CN101928718B - 蛋白质三聚体化模序及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白质三聚体化模序及其应用。该三聚体化模序的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明蛋白质三聚化模序根据天然三聚体卷曲螺旋的序列特征而设计，序列更加优化。在设计蛋白质三聚化模序的过程中，充分考虑了各个氨基酸形成寡聚体的倾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了产品三聚化成分纯度。本发明蛋白质三聚化模序可广泛用于天然构象为三聚体的蛋白质的结构和功能研究，可用于体外表达天然以三聚体形式存在的蛋白质，进而用于筛选和三聚体形式目的蛋白相互作用的配体分子。本发明蛋白质三聚化模序可用于构建和表达天然以三聚体形式存在的病毒表面抗原，构建候选基因疫苗或亚单位疫苗。

Description

蛋白质三聚体化模序及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质三聚体化模序，本发明还涉及该蛋白质三聚体化模序在制备或表达三聚体蛋白质中的应用，属于三聚体蛋白质基因工程领域。

背景技术

卷曲螺旋是一类由两股或两股以上右手α螺旋相互缠绕而形成的平行或反平行的左手超螺旋结构的总称。卷曲螺旋的特征是，螺旋每圈需要3.5个氨基酸残基，每两圈形成一个循环，因此形成多个七肽单元的重复序列或称作七重复序列(abcdefg)n。最常见的天然卷曲螺旋一般由2-5个七重复序列组成(Vinson C，Myakishev M，Acharya A，et al.Classification of Human B-ZIP Proteins Based onDimerization Properties.Mol Cell Biol.2002.22(18)：6321-6335)。

七重复序列各个位置的氨基酸在形成和维持卷曲螺旋结构中发挥不同的作用。其中a位和d位通常由疏水性氨基酸占据，通常为亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)或异亮氨酸(Ile)。a、d位氨基酸构成卷曲螺旋的疏水核心，在维持卷曲螺旋方面起关键作用，同时这些疏水性氨基酸侧链的几何结构对于形成二聚体、三聚体、四聚体或其他寡聚体起决定性作用(Harbury PB，Zhang T，Kim PS，et al.A switchbetween two-，three-，and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants.Science.1993.262(5138)：1401-1407.Harbury PB，Kim PS，Alber T.Crystal structureof an isoleucine-zipper trimer.Nature.1994.371(6492)：80-83.Suzuki K，Hiroaki H，Kohda D，et al.An isoleucine zipper peptide forms a native-like triple strandedcoiled coil in solution.Protein Eng.1998.11(11)：1051-1055.)。除了a、d位以外，其他位置的氨基酸通常是极性氨基酸。其中，e、g位通常为带电氨基酸，相邻e、g位形成螺旋间盐桥(inter-helical salt bridge)，螺旋间盐桥对于卷曲螺旋的多聚化至关重要，常见氨基酸是谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)，常见的e-g组合为Glu-Arg、Glu-Lys、Arg-Glu、Lys-Glu(Vinson C，Myakishev M，AcharyaA，et al.Classification of Human B-ZIP Proteins Based on Dimerization Properties.Mol Cell Biol.2002.22(18)：6321-6335.Krylov D，Mikhailenko I，Vinson C.Athermodynamic scale for leucine zipper stability and dimerization specificity：e andg interhelical interactions.EMBO J.1994.13(12)：2849-2861.)。

在异亮氨酸拉链(isoleucine zipper，IZ)IZm的设计中，e-b-f位以Lys-Glu-Lys的组合形成螺旋内盐桥，这种盐桥能够提高卷曲螺旋的稳定性。随后对异亮氨酸拉链GCN4-p1的晶体结构研究发现，其C末端的g、c位的Glu、Arg形成的盐桥提高了模序的热稳定性，而c-f-c位盐桥的形成也能够提高卷曲螺旋的稳定性，因此，引入螺旋内盐桥是蛋白质寡聚化模序设计中的重要策略。

利用天然卷曲螺旋的寡聚化特性，将其与目的蛋白融合表达，已经用于很多研究中。最常见的应用方向是以天然卷曲螺旋结构替换或部分替代目的蛋白原有的寡聚化区域，从而改变蛋白质的聚合形式、亲和性或稳定性。另外，特殊卷曲螺旋与目的蛋白融合后，可以模拟目的蛋白的天然构象，使蛋白质处于活性状态，有利于蛋白质结构和功能的研究。尤其对于那些体外重组表达后很难维持天然构象的蛋白，卷曲螺旋融合表达是解决方案之一。

目前应用最多的模式化三股卷曲螺旋结构是GCN4亮氨酸拉链(leucinezipper，LZ)和异亮氨酸拉链(isoleucine zipper，IZ)。GCN4是酵母细胞转录激活蛋白，其C末端序列GCN4-p1(MetLysGlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHisLeuGluAsnGluValAlaArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg)(GenBankNP_010907)为α螺旋结构，通常以二聚体卷曲螺旋形式存在。由于七重复序列的a位均为亮氨酸，也称为亮氨酸拉链(LZ)(Landschulz WH，Johnson PF，McKnightSL.The leucine zipper：a hypothetical structure common to a new class of DNAbinding proteins.Science.1988Jun 24；240(4860)：1759-1764.)。IZ是LZ的一个衍生物，将LZ的a位亮氨酸残基替换为异亮氨酸残基，并在d位引入疏水性氨基酸。这些修饰使得GCN4LZ二聚体转变为具有三聚化倾向的GCN4IZ(MetLysGlnIleGluAspLysIleGluGluIleLeuSerLys

IleGlyGluVal)(Harbury PB，Zhang T，Kim PS，Alber T.A switchbetween two-，three-，and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants.Science.1993 Nov 26；262(5138)：1401-1407)。这种修饰不仅改变了卷曲螺旋的聚合状态，而且增加了卷曲螺旋结构的稳定性，为设计蛋白质三聚化模序提供了理论指导。

2001年，国际知识产权组织(World Intellectual Property Organization，WIPO)公开了一种利用GCN4IZ稳定HIV-1三聚化包膜糖蛋白(envelope glycoprotein，Env)的方法(WO/2001/019958)，其构建方法是删除Env的跨膜区、胞内区和胞外区C末端七重复序列(CHR)，保留胞外区N末端七重复序列(NHR)，并在其羧基末端引入GCN4IZ序列，作为Env蛋白的三聚化模序，融合后扩展了Env NHR序列，从而稳定三聚化Env蛋白的结构。2002年，WIPO公开了一组以IZN17为代表的三聚化多肽(WO/2002/024735)，其构建方法是向HIV-1Env NHR的氨基末端引入GCN4-pIQI序列(ArgMetLysGlnGluAspLysGluGluIleLeuSerLysGlnTyrHisGluAsnGluIleAlaArgAsp)或其衍生物，扩展NHR序列，稳定三聚化多肽。其中GCN4-pIQI及其衍生物的序列源自GCN4IZ，但进行了点突变或删除等修饰。2005年，WIPO公开了另一种稳定三聚化多肽的方法(WO/2005/118886)，其核心思想是在(WO/2002/024735)所描述的多肽IZN17的基础上，向其C末端引入分子间二硫键，通过共价键作用维持三聚化多肽的稳定性。

上述三项专利申请均利用了GCN4IZ的三聚化倾向从而稳定三聚体蛋白或多肽，但该模序具有一定的限制性。首先，GCN4蛋白天然以二聚体形式存在，经过a、d位修饰后虽然具有三聚化倾向，但其形成二聚体或其他寡聚体的趋势仍然保留，因此降低了产物中三聚体的比例及产品的纯度。更重要的是，在稳定三聚体蛋白或多肽的研究中，三聚体的形成及其稳定性的维持必须依赖于Envgp41自身三聚化序列N36和C34的聚合作用，在此过程中，GCN4主要是通过延长NHR序列起到促进聚合和稳定蛋白的作用，并非三聚化过程始动因素。因此，GCN4模序只能应用于含有自身三聚化模序的蛋白或多肽的研究，当试图研究不携带自身三聚化模序的目的蛋白时，该序列不是完全令人满意的。

2007年，WIPO公开了一种制备三聚体蛋白的方法(WO/2007/030803)，其构建策略是以一个或多个病毒的部分跨膜蛋白作为三聚化模序，并将其引入外源性目的蛋白的羧基末端，利用模序的三聚化倾向引导外源蛋白形成三聚体。此专利中所涉及的三聚化模序均来自病毒跨膜蛋白，具有较强的三聚化能力，但是同样具有局限性。上述的三聚化模序均属于病毒抗原，某些病毒如流感病毒包膜血凝素(hemagglutinin，HA)抗原，在人群中具有较高的抗体滴度，因此利用这种三聚化模序制备的三聚体融合蛋白不能直接作为免疫原使用，只能用于蛋白质结构和功能的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有三聚体蛋白制备技术中所存在的三聚化模序聚合能力弱、三聚体产物比例低、应用范围窄等缺点，提供了一种高聚合力、可广泛应用的蛋白质三聚化模序，采用该蛋白质三聚化模序所制备的蛋白质产物中三聚体比例大，纯度高。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种蛋白质三聚体化模序(MTI)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；

编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的原核或真核表达载体以及含有原核或真核表达载体的宿主细胞也当然属于本发明的保护范畴之列。优选的，编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

其中，SEQ ID NO：2为

Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys

本发明蛋白质三聚化模序MTI根据天然三聚体卷曲螺旋的序列特征而设计，序列更加优化。本发明在设计蛋白质三聚化模序的过程中，充分考虑了各个氨基酸形成寡聚体的倾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了产品三聚化成分纯度。

本发明三聚化模序MTI的氨基酸序列的核心是四个七重复序列：Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys；上述七重复序列的七个氨基酸残基依次用g-a-b-c-d-e-f表示，本发明中，将异亮氨酸(Ile)引入a、d位，形成卷曲螺旋的疏水核心，该稳定的核心对于三聚体的形成有利；第1、2个七重复序列g-c-f位Glu-Lys-Glu组合的目的是为了形成螺旋内盐桥，提高三聚化模序的稳定性。第4个七重复序列的g位精氨酸(Arg)在三聚体形成中具有重要意义，因此选择Arg占据该位置，提高模序的三聚化能力。

在SEQ ID NO：2中的N末端、核心序列的第1个七重复序列g位之前的Ile-Lys-Glu，以及在SEQ ID NO：2中的C末端、核心序列的第4个七重复序列f位之后Arg-Ile-Ala为“保护性氨基酸”，其作用是使内部氨基酸形成七重复序列的卷曲螺旋结构。其中，Ile-Lys-Glu上游的Gly-Gly-Ser-Gly-Gly序列是模序SEQ IDNO：2与目的蛋白之间的连接序列(linker)，它的作用一方面保持三聚化模序SEQID NO：2与目的蛋白的结构相对独立，另一方面也可以作为N末端的“保护性氨基酸”，增加卷曲螺旋中螺旋的成分，使螺旋结构更加稳定。

本发明所要解决的另一个技术问题是将上述蛋白质三聚体化模序应用于制备蛋白质三聚体。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明蛋白质三聚体化模序MTI在制备蛋白质三聚体中的应用，包括：

(1)将本发明蛋白质三聚体化模序MTI的基因序列与目的蛋白基因相连接，得到融合基因；二者的连接次序是：蛋白质三聚体化模序的氨基末端与目的蛋白的羧基末端相连接；

(2)将步骤(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表达载体，构建得到融合蛋白原核或真核表达载体；

(3)将所构建的原核或真核表达载体在体内或体外表达融合蛋白，即得。

本发明蛋白质三聚化模序(MTI)可广泛用于天然构象为三聚体的蛋白质的结构和功能研究。可用于体外表达天然以三聚体形式存在的蛋白质，进而用于筛选和三聚体形式目的蛋白相互作用的配体分子。

本发明蛋白质三聚化模序(MTI)可用于构建和表达天然以三聚体形式存在的病毒表面抗原，产物可作为DNA免疫原，用于体内表达，构建候选基因疫苗；表达产物可作为蛋白免疫原，构建候选亚单位疫苗，有潜在的远期社会和经济效益。本发明所涉及的蛋白质三聚化模序MTI可用于天然以三聚体形式存在的病毒表面蛋白的表达，表达产物可用于诊断试剂的开发并应用于病毒性疾病的诊断，将产生较大的经济效益。

附图说明

图1是三聚化模序MTI引入目的蛋白羧基末端的模式图；以及将三聚化模序MTI引入目的蛋白的羧基末端而获得的融合蛋白；

图2是将融合蛋白基因引入表达载体的模式图；

图3是目的蛋白在293T细胞中瞬时表达及鉴定的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

本实施例中的蛋白质三聚化模序MTI氨基酸序列为：

Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO：2)。

实施例1

一、流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)HA1亚基与MTI的融合重组体HA1-MTI的构建

1、获取HA1基因：首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68(美国ATCC)总RNA，以获得的总RNA为模板，进行RT反应产生cDNA；再以cDNA为模板，利用引物HA1UP(TACAGGATCCGCCATGAAGACTATCATTGCT)和HA1DOWN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR扩增HA1基因，反应条件为98℃15s，60℃10s，72℃2min，共30个循环，DNA聚合酶为PrimeStar HS DNA Polymerase(日本TaKaRa)。

2、HA1-MTI融合重组体的构建：将编码MTI蛋白的基因(GGAGGTTCTGGAGGGATTAAAGAGGAGATTGCCAAAATCAAAGAAGAAATAGCTAAGATCAAAGAGAAGATAGCTGAGATTGAAAAGAGAATCGCAGAAATTGAAAAGAGAATTGCTGGCGGTTGTTGC)(SEQ ID NO：1)合成于载体pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen)的多克隆位点EcoR I、Xho I之间获得载体pcMTI，再将纯化后的HA1基因克隆至含有MTI基因的pcMTI载体上，其中，HA1基因C末端与MTI基因N末端相连，并位于同一读码框内，获得融合蛋白表达载体(HA1-MTI)；将纯化后的HA1基因克隆至载体pcDNA3.1(+)(美国Invotrogen)上获得不含MTI基因的单纯HA1表达载体(HA1wt)。

二、融合蛋白的表达

1、真核细胞转染实验：将人胚肾293T细胞(美国ATCC)以5×10⁵个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将4μg重组蛋白表达载体HA1-MTI或HA1wt转染至293T细胞内，所用的转染试剂为Lipofectamine 2000(美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。

2、表达产物的收获：转染后72h，将293T细胞培养上清转移至2.0ml离心管内，3000×g离心5min，弃去细胞碎片，将离心上清分装于0.5ml离心管中，于-40℃保存。

三、利用特异性抗体通过western blotting方法检测产物中的HA1重组蛋白

1、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳：向125μl收获的细胞上清中加入25μl6×non-reduced loading buffer(0.35M Tris-HCl pH6.8，30％甘油，10％SDS，0.012％溴酚蓝)，充分混匀，100℃煮沸2min，4℃8000×g，离心10min，蛋白样品加载至8％SDS-PAGE凝胶中，160V电泳1h。

2、Western blotting：电泳结束后，将蛋白质转印至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉于37℃封闭2h。封闭后的PVDF膜与兔抗HA单克隆抗体(1∶1000，美国CST)于4℃过夜孵育，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG于37℃孵育1h。加入过氧化物酶底物，显示蛋白条带。

试验结果见图3。用HA1表达载体(HA1wt)和融合蛋白表达载体(HA1-MTI)瞬时转染293T细胞后收获培养上清液，用非还原PAGE检测其中的目的蛋白。第一泳道是用HA1wt转染组检测到的单体形式的目的蛋白；第二泳道是用HA1-MTI转染组检测到的目的蛋白天然三聚化形式；第三泳道是阴性对照。从试验结果可见，本发明所表达的融合蛋白产物三聚体比例大，纯度高。

序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>蛋白质三聚体化模序及其应用

<130>KLIP0001

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>129

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(129)

<400>1

ggaggttctg gagggattaa agaggagatt gccaaaatca aagaagaaat          50

agctaagatc aaagagaaga tagctgagat tgaaaagaga atcgcagaaa          100

ttgaaaagag aattgctggc ggttgttgc                                 129

<210>2

<211>43

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>2

Gly Gly Ser Gly Gly Ile Lys Glu Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Glu

1               5                   10                  15

Ile Ala Lys Ile Lys Glu Lys Ile Ala Glu Ile Glu Lys Arg Ile Ala

            20                  25                  30

Glu Ile Glu Lys Arg Ile Ala Gly Gly Cys Cys

        35                  40

Claims (8)

1.一种蛋白质三聚体化模序，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质三聚体化模序的核苷酸序列。

3.按照权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：其为SEQ ID NO：1所示。

4.含有权利要求2或3所述核苷酸序列的表达载体。

5.含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的蛋白质三聚体化模序在制备或表达蛋白质三聚体中的应用，所述的应用是将蛋白质三聚体化模序的氨基末端与目的蛋白的羧基末端相连接制备或表达蛋白质三聚体，其中，所述的目的蛋白质为从流感病毒A/HongKong/8/68中获取的流感病毒血凝素蛋白HA1亚基。

7.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备或表达蛋白质三聚体中的应用，所述的应用是将权利要求2或3所述的核苷酸序列与目的基因相连接，得到融合基因；所述的目的基因为编码流感病毒A/Hong Kong/8/68中获取的流感病毒血凝素蛋白HA1亚基的核苷酸序列；由所述的融合基因所表达蛋白质中，连接次序为：蛋白质三聚体化模序的氨基末端与所述的HA1亚基羧基末端相连接。

8.按照权利要求7所述的应用，包括：

(1)将权利要求2或3所述的核苷酸序列与目的基因相连，得到融合基因；由所述的融合基因所表达蛋白质中，连接次序为：蛋白质三聚体化模序的氨基末端与所述的HA1亚基的羧基末端相连接；

(2)将步骤(1)所得到的融合基因克隆至原核表达载体或真核表达载体，构建得到融合蛋白原核表达载体或真核表达载体；

(3)将所构建的原核或真核表达载体在体内或体外表达融合蛋白，即得。

Images