CN101939335A - 抗软骨退变的抗原结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够渗入软骨的抗原结合多肽。所公开的多肽、组合物和方法适合于软骨退变的治疗、预防和/或进展的延迟。

Description

抗软骨退变的抗原结合多肽
技术领域
本发明涉及抗软骨退变的药剂。
背景技术
关节软骨由包埋在细胞外基质中的软骨细胞组成。所述基质主要由水组成并且还包含I I型胶原和聚集蛋白聚糖(一种软骨特异性蛋白聚糖)。胶原部分赋予软骨以抗张强度(tensile strength)，而蛋白聚糖部分吸收水分，从而提供抗挤压和分配负荷的能力。
在许多病状(其中有骨性关节炎(0A))中观察到软骨退变。退变由许多细胞因子、生长因子和蛋白酶驱动。最初，可在关节表面上观察到以导致裂缝出现的原纤维变性(fibrillation)的形式表现的退变。然后，观察到软骨厚度的渐进损失，这是由蛋白聚糖-透明质酸复合物的过度分解代谢引起的。退变由金属蛋白酶例如糖苷酶和己糖胺酶催化(参见例如US2007197471)。最后，胶原网络被攻击。可观察到正反馈回路，其中基质分子的降解产物刺激降解。针对提及的反馈回路的细胞响应牵涉已知诱导基质金属蛋白酶的表达的细胞因子例如IL-1和TNFα的产生(参见Goldring 2000，Arthritis & Rheumatism第43卷pp1916-1926；Kobayashi，M.等人(2005)：Role of Interleukin-1andTumor Necrosis Factor α in matrix degradation of humanosteoarthritic cartilage.Arthritis & Rheumatism，第52卷(1)，pp.128-135；和Gerwin，N.等人(2006)，Adv.Drug Delivery Rev.58，pp.226-242)。
Kobayashi，M.等人(2005)在体外显示IL-1和/或TNFα的抑制阻止了OA软骨中II型胶原和蛋白聚糖的降解(参见Kobayashi，M.等人(2005)：Role of Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor α inmatrix degradation of human osteoarthritic cartilage.Arthritis& Rheumatism，第52卷(1)，pp.128-135)。因此认为，退变的调控和细胞外基质的降解可导致关节疾病的治疗(参见EP1547617)。
OA，也称为退行性关节炎，是欧洲、美国和日本最常见类型的关节炎和残疾的首要原因，据估计存在36-48％的群体流行率。由于老年人的比例日益增加以及OA的其他危险因素(例如，肥胖症和懒散的生活方式)的日益增加的发生率，预期所述数量将增加(Gerwin，N.等人(2006)，Adv.Drug Delivery Rev.58，pp.226-242)。尽管对有效的OA治疗存在日益增加的需要，但目前的疗法只可治疗体征和症状，即疼痛的减轻，但不能治疗关节软骨的根本结构变化。目前的疗法包括简单的镇痛药、非甾体类消炎药或关节内注射的糖皮质激素和透明质酸制剂的施用。因此，存在对治疗OA的巨大的未满足的医疗需要。
使软骨退变的治疗更复杂的一个因素是，关节软骨是无血管和无淋巴的；因此，分子，例如营养物或药物，必须能够通过致密的软骨基质从滑液扩散至到达软骨细胞(Gerwin，N.等人(2006)，Adv.Drug Delivery Rev.58，pp.226-242)。已研究了溶质，特别是大分子(其中有IgG抗体)通过软骨的渗透性(Maroudas A.，(1976)，J.Anat.122(2)，pp.335-347)。发现随着溶质的大小增加，分配系数急剧下降；因而，较大分子的穿过受到基质网络的孔径大小限制，从而，强烈依赖于糖胺聚糖的局部浓度。关于不同大小和不同pI的蛋白质在关节软骨中的渗透和驻留的另外的工作已由van Lent和同事进行。他们发现，与阴离子蛋白相比较，阳离子蛋白在关节软骨中的渗透和驻留要显著得多(van Lent，P.L.E.M.等人(1987)，J.Rheumatol.14(4)，pp.798-805)。由vant Lent等人进行的小鼠体内研究很大程度上确认了他的早期发现(van Lent，P.L.E.M.等人(1989)，J.Rheumatol.16(10)，pp.1295-1303)。他发现，特定蛋白质越小并且阳离子性程度越高(高pI)，软骨渗透就越好。在另一方面，对于大的阳离子性蛋白质，软骨驻留最明显，这表明此类蛋白质有效地结合带负电荷的软骨成分糖胺聚糖(GAG)，然而通过小的阳离子性蛋白进行的软骨结合效率要低得多。发现体外高度阳离子性蛋白的软骨渗透的上限为240kDa至440kDa。下列实例指示了软骨渗透的pI的重要性。测试具有不同pI值的IgG抗体(150kDa)的3个不同形式。pI为9.0的经工程改造的IgG变体深深地渗透入软骨，而对pI值为7.0-8.0的天然IgG未检测到渗透；对pI为4.5的第三变体不再检测。对于BSA(67kDa)，pI 8.5-9.0的变体导致软骨的深度渗透，pI7.0-8.0的变体驻留在软骨表面，天然的pI为4.5的变体不显示任何可检测信号(van Lent，P.L.E.M.等人(1987)，J.Rheumatol.14(4)，pp.798-805)。
本发明的公开内容
因此，本发明的一个目的是提供抗软骨降解，特别地用于治疗骨关节炎的药剂。
本发明提供了用于软骨退变和与其相关的任何病症的治疗、预防和/或进展的延迟的抗原结合多肽，其中所述多肽能够渗入软骨。
已令人惊讶地发现，特异性抗原结合多肽，特别是单链抗体，能够以有效地方式渗入软骨，在软骨中它们可结合软骨基质中的靶蛋白，例如细胞因子、细胞因子受体或金属蛋白酶。在结合靶分子后，可在它们的产生部位阻断它们的生物学功能，从而可减少和/或抑制软骨退变。因此，本发明的多肽能够以直接的方式作用于特定靶分子。通过向多肽中加入正电荷，可增加在软骨内的驻留时间，从而允许与靶蛋白进行更长时间的接触。
此外，由于更大的分子不能渗透软骨基质，因此与更大的蛋白质分子相比较，本发明的药剂在施用后可获得更大体积的分配。
本发明还提供了所述抗原结合多肽用于软骨退变，特别是骨关节炎的治疗、预防和/或进展的延迟的用途。
本文中公开的抗原结合多肽还可用于软骨退变的体外诊断剂和/或体内诊断剂。
此外，本发明包括含有本文中公开的抗原结合多肽的组合物和所述组合物用于软骨退变和与其相关的任何病症(特别是骨关节炎)的治疗、预防和/或进展的延迟的用途。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗软骨退变的方法，其中局部施用，特别地通过关节内施用来施用抗原结合多肽。
附图概述
当考虑下列其详细描述时，将更好地理解本发明并且除了上文所示的目的外的目的将变得显然。此类描述参考附图，其中：
图1：体外软骨渗透实验的实验装置的示意图。描述下列组件：泵(1)，试管系统，箭头指示流动方向(2)，缓冲液池(3)，具有：装有FITC标记探针的贮液池(4)和通流室(flow through chamber)(5)的扩散室，被夹至渗透室(6)的软骨(关节表面向上(朝向探针贮液池))。大箭头指示FITC标记分子渗透入和穿过软骨。
图2：稀释(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16)用于软骨渗透的FITC标记蛋白，并将所述蛋白点在载玻片上以在紫外光下测定信号强度。
图3：通过在紫外光下拍摄的软骨切片的图像显示在指定的时期后ESBA105-FITC和英夫利昔单抗
Figure BPA00001189604900041
-FITC至软骨内的渗透.
图4：在用FITC-标记的TNF-α抑制剂温育后在离牛软骨的顶部表面确定的距离处的荧光强度。
图5：在以大约1000mcg/动物的剂量水平单次静脉内(A)或单次关节内(B)施用[125I]-ESBA105后，雄兔子的腿中放射性浓度的比较。注意，对于关节内给药后的关节软骨，在6小时的时间点未获得定量的范围内的值。因此，对于该组织在图中未划出连续线。
图6：在静脉内和关节内注射[125I]-ESBA105后，至膝关节组织的生物分布。在关节内(虚线)和静脉内(实线)注射后血浆中[125I]-ESBA105水平的时间进程。
图7：从TNF-α诱导的细胞凋亡拯救L929小鼠成纤维细胞。将通过放线菌素D的存在致敏的L929小鼠成纤维细胞暴露于不同浓度的ESBA105或英夫利昔单抗与rhTNF-α(终浓度100pg/ml)的预温育混合物。与英夫利昔单抗相似，ESBA105以剂量依赖性的方式阻断TNF-α的促凋亡效应。ESBA105的效力与英夫利昔单抗几乎完全相同，如分别由12.5ng/ml(对于ESBA105)和14.0ng/ml(对于英夫利昔单抗)的EC50值所确定的。
图8：大鼠单关节炎模型中关节内ESBA105的抑制：关节内注射的ESBA105和英夫利昔单抗分别对通过关节内注射10μg rhTNF-α诱导的急性单关节炎的抑制性潜能的比较。评价了对关节肿胀(通过使用测径器定量)、滑膜炎(HE染色；也参见B)和葡聚糖蛋白损失(甲苯胺蓝染色；也参见B)的作用。
图9：大鼠单关节炎模型中关节内ESBA105的剂量响应：分别为ESBA105和英夫利昔单抗的体内剂量响应。未显示关于滑膜炎和蛋白聚糖损失的数据。
图10：在第5天，使用FW2.3或20ug/ml或100ug/ml ESBA105处理的软骨培养物的上清液中MMP的活性。与同种型对照相比较，使用ESBA105治疗人骨关节炎软骨外植体显著降低了MMP的活性。通过将对照条件(FW2.3)设置为100％来分别标准化各患者的绝对值。*p＜0.05。在图下面的表格行中给出了对于各培养条件MMP活性的绝对平均值。
图11：所有时间点的汇集培养基中的PGE2。ESBA105的两个浓度都显著降低软骨培养物的上清液中PGE2的水平。通过将对照条件(FW2.3)设置为100％来分别标准化各患者的绝对值。*p＜0.05。在图下面的表格行中给出了各培养条件中测量的PGE2水平的绝对平均值。
用于进行本发明的模式
下面将更详细地描述本发明。要理解可随意组合不同的实施方案、优选方式和范围。此外，取决于特定的实施方案，选择的定义、实施方案或范围可能不适用。
在本发明的范围内，使用下列定义：
术语“抗原结合多肽”是指天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物特异性结合抗原的能力。此类多肽包括对选择的抗原具有足够的结合能力的全长抗体的任何抗原结合片段或单链。由本发明包括的抗原结合片段的实例包括Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段；单结构域或dAb片段、分离互补决定区(CDR)；两个或更多个可任选地通过合成的连接体连接的分离CDR和单链可变片段(scFv)的组合。“全长抗体”包括嵌合抗体，其中将一个来源的抗原结合可变结构域偶联至不同来源的恒定结构域，例如将鼠抗体的可变结构域Fv偶联至人抗体的恒定结构域Fc。使用本领域技术人员已知的常规技术获得上文例举的抗体和抗体片段，以与对于完整抗体的方式相同的方式就有用性筛选片段。术语抗原结合多肽还包括基于在本领域内熟知的备选支架的抗原结合多肽，包括但不限于CTLA-4、淀粉酶抑肽(tendamistat)、纤连蛋白(FN3)、新制癌菌素、CBM4-2、脂运载蛋白、T细胞受体、蛋白A结构域(蛋白Z)、Im9、设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、设计的TPR蛋白、锌指pVIII、禽类胰腺多肽、GCN4、WW结构域、Src同源结构域3(SH3)、Src同源结构域2(SH2)、PDZ结构域、TEM-Iβ-内酰胺酶、GFP、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酶、PHD-指、CI-2、BPT1 APPI、HPSTI、大肠杆菌素(ecotin)、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防卫素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b562、Ld1受体结构域A、γ-晶状体蛋白、泛素、转移和C-型凝集素-样结构域(参见Binz等人(2005 Oct)Nat Biotech23(10)：1257-68)。在本文中公开的方法和组合物的优选实施方案中，抗原结合多肽是单链抗体。
可使用重组遗传学领域的常规技术产生本发明的抗原结合多肽。已知多肽的序列，可通过基因合成产生编码它们的cDNA。
可以用例如放射性标记或用荧光剂标记，或通过例如PEG化化学修饰本文中公开的抗原结合多肽。
可通过许多方法测量“软骨退变”。在使用软骨外植体培养物进行的临床前实验中，可在应用治疗之前通过称取外植体的重量，和通过测定释放入培养基的糖胺聚糖(GAG)的量和驻留在软骨中的GAG含量来直接测量胶原和/或蛋白聚糖的损失。此外，特定细胞因子例如IL-1和TNFα的表达特征谱可提供炎症/分解代谢过程的指示。胶原分解可通过测量释放入培养基的胶原降解产物CTX-II来测定。基质金属蛋白酶(MMP)表达或活性或前列腺素E2(PGE2)浓度的测量是软骨退变的间接指示剂。CTX-II还可用作人类软骨退变的生物标志物。可利用商业试剂盒(例如CTX-II-Urin
Figure BPA00001189604900071
，Human from OSTEO medical GmbH，Bunde，Germany)在尿中对其进行测量。目前用于评价人类软骨退变的标准方法是X射线，然而可预见该方法将被磁共振成像(MRI)取代。MRI允许定量关节软骨体积和形态(Peterfy，CG等人(2006)Os teoarthritis andCartilage，第14卷，pp A95-A1I1)。抗原结合多肽的治疗有效量是指治疗、改善或预防疾病或病症或展示可检测的治疗或预防效果所需的量。
术语“药物制剂”是指可给受试者施用并且使抗原结合多肽的生物学活性保持明确有效，以及不包含另外的有毒成分的制剂。药学上可接受的赋形剂(媒介物、添加剂)是可适度地给受试哺乳动物施用以提供有效剂量的使用的活性成分的赋形剂。
在第一方面，本发明提供了用于软骨退变的治疗、预防和/或进展的延迟的抗原结合多肽，其中所述多肽能够渗入软骨。
在优选实施方案中，多肽是单链抗体。
可以例如通过利用实施例1中描述和图3中显示的实验装置对软骨外植体使用标记的抗原结合多肽来体外测量软骨渗透。备选地，可利用放射性标记的蛋白质评价软骨渗透(参见，例如，van Lent，P.L.E.M.等人(1987)，J.Rheumatol.14(4)，pp.798-805)。放射性标记也适合用于体内测定软骨渗透，如实施例2或van Lent，P.L.E.M.等人(1989)，J.Rheumatol.16(10)，pp.1295-1303中描述的。
在另外的优选实施方案中，根据Atha和Ingham(1981)的方法测量的本发明的多肽的溶解度是至少5mg/ml，更优选至少10mg/ml，和最优选至少20mg/ml。
特别地，稳定且可溶的抗体，优选具有WO 03/097697中描述的稳定和可溶性的构架的单链抗体是有利的，因为可获得高度浓缩的制剂；这样，可使用较小的应用体积。提及的稳定且可溶的抗体具有一个或多个下列特征：
-其在还原条件下是稳定的，如在WO 01/48017中公开的酵母相互作用分析(所谓的质量对照系统)中测量的，
-在20℃至40℃，优选在37℃在PBS中至少在1个月内是稳定的，优选至少2个月，最优选至少6个月，
-其在生理条件下保持单体状态，
-其在大于大约1mg/ml，优选大于大约4mg/ml，更优选大于大约10mg/ml，甚至更优选大于大约25mg/ml和最优选大于大约50mg/ml的浓度在环境温度在PBS中是可溶的，
-其在盐酸胍滴定中显示了转换中点(midpoint of transition)为至少1.5M，优选至少1.75M，更优选至少1.9M，最优选至少2M，即对变性具有抗性。
在优选实施方案中，多肽具有至少10kDa并且低于50kDa的分子量。优选，多肽具有大约26-27kDa的分子量。
此外，多肽优选特异性结合细胞因子或细胞因子受体。更优选所述细胞因子或细胞因子受体是促炎性的。所述促炎细胞因子优选是TNFα或白细胞介素，例如，IL-1或IL-6，或特异于任何所列细胞因子的结合的任何细胞因子受体。在另一个优选实施方案中，多肽特异性结合软骨蛋白聚糖降解酶。此类酶包括蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP)。通过靶分子的特异性结合，可调控和/或阻断它们在软骨退变中的生物活性。
在另一个优选实施方案中，抗原结合多肽包含与SEQ.ID.No.1具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性和最优选至少99％同一性的可变轻链VL；和/或与SEQ.ID.No.2具有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性和最优选至少99％的同一性的可变重链VH。
在另一个优选实施方案中，多肽具有与序列SEQ.ID.No.3至少90％的同一性，更优选95％和最优选100％的同一性。
本发明的序列是：
SEQ ID No：1ESBA105的VL
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKR
SEQ ID No：2ESBA105的VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYT FTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No：3ESBA105
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
两个序列之间的百分比同一性是在考虑为了进行两个序列的最佳比对而需引入的缺口的数目和各缺口的长度的情况下，由序列共有的相同位点的数目的函数。序列的比较和两个序列之间百分比同一性的测定可使用对于本领域技术人员来说是熟知的数学算法来完成。本文中提及的同一性可使用可在国际互联网上获得的BLAST程序(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；参见Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)″Basic local alignment search tool.″J.MoI.Biol.215：403-410)来测定。可使用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索以将氨基酸序列与本发明的蛋白质分子相比较。为了获得带缺口的比对来进行比较目的，可以利用Gapped BLAST，如Altschul等人，(1997)NucleicAcids Res.25(17)：3389-3402中所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
在另一个优选实施方案中，渗透效率取决于抗原结合多肽的大小和所述多肽的pI与软骨或给药部位中发现的pH的对比。例如，健康膝关节中的pH是大约7.4。在发炎的关节中，pH可下降至大约7。优选，抗原结合多肽的pI高于7.0，更优选高于7.4和最优选其为7.8或更高。
在另一个优选实施方案中，将抗原结合多肽用于制剂，所述制剂为抗原结合多肽提供总体正电荷以促进软骨渗透并最优化软骨驻留。
在第二方面，本发明提供了公开的抗原结合多肽用于软骨退变，特别是骨关节炎的治疗、预防和/或进展的延迟的用途。
本文中公开的抗原结合多肽还可用于软骨退变，特别是骨关节炎的体外诊断和/或体内诊断。
在另一个方面，抗原结合多肽可用于产生用于软骨退变特别是骨关节炎的治疗、预防和/或进展的延迟的药物或作为用于软骨退变特别是骨关节炎的的检测的体外诊断试剂。
此外，本发明包括含有本文中公开的抗原结合多肽的组合物。组合物优选是药物组合物，并且还可包含药学上可接受的载体或一种或多种另外的有效试剂。
在优选实施方案中，组合物的抗原结合多肽是scFv并且特异性结合TNFα。可在抗原结合多肽掺入组合物之前将其经历冷冻干燥。优选，组合物是水性制剂。可通过将多肽溶解在pH被缓冲的溶液中来制备所述水性制剂，其中缓冲剂具有高于6.0的pH，优选pH在6.0以上至7.8的范围内。可将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例包括有机酸缓冲剂例如醋酸盐(例如，醋酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸和柠檬酸盐。
可对许多不同的受试者，优选温血动物，更优选哺乳动物，包括人和非人动物例如大鼠、小鼠、兔子、狗、马、牛施用本发明的抗体和组合物。在本文中公开的方法、抗原结合多肽和/或组合物的优选实施方案中，受试者是人。
本文中公开的方法、抗原结合多肽和/或组合物的施用方式优选是非肠道，最优选关节内施用。
由本发明公开的在哺乳动物中进行的实验(参见实施例1)显示在关节内施用本发明的抗原结合多肽后，多肽以比静脉内途径应用后有效得多的方式渗透入软骨(参见图5A和B)。在血浆中，本发明的抗原结合多肽的测量的最大浓度(Cmax)在关节内施用后比在静脉内施用后的更低。在特定的实验设置中，差异为10倍。此外，在关节内施用后数小时血浆中Cmax达到峰值，这表明从关节内注射部位进入循环的相对较慢的吸收，这与持续释放作用相当。这些发现验证了抗原结合多肽的局部施用优于全身性施用的假说，因为在注射部位，观察到多肽的更高的局部浓度以及观察到延迟的至血浆内清除。此外，在关节内施用后，与静脉内施用相比较，多肽的全身性暴露更低，这减少了潜在的全身性不利反应。
优选，选择本文中公开的多肽和/或组合物以便在关节内施用后，血浆中多肽的峰浓度Cmax降低至静脉内注射后的大约1/10，优选低于静脉内注射后的1/10。此外，选择多肽和/或组合物以便在关节软骨中，在关节内施用后所述多肽的峰浓度Cmax优选比静脉内注射后的至少高40倍，优选比静脉内注射后的至少高45倍。优选，对于关节内施用，与本文中公开的多肽或组合物的静脉内施用相比较，基于AUCO-6的关节软骨中多肽的暴露高出大约135倍和/或AUCO-240高出150至500倍。如上所提及的，优选选择抗原结合多肽以便其具有高于7.0的pI，和/或选择组合物以使其具有为抗原结合多肽提供总体正电荷的配方。
可按照本领域内已知的用于制造药物组合物的任何方法制备意欲用于非肠道和/或关节内使用的组合物，除了本发明的有效物质外，所述组合物还可包含一种或多种试剂例如防腐剂和/或佐剂。组合物可在混合物中包含活性成分和合适的生理上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括，例如，惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、成粒剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶)和润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。
在一个优选实施方案中，组合物包含具有止痛和/或消炎特性的多肽。当多肽特异性结合TNFα时，情况尤其如此。在一个特别优选的实施方案中，组合物还包含除了本文中描述的多肽外的止痛药和/或非甾体类消炎药。
在另一个优选实施方案中，组合物包含透明质酸和/或关节内注射的糖皮质激素。
优选以稳定的方式配制本文中公开的组合物。稳定制剂是这样的制剂：其中的抗原结合多肽在贮存后基本上保持其生物活性，优选其物理稳定性和/或化学稳定性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域内是可获得的，其综述参见例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。可在选择的温度在选择的时间段内测量稳定性。优选，制剂在室温(大约25℃)或40℃稳定至少1个月和或在大约2-8℃稳定至少1年，优选至少2年。此外，在制剂冷冻(至，例如，-70℃)和解冻后，制剂优选是稳定的。
因为关节内注射要求侵入过程，因此不推荐太频繁地施用它们。因此优选地，药物活性化合物在注射部位和/或关节组织内显示高驻留时间。因为本文中描述的多肽能够渗入软骨，因此在关节内施用后，所述多肽从关节的释放在延长的时期内发生。在一个优选实施方案中，还可通过将本文中公开的药物组合物配制为持续释放的组合物，即，允许在施用后延长释放，优选在零级速率上延长释放有效化合物的制剂来获得延长的驻留时间。
通常可使用熟知的技术将此类制剂制备为流体水性胶体悬浮液。制剂优选具有充分的流动性以易于注射。此外，制剂优选在液体形式上是稳定的、生物相容的和可生物降解的、无毒的、非免疫原性的和具有优良的局部耐受性。持续释放制剂优选提供相对恒定水平的调节剂释放。几种方法在本领域内是已知的。在一个方法中，制剂包括至少一种聚合物和一种活性剂，所述聚合物和活性剂是液态的和可注射的，并且由于pH和/或温度的变化，在对受试者施用后变得更粘稠。另一选择是胶化沉积物的形成。在施用后，因为受试者的温度高于胶凝剂的胶凝点，所以流体变成胶凝。另一个方法在于将活性剂整合入随后给受试者施用的微球体或植入剂。第四种方法是给纳米颗粒装载抗原结合多肽。然后以低粘度液体悬浮物的形式施用颗粒。
可将本文中公开的多肽和/或组合物用于例如进行软骨退变和与其相关的任何病症的治疗、预防和/或进展的延迟。优选，所述病症是骨关节炎。在本发明的范围内，与软骨退变相关的所述病症包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎和幼年特发性关节炎等等。
优选，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本文中公开的多肽和/或组合物。合适的剂量取决于许多因素例如待治疗病状、病状的严重度和过程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗原结合多肽的反应、使用的抗原结合多肽的类型和主治医生的判定。
本发明还包括装有一个或多个装组合物的容器的制品。合适的容器包括例如瓶子、小瓶和注射器，其可由多种材料例如玻璃或塑料形成。从商业和用户角度来看，制品还可包括其他期望的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的装箱单。此外，本发明包括编码本文中公开的抗原结合多肽的DNA序列。
在另一个方面，本发明还包括含有所述DNA序列的克隆性载体或表达载体。
本发明还公开了用所述表达载体转化的合适的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核宿主细胞，优选大肠杆菌(E.coli)，或真核宿主细胞例如酵母，优选酿酒酵母(S.cerevisiae)，昆虫细胞，哺乳动物细胞或植物细胞。优选，如果使用的scFv构建体包含指导多肽至周质的信号序列，则所述方法可提供从大肠杆菌包涵体或从大肠杆菌周质纯化的scFv抗体。
在另一个方面，本发明包括用于软骨退变的治疗、预防和/或进展的延迟的方法，其包括下列步骤：
(a)提供具有至少10kDa并且低于50kDa的分子量并且还具有高于7.0的pI的抗原结合多肽；和
(b)给有此需要的受试者局部施用所述多肽。
所述多肽优选是本文中公开的多肽。特别地，所述多肽优选结合细胞因子或细胞因子受体，优选TNFα或白细胞介素。更优选，所述多肽是稳定的和可溶性的。更优选，所述多肽具有与序列SEQ.ID.No.3至少90％的同一性，更优选95％和最优选100％的同一性。
任选地，对多肽进行工程化改造以增加所述多肽的正电荷和/或将所述多肽用于具有为抗原结合多肽提供总体正电荷的配方的组合物。可以例如通过遗传工程，例如通过一个或多个氨基酸的置换和/或通过多肽的化学修饰增加多肽的正电荷。由此可促进软骨渗透和/或可增加软骨驻留。
施用的方式优选是非肠道施用，更优选关节内施用。
通常，给有此需要的受试者施用治疗有效量的多肽。所述受试者优选是哺乳动物，更优选是人类。
实施例1
FITC-标记的TNFα拮抗剂至牛软骨内的大小依赖性渗透
实验的目的是比较抗TNFα单链抗体(scFv)ESBA105(在附图中有时也称为E105)与全长抗TNFα抗体英夫利昔单抗的离体软骨渗透。
材料和方法
如WO08/006235中所述产生ESBA105。在官方Swiss pharmacy购买英夫利昔单抗/
Figure BPA00001189604900141
从牛股骨(从屠宰场新获得的)切割出软骨制备物，将其置于如图1中示意性描述的角膜渗透室(corneal perfusion chamber)中。将天然暴露于滑液的软骨层暴露于300mcl的FITC-标记的抗体溶液。FITC标记的抗体在PBS缓冲液pH7.4中的测试浓度分别为1mg/ml(对于E105-FITC)和1mg/ml及2.2mg/ml(对于英夫利昔单抗-FITC)。循环通过室、试管和贮液池的总液体体积为5ml。在指定的温育时间(2、4、6或8小时)之后，用20ml PBS pH 7.4清洗软骨组织3次，随后包埋在OCT化合物(TissueTek)中，然后将其在液氮中冷冻。将样品包裹在石蜡膜(Parafilm)中，于-20℃贮存直至切片。
使用MI CROM低温保持器(OT：-18℃，刀：-20℃)以14mcm的切片厚度进行切片。分析封好的切片，以40-100x的放大倍数在UV-显微镜(Leica)下照相。使用IMAGE QUANT(5.0)软件分析照片上的信号强度。
如下进行FI TC标记：向1ml的2mg/ml抗体溶液中加入75mcl新制备的1mg/ml NHS-FITC/DMSO溶液，同时进行涡旋并在室温温育45分钟。在4℃使用5ml透析盒(dialysis-cassette)于5升PBS pH6.5中通过透析将未结合的FITC与标记的蛋白质分离。在48小时的时间内进行透析，在此期间完全置换透析缓冲液4次。
由于使用解剖刀从骨切取，所以软骨制备物具有不同的厚度。将暴露于制剂的软骨表面朝向各照片的底部定向排列。图“体外软骨渗透”的照片3至5(从左至右)由连续拍摄并且叠加(以产生完整检查的软骨组织的概图)的两张(photograph 4 of three)照片组成。
结果
ESBA105-FITC和英夫利昔单抗-FITC至牛软骨内的渗透研究的结果显示于图3。时间进程研究显示：ESBA105-FITC以时间依赖性方式有效地渗入牛软骨，然而英夫利昔单抗-FITC却不这样。对于英夫利昔单抗-FITC，未观察到时间依赖性渗透，甚至在8小时后和在2.2mg/ml的浓度，照片不能与PBS处理的软骨相区别。为了允许比较不同标记的蛋白质制备物，在使用它们进行软骨渗透实验之前，将其等分进行稀释(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16)并且点在载玻片上以在紫外光下确定信号强度。该稀释系列的结果描述于图2中，该图显示FITC-标记对于两种蛋白质作用同样有效，从而渗透实验的结果在定性基础上是可直接比较的。
图4A描述了在时间进程研究过程中在离顶点0.5距离[任意单位](关于标尺，参见图4B)处测量的信号强度的定量。对于PBS和对于英夫利昔单抗-FITC，测量的值几乎相等，表明无英夫利昔单抗-FITC渗入软骨。对于ESBA105，定量分析显示信号强度随时间有几乎线性增加。
实施例2
体内和生物分布研究
材料和方法
TNF-α抑制剂。如所描述的，将ESBA105在大肠杆菌中表达并且从其中进行纯化，并且在25mM磷酸钠pH6.5中使用。在当地药房购买英夫利昔单抗
Figure BPA00001189604900151
和依那西普
细胞培养中TNF-α诱导的细胞凋亡。
将px6和px15代之间的小鼠L929成纤维细胞于100μl测定培养基(含有L-谷氨酰胺+5％FCS的无酚红RPMI)中接种在96孔板(167008，Nunc，Langenselbold，Germany)中，达到20000个细胞/孔的细胞密度。将细胞在37℃和5％CO2中温育过夜。在第二天，制备含有重组人rhTNF-α(300-01A，PeproTech，London，UK)和不同量的ESBA105或英夫利昔单抗的激动剂抑制剂混合物，将其在环境温度温育30分钟。向各孔中加入50μl的放线菌素D(终浓度为1μg/ml)，然后向细胞中加入50μl的激动剂抑制剂混合物(rhTNF-α终浓度为100pg/ml)。将细胞温育20小时。然后，向细胞培养物中加入50μl含有1mg/ml XTT(于无酚红的RPMI中)和25μM PMS(P9625，Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland)的溶液，将细胞在37℃再温育另外90分钟。增殖细胞表达线粒体琥珀酸-四唑「还原酶系统，该系统将四唑「盐XTT催化成红色产物。通过在平板读数器(TECAN，Genios，Switzerland)中测量450nm处的吸光度来评价红色的强度。
单关节炎模型。按照Bolon等人2004，使用28-规针，通过雌性10周龄Lewis大鼠(Jackson)的膝盖的髌下韧带关节内注射ESBA105、英夫利昔单抗或由与ESBA105相同的可变结构域构架组成但具有无关特异性的scFv(此处称为“天然”scFv；ESBATech)(各自处于40μl PBS中注射)，5分钟后注射rhTNF-α(处于10μl PBS中)。为此，用50mg/kg氯胺酮麻醉大鼠。在研究之前和研究过程中监测大鼠，在研究前和在rhTNF-α注射后48小时用测径器(Dyer，Lancaster，PA)测量膝盖直径。为了进行组织病理学评价(Bolon B，Campagnuolo G，Zhu L，Duryea D，Zack D，Feige U.Interleukin-lbeta and tumor necrosisfactor-α produce distinct，time-dependent patterns of acutearthritis in the rat knee.Vet Pathol 2004/41：235-243)，在第48小时对大鼠实施无痛致死术。在HE或甲苯胺蓝染色后评价脱钙的膝切片。如之前所述(Bolon.B等人(2004)，参见上文)，就炎症(0至4)和软骨(0至4)给切片评分。对于所有动物操作已获得伦理批准。
生物分布研究。使用由MDS Pharma Services Switzerland AG(Fehraltorf，Switzerland)提供的氯胺-T法用125碘(125I)标记ESBA105至18.6MBq/mg的起始比活性。
在Covance Laboratories Ltd.(Harrogate，UK)进行生物分布研究，遵循由优良实验室规范(Codification Amendments Etc.)修正的英国(GLP监督管理局，药品和医疗产品管理中心(MHRA))优良实验室规范1999，制定法文件(Statutory Instrument)1999No.3106而进行所述研究，并且所述研究由当地伦理委员会批准。雄性新西兰白兔接受在1000μg/动物的靶ESBA105剂量水平上的[125I]-ESBA105单个静脉内或关节内剂量。施用的剂量在884至1034μg/动物的范围内，相当于0.707和0.827MBq之间的放射性剂量。在给药后，如表1中所述采集动物的样品。
表1
Figure BPA00001189604900171
将血液样品离心以制备血浆，将所述血浆进行γ计数(Packard Cobra 2γ计数器，Perkin Elmer Life Sciences，Waltham，MA)以确定药代动力学(A组)的放射性浓度。对于B和C组，通过戊巴比妥过量给药，然后进行驱血法(exsanguination)来杀死动物。取下各动物的右后足(包括膝关节)，将其浸入己烷和固体二氧化碳的混合物中，进行至少15分钟。在完全冷冻后，将腿包埋在装有冷冻的2％(w/v)水性羧甲基纤维素糊剂的模型中。将块置于在大约-20℃保持的Leica CM3600冷冻切片机(Leica Microsystems，Bucks，UK)的平台上，获得通过膝关节的矢状切面(sagittal section)(额定厚度30μm)。将置于“隐形胶带(Invisible-Tape)”(Supapak，Shipley，UK)上的切片在GVD03台式冷冻干燥器(Girovac Ltd.，Norwich，UK)中冷冻干燥，然后将其放置为与FUJI成像板(BAS MS型，Raytek Scientific Ltd，Sheffield，UK)接触。将合适活性的125I血液标准物(也以30μm的额定厚度切片的)放置为与所有成像板接触。在带有铜衬里的铅暴露盒中暴露14天后，使用FUJI FLA-5000放射摄影系统(Raytek Scientific Ltd)处理成像板。使用基于PC的图像分析包(Seescan Densitometry软件，LabLogic Ltd，Sheffield，UK)分析电子图像。将各个放射自显影图像中包括的125I标准物用于在一系列放射性浓度上构建校准线。在给药后大约2个月(相当于大约125I衰变的1个半衰期)，将许多切片以及相应的标准物再暴露4天以允许定量高水平的放射性。此外，在将部分经历γ计数之前，浸软和/或匀浆采自B组的残留尸体的组织。
使用WinNonLin Professional软件(版本4.0.1，Pharsight Corporation，Mountain View，CA)计算药代动力学参数。
结果
作用模式。ESBA105通过竞争性结合TNF-α的受体结合部位来阻断TNF-α配体-受体相互作用。来自分析型大小排阻层析的数据显示3个单体ESBA105分子结合1个TNF-α三聚体(数据未显示)，每一个单体ESBA105各与3个TNF-α单体中的一个相互作用。ESBA105以2.19x10-9M的KD结合rhTNF-α。ESBA105对rhTNF-α的结合动力学特征为：速率常数kon和koff分别为5.72x106M-1S-1和0.01256s-1。因此，来自人TNF-α的解离率在英夫利昔单抗与依那西普的解离率之间(Scallon B等人，J Pharmacol Exp Ther 2002；301：418-26)。
体外效力。使用小鼠L929成纤维细胞证明ESBA105中和细胞培养物中TNF-α的生物学活性的能力。该细胞系表达TNF受体I和II并且当将该细胞系暴露于TNF-α时，在用放线菌素D致敏后，经历细胞凋亡。与英夫利昔单抗类似，ESBA105以浓度依赖性的方式阻断rhTNF-α的细胞凋亡效应。L929TNF-α分析中的EC50值是12.5ng/ml(对于ESBA105)和14.0ng/ml(对于英夫利昔单抗)(图7)。
单关节炎模型。在关节内注射10μg rhTNF-α后，大鼠的膝显示预期的炎症反应(参见Bolon B，Campagnuolo G，Zhu L，Duryea D，Zack D，Feige U.Interleukin-lbeta and tumor necrosis factor-α produce distinct，time-dependent patterns of acute arthritis in the rat knee.Vet Pathol 2004；41：235-243.)：膝肿胀、滑膜炎和软骨中蛋白聚糖的损失(参见图9中的rhTNF-α对照)。具有不相关特异性的天然scFv显示对炎症反应的严重度没有影响(图9)。相反地，ESBA105以剂量依赖性的方式抑制rhTNF-α引起的炎症反应(图9)。有趣地，ESBA105超过rhTNF-α的11倍摩尔浓度(16倍的w/w)过量导致90％的膝肿胀的抑制(图9)。ESBA105和英夫利昔单抗在本研究中显示相似的效力(图9)。炎症评分也下降至相同程度(图8)。此外，如图8中所示，可防止软骨中蛋白聚糖损失。
生物分布研究。设计用于局部治疗使用，特别是对关节进行关节内应用的ESBA105。首先，研究全身性药代动力学：比较[125I]-ESBA105的静脉内和关节内应用。如图11A中所示，静脉内应用显示预期的药代动力学行为(Larson SM，EI-Shirbiny AM，Divgi CR，Sgouros G，Finn RD，Tschmelitsch J，等人.Single chain antigen binding protein (sFv CC49)-First human studies in colorectal carcinoma metastatic to liver.Cancer Suppl 1997；80：2458-68；Fitch JC，Rollins S，Matis L，AIford B，Aranki S，Collard CD，等人Pharmacology and biological efficacy of recombinant，humanized，single-chain antibody C5 complement inhibitor in patients undergoing coronary artery bypass graft surgery with cardiopulmonary bypass.Circulation 1999；100：2499-506)。测量的峰浓度在给药后2分钟(第一取样时间)发生。此后，放射性以二相性方式下降，这可能代表分布相(给药后进行大约1小时)，然后最终清除(表2)。
表2：在局部和全身性给药后局部药代动力学的比较
Figure BPA00001189604900201
i.a.关节内注射
i.v.静脉内注射
Tmax浓度峰的时间点
Cmax峰浓度
T1/2估计的清除半衰期
AUC0-6在0与6小时之间的浓度曲线下的面积。
ND由于数据不足而未确定
相反地，在关节内注射后，在血浆中只有在6至12小时后达到Cmax，这表明延长的吸收相。然而，对于静脉内和关节内应用，血浆中AUC0-24是相似的。
局部治疗的一个有利方面是局部获得高药物水平的可能性。在[125I]-ESBA105的关节内膝注射后1和24小时后，在滑液空间内观察到574,000和14,300ng相当物/克的水平(图5B)。有趣地，关节软骨中ESBA105水平在量级和进程上几乎相等(图5B)。在髌骨中，ESBA105的吸收更慢：在6小时时达到15,100ng相当物/克的Cmax；该水平为滑液空间和软骨中发现的水平的大约1/20。在松质骨中，在关节内注射后，ESBA105在6小时后达到3440ng相当物/克的Cmax(图5B)。从12小时起，放射性在大多数组织中减少，T1/2＝大约4小时。在血浆(13.5小时)、骨髓(23.0小时)、胫骨(14.6小时)、肌外膜(14.3小时)、皮肤(12.1小时)和股骨(9.02小时)中发现有更长的T1/2。有趣地，滑液和关节软骨中的水平保持比髌骨、松质骨和血浆中的高大约20倍。
与对于膝的关节内应用相反，在静脉内应用后，在膝关节中发现显著更低的ESBA105水平(图11C)。与[125I]-ESBA105的静脉内应用相比较，对于关节内应用，基于AUC0-24的关节软骨中的暴露为150至500倍。发现在静脉内应用后组织中清除半衰期(当它们是可测量的时候)与关节内注射后的相当(数据未显示)。
讨论
理想地，OA的治疗应当针对体征和症状以及结构改变。然而，这样的治疗在目前是不可获得的(关于综述，参见Goldring & Goldring，Osteoarthritis.J Cell Physiol.2007；213：626-34)。因此，主导性地参与病理生理学过程的药理学靶标将是理想的。TNF-α本身以这样的靶提供，因为：(a)(持续的)对TNF-α的局部暴露引起(持续的)痛觉过敏(Sachs D等人，Pain 2002；96：89-97；Schafers M等人，Pain 2003；104：579-88.)，(b)在OA中TNF-α由滑液组织(Benito MJ等人，Ann Rheum Dis 2005；64：1263-7；Brennan FM等人，Scand J Immunol 1995；42：158-65)和软骨(Amin AR.Osteoarthrit Cartilage 1999；7：392-4)产生，和(c)TNF-α是炎症过程(Goldring SR和Goldring MB，Clin Orthop Relat Res 2004；(427Suppl)：S27-36；Schottelius AJ等人，Exp Dermatol 2004；13：193-222)和软骨降解(Kobayashi M等人，Arthrit Rheum 2005；52：128-35)的驱动者。此外，Hill等人描述了在膝OA的过程中疼痛的变化与滑膜炎的变化的相关性(Ann Rheum Dis 2007；66：1599-603)。已显示，TNF-α抑制剂(a)抑制疼痛和痛觉过敏(Sachs D等人，Pain 2002；96：89-97；Elliott MJ等人，Lancet 1994；344：1105-10；Shergy WJ，等人，J Rheumatol 2002；29：667-77；Alstergren P和Kopp S，J Rheumatol 2006；33：1734-9)，(b)减少炎症性过程(Elliott MJ等人，Lancet 1994；344：1105-10；Feldmann M和Maini SR，Immunol Rev 2008；223：7-19)和(c)可离体地使OA软骨从分解代谢逆转至合成代谢状态(Kobayashi M等人，Arthrit Rheum 2005；52：128-35)。
在许多患者中，OA是影响单关节例如膝或髋的局部现象(Wiel和HA等人，Nat Rev Drug Discov 2005；4：331-344；Abramson SB和YaziciY，Adv Drug Deliv Rev 2006；58：212-225)。因此，由于安全性考虑的原因，全身性TNF-α抑制似乎不合适。因此，使用以有效的TNF-α抑制、良好的滑液组织和软骨渗透(但只导致低全身性TNF-α抑制)为特征的药剂局部治疗可以是一种干预选择。相同的论点适用于“经典”炎症性关节炎(银屑病关节炎和其他关节炎)的单或少关节炎疾病过程的治疗。此处，我们在模型中表征了这样的候选物(ESBA105)用于局部治疗的性质，从而阐明了体内TNF-α的局部中和、离体软骨渗透和在体内关节内注射后从兔子的膝关节空间至滑膜组织和软骨内的生物分布。ESBA105具有仅为26kDa的分子量。相反地，目前可获得的TNF-α抑制剂例如英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗都具有大约150kDa的分子量。
ESBA105对TNF-α具有纳摩尔浓度的结合亲和力，从而在细胞分析中以与英夫利昔单抗相当的能力抑制TNF-α(图7)。在体内，在大鼠中rhTNF-α诱导的膝关节炎症模型中，ESBA105还有效地抑制局部TNF-α。事实上，EsBA105超过rhTNF-α的11倍摩尔浓度(16倍的w/w)过量抑制TNF-α诱导的炎症性膝肿胀、滑膜炎以及蛋白聚糖从软骨的损失达90％(图8，9)。为了进一步表征ESBA105的组织渗透能力，我们研究了ESBA105至正常牛关节软骨内的渗透(参见实施例1)。在数小时内，ESBA105渗透入软骨。蛋白质的软骨渗透是分子量和电荷依赖性的(Maroudas A，J Anat 1976；122(Pt 2)：335-47；van Lent PL等人，J Rheumatol 1987；14：798-805；van Lent PL等人，J Rheumatol1989；16：1295-303)。根据结果，很明显ESBA105具有用于治疗性关节内使用的合适大小(26kDa)和电荷。值得注意的是，ESBA105的软骨渗透是线性的(图4)。迄今现有的数据支持在关节内注射后ESBA105可在体内抑制OA软骨中的TNF-α的观点。根据目前对骨关节软骨中代谢的理解，这预期在至少一部分患者中导致分解代谢至合成代谢的逆转(比较Kobayashi M等人，Arthrit Rheum 2005；52：128-35))。与ESBA105相反，IgG(大约150kDa)例如英夫利昔单抗太大，以致于不能渗透入软骨(图3，4)。
在兔子中使用[125I]-ESBA105进行的生物分布研究显示，在关节内注射后，其从膝关节分布，并且在关节内给药后在所有OA相关组织中达到比静脉内施用相同剂量后显著更高的水平(图11，表4)。这对于滑液(1,700倍)、关节软骨(46倍)和髌骨(127倍)中的Cmax是最显著的。在关节内施用后至腿组织内的放射性分布是延长的过程，峰水平在大多数情况下在6至12小时发生(图5A，5B)。
相反地，在注射入膝关节后，血浆中ESBA105的Cmax为静脉内注射后的大约1/10(图5A)。与该发现相一致，在给药后6至12小时之间观察到关节内给药后血浆中的Cmax，这表明从膝关节空间至循环的相对缓慢的吸收(图5A)。因此，可以预期，在关节内注射ESBA105后，TNF-α的全身性抑制较慢。由于ESBA105比依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗(Nestorov I.Semin Arthritis Rheum 2005；34(5Suppll)：12-8)更快速地被从循环中清除(在兔子中，T1/2为7小时(Furrer E等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.2009Feb，50(2)：771-8.Epub 2008Aug29))，所以情况更加如此。
总结和结论
兔子中的PK研究显示在关节内注射后，来自[125I]-ESBA105的放射性被分配入膝关节，其中其在关节内给药后达到比静脉内施用相同剂量后显著更高的水平。这对于滑液(1,700倍)、关节软骨(大于46倍)和髌骨(125倍)最为明显。关于在静脉内施用后和关节内施用后一段时间[125I]-ESBA105的分布，分别参见图5A和B。体外结果验证了ESBA105但非英夫利昔单抗至膝软骨内的有效渗透(参见实施例1)。在关节内施用后放射性至腿组织内的分布是延长的过程，在大多数组织中在6小时时水平达到峰值(参见图5B)。与该发现相一致，在6至12小时之间观察到关节内给药后血浆中的Cmax，这表明从膝关节空间至循环内的相对缓慢的吸收。关于分别在静脉内施用后和关节内施用后[125I]-ESBA105的血浆浓度随时间变化的比较，参见图6。在静脉内施用后放射性在全身广泛分布，最高水平与进行清除的器官(肾和胃肠道)相关。总之，这些结果确认，为了在膝关节中获得高并且延长的ESBA105水平和为了获得至关节软骨内的最大渗透，关节内施用途径优于静脉内施用。
实施例3：
TNF抑制性scFv ESBA105对来自OA患者的人关节软骨外植体中与骨关节炎相关的生物标记物的作用
方法
研究概述和人软骨外植体的培养
基于基质金属蛋白酶(MMP)的活性和PGE2的产生评价ESBA105对人膝关节软骨外植体(来自8个骨关节炎供体)的影响。
在关节置换手术时从8个不同的患有膝OA的供体获得人软骨。在总共3个不同的测试条件(ESBA105的非特异性scFv构架(FW2.3)和2个不同浓度的ESBA105，也参见表3)下培养成组的来自各供体的8个软骨重复。
从经历总膝关节成形术(TKA)的患者的膝关节获得大切削深度(Full depth)3mm直径的软骨穿孔物。将软骨穿孔物称重，然后开始培养。将穿孔物培养在96孔板中，每一个孔装有一个外植体和200ul培养基(DMEM+水解的乳清蛋白+50ug/ml维生素C+喷他霉素/链霉素+ITS)。将软骨外植体培养3周，每周更换培养基2次。在第5、8、12、15、19和21天收集培养基，然后贮存于-80℃直至分析。
表3：测试条件
Figure BPA00001189604900251
MMP活性测量
使用荧光MMP底物TNO211-F测量MMP活性，如Tchetverikov等人(Clinical and Experimental Rheumatology 2003；21：711)中所描述的。该底物主要由MMP-2、3、7、9、12和13转化。其也可由MMP-I转化(虽然以更低的速率)。在5uM BB94(一般性MMP抑制剂)存在或不存在的情况下使用6.25uM TNO211-F测量MMP活性。在MMP缓冲液中稀释软骨培养上清液(终稀释度1∶12)，向所有样品中加入不含EDTA的完全丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。加入或未加入BB94的样品之间底物转化的初始速率的差异(荧光随时间的线性增加)用作MMP活性的量度。在30℃测量荧光，进行6小时。测试结果报告为与构架(FW)对照相比较测试条件的％MMP活性。使用t-检验并比较FW2.3与ESBA105低或FW2.3与ESBA105高来进行统计分析。
PGE2
使用R&D系统的PGE2分析试剂盒(R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，United Kingdom；cat.No.KGE004)测量软骨培养上清液中PGE2的水平。按照厂商的说明书，使用2倍稀释的细胞培养上清液进行测定。简而言之，该测定基于竞争结合技术：其中存在于样品中的PGE2与固定量的辣根过氧化物酶标记的PGE2竞争涂铺至微孔板上的小鼠单克隆抗体上的部位。在除去过量缀合物和未结合样品后，向孔中加入显色底物以测定结合的HRP的活性。颜色的强度与样品中PGE2的浓度成反比。测试结果报告为与构架(FW)对照相比较各自测试条件中测量的％PGE2。使用t-检验并比较FW2.3与ESBA105低或FW2.3与ESBA105高来进行统计分析。
结果
MMP活性
为了确定MMP活性测量的最佳时间点，进行测试分析。将各单个时间点上的8个重复的上清液汇集，在同种型对照和ESBA105高培养条件中在所有时间点(第5、8、12、15、19、21天)分析4个供体的此类汇集上清液中的MMP活性。在第5天获得最佳结果。因此，使用第5天的上清液进行最终的分析。
当与构架对照(FW2.3)相比较时，使用TNF抑制性scFv ESBA105进行的人骨关节炎软骨外植体的治疗显著降低MMP的活性。总体效率对于ESBA105的两个浓度是相似的(图10)。
PGE2
对所有重复实验和培养时间点的汇集培养基测定PGE2的浓度。ESBA105的两个浓度都显著地降低患病软骨培养物的上清液中PGE2的浓度(图11)。
虽然显示和描述了目前优选的本发明的实施方案，但应清楚地理解本发明不限定于此，可在下列权利要求的范围内另外地不同地实施和实践本发明。
Figure IPA00001189604300011
Figure IPA00001189604300021
Figure IPA00001189604300031

Claims (22)

1.用于软骨退变的治疗、预防和/或进展的延迟的抗原结合多肽，其中所述多肽能够渗入软骨。
2.权利要求1的抗原结合多肽，其中所述多肽是单链抗体。
3.权利要求1或2的抗原结合多肽，其中所述多肽具有至少5mg/ml，更优选至少10mg/ml，和最优选至少20mg/ml的溶解度。
4.前述权利要求中任一项的抗原结合多肽，其中所述多肽具有至少10kDa并且低于50kDa的分子量。
5.前述权利要求中任一项的抗原结合多肽，其中所述多肽特异性结合细胞因子，特别是IL-1或TNFα、细胞因子受体或软骨蛋白聚糖降解酶。
6.前述权利要求中任一项的抗原结合多肽，其包含：
与SEQ.ID.No.1具有至少90％的同一性、更优选至少95％的同一性的VL；和/或
与SEQ.ID.No.2具有至少90％的同一性、更优选至少95％的同一性的VH。
7.前述权利要求中任一项的抗原结合多肽，其中所述多肽具有序列SEQ.ID.No.3。
8.前述权利要求中任一项的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽的pI高于7.0，特别地高于7.4，更特别地是7.8或更高。
9.权利要求1至8的任一项的抗原结合多肽用于软骨退变、特别是骨关节炎的治疗、预防和/或进展的延迟的用途。
10.权利要求1至8的任一项的抗原结合多肽用于生产药剂或作为检测软骨退变、特别是骨关节炎的体外诊断试剂的用途，所述药剂用于软骨退变、特别是骨关节炎的治疗、预防和/或进展的延迟。
11.包含权利要求1至8的任一项的抗原结合多肽的组合物，特别是药物组合物。
12.权利要求11的组合物，其包含pH高于6.0的pH经缓冲的水溶液。
13.权利要求11或12的组合物，其具有适合用于关节内施用的配方，特别是持续释放配方。
14.权利要求11至13中任一项的组合物，其具有为所述多肽提供总体正电荷的制剂。
15.权利要求11至14中任一项的组合物，其中所述多肽是scFv并且特异性结合TNFα。
16.一种制品，其中包含装载权利要求1至8中任一项的抗原结合多肽或权利要求11至15的任一项的组合物的容器。
17.权利要求11至15中任一项的组合物用于软骨退变和与其相关的任何病症、特别是骨关节炎的治疗、预防和/或进展的延迟的用途。
18.编码权利要求1至8中任一项的抗原结合多肽的DNA序列。
19.包含权利要求18的DNA序列的克隆载体或表达载体。
20.用权利要求19的表达载体转化的合适的宿主细胞。
21.用于产生权利要求1至8中任一项的抗原结合多肽的方法，所述方法包括在允许所述抗原结合多肽合成的条件下培养权利要求20的宿主细胞和从所述培养物回收所述抗原结合多肽。
22.用于软骨退变的治疗、预防和/或进展的延迟的方法，其中局部施用、特别是通过关节内施用来施用权利要求1至8中任一项的抗原结合多肽。
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