48.权利要求45的基本上无蛋白质的细胞培养基，其中D-葡萄糖的浓度为3.3mM(0.59g/L)-大约3.6mM(0.65g/L)，并进一步包含25mM(5.96g/L)HEPES。

49.权利要求46的基本上无蛋白质的细胞培养基，其中D-葡萄糖的浓度为3.3mM(0.59g/L)-大约3.6mM(0.65g/L)，并进一步包含15mM(3.6g/L)HEPES。

50.权利要求46的基本上无蛋白质的细胞培养基，其中D-葡萄糖的浓度为3.3mM(0.59g/L)-大约3.6mM(0.65g/L)，并进一步包含25mM(5.96g/L)HEPES。