CN101928668B - 水环境中致病菌高效富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效富集回收水环境中致病菌的技术与方法，其主要内容包括：(1)新型载带阳电荷滤料的制备方法；(2)滤器的制作方法；(3)过滤浓集系统的组装；(4)洗脱液的配置方法；(5)浓集回收致病菌的操作方法。本发明的技术和方法能够高效的富集回收各种水环境如自来水、洁净水源水、污染较重的水体及污水中的致病菌，浓集回收效率稳定：对于较洁净水体回收率能达到90％以上，污染较重水体回收率能达到80％以上。且本发明中的滤料经过简单处理能够反复使用，其它的器材也可多次使用，因此本发明中的技术和方法简单、经济、实用，非常适合实验室及现场使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从水环境中高效富集致病菌的方法。
背景技术
水是人类赖以生存的物质，不仅供人们饮用和生活用水，同时还是人和动物机体排泄物、生产和生活污水等的排放场所，因此，水中的微生物多种多样。水中对人类健康威胁最大的是致病菌：历史上，曾发生过多次世界范围的霍乱大流行；在印度由于恒河水被非O-1群霍乱弧菌(O139)污染而导致了新的霍乱流行；此外，由于自然灾害、战争、制裁、经济落后所导致的卫生状况恶化、饮用水质下降而造成其它细菌性疾病(如伤寒、菌痢、腹泻等)的暴发流行也十分常见。根据WHO年度报告，亚(不包括中国)、非、拉各洲仅小于5岁的儿童每人每年发生腹泻2.2次，细菌性腹泻的病例多达1.5-2.5亿人；而我国每年肠道传染病的报告病例数多达100万人次(实际发病人数可能远超过这些)，占全部35种法定传染病报告病例数总数的80％以上。目前，虽然城镇卫生水平有明显提高，但由于生活方式的改变，仍然存在引起介水细菌学疾病的隐患，军团杆菌介空调冷却水进行传播和致病就是其中一例。此外，据调查一些家庭使用纯水机、桶装水、矿泉水，由于其暴露时间长，导致二次污染，仍有25％的水样细菌总数或大肠菌群超标。
此外，水体是恐怖分子实施生物恐怖袭击的重要介质，因此，水环境的生物安全问题已引起人们的极大关注。目前，美国对部分供水系统进行的评估结果表明，大多数的供水系统易受到恐怖分子的袭击。在我国，恐怖袭击事件也时有发生。如，2003年10月，河南省汝阳县发生的饮用水特大投毒案件造成了社会的极大恐慌。虽然理论上讲采用烈性病原体(生物战剂)是恐怖分子发动袭击的首选，但由于烈性病原体国家控制非常严格，获得困难、生产、储存、运输与释放都要求有非常严格的技术保障措施(国内可生产的实验室很少)。因此，采用烈性病原体袭击的可能性相对较小。而采用菌株来源广泛，培养技术简单，成本低廉，容易大规模培养制备和投放的常见致病菌(如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌等)进行恐怖袭击的可能性却非常大。2008年北京奥运会和2010年上海世博会是在我国举办的具有国际影响的大型活动，做好两会期间的水安全保障工作对保证大型活动的顺利开展、人们健康、社会安定、国家平稳发展都将具有十分重要的意义。
一般情况下，水环境中的病源微生物含量都非常少，远低于现有监测方法的检测灵敏度。因此，水环境中病源微生物监测的关键技术之一是如何从不同水体中将少量的病源微生物富 集、回收出来，以供实验室和/或现场检测用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的从水环境中浓集回收致病菌的方法。本发明可以将待检水样中小于1个/100ml的致病菌进行浓集回收，回收率可达到90％以上。
本发明的技术方案概述如下：
水环境中致病菌高效富集技术及应用，其特征是包括如下步骤：
(1)载带阳电荷滤料氢氧化镁铝的制备
①氢氧化镁铝胶体的制备
a.将AlCl3·6H2O和MgCl2·6H2O按摩尔比为1∶3溶解到一定体积去离子水中，使Al3+和Mg2+的终浓度分别达到0.1mol/L和0.3mol/L。在150～500转/分钟的搅拌下，缓慢均匀的加入一定浓度的NaOH溶液若干至不再产生沉淀为止。用盐酸调节pH至8.0左右，继续搅拌2h后进行静置老化。
b.静置老化过程中隔天倾倒出上清液，并用去离子水补足体积后搅拌均匀。共进行3次换水操作，持续时间约5天左右。
②滤料的制备
a.将老化完成后的氢氧化镁铝胶体进行离心，离心参数为6000rpm×10min。倾倒出上清，保留氢氧化镁铝沉淀。
b.将氢氧化镁铝沉淀置于55℃烘箱烘烤48小时左右至基本干燥。
c.将干燥的氢氧化镁铝沉淀置于马弗炉中进行烘烤，烘烤过程及参数如下：200℃下烘烤2小时，400℃烘烤2小时然后600℃烘烤4小时。
d.破碎氢氧化镁铝块体，并过孔径0.45mm和0.2mm标准筛，保留直径为0.2~0.45mm的颗粒。
e.氢氧化镁铝颗粒在马弗炉中以800℃烘烤4小时后自然冷却。
(2)滤器及过滤系统的组建
①滤器的制作
a.直径2～6cm一定长度的有机玻璃管一端封闭插入直径0.5cm长约2cm的硬质塑料管作为出水管。距离出水端1cm左右固定一与有机玻璃管内径相同的200目左右的不锈钢网承载滤料并可过滤出水。有机玻璃管另一端加工出一段螺纹，并配直径相当的塑料螺帽。该螺帽中间开一小孔并配合安装直径0.5cm长度2cm的硬质塑料进水管。
b.打开螺帽装入一定量的氢氧化镁铝滤料后重新拧紧螺帽。
②过滤系统的组建
过滤系统由高位水槽、灭菌容器、塑料导管、滤器及流量控制装置组成，以橡胶软管连接各个部件。过滤系统的组装如图3所示。
(3)洗脱液的配制
a.称取一定量的Na2HPO4和NaH2PO4完全溶解到一定体积去离子水中，配成pH值为6.5左右的缓冲溶液。
b.在上述缓冲溶液中加入分析纯的吐温-80并搅拌均匀，使吐温-80的终浓度达到0.5％。
c.配好的洗脱液分装后在121℃下高压灭菌20分钟。
(4)过滤浓集方法
a.一定量的水样置于高位水槽中，调节流量控制使水样以匀速流过滤器，用灭菌容器收集过滤水样。
b.从过滤系统中取出滤器，将10mL洗脱液注入滤器中，封闭出、入水管后震荡洗脱滤料约3分钟后将洗脱液放出。洗脱操作进行4～5次，每次均用10mL洗脱液。
c.将多次洗脱的溶液混合作为最终的浓集液。
本发明的优点是：
1、操作简便，不需要任何仪器设备。
2、富集回收致病菌效率高，处理水样量大。
3、这套技术可以明显提高水环境中致病菌的检测灵敏度，为饮水安全提供保证。
附图说明
图1为本发明采用KYKY-EM3200型扫描电镜拍得的氢氧化镁铝滤料照片，其中(a)为滤料的颗粒，(b)为滤料局部表面。
图2为滤料成分能谱分析。
图3为滤器的结构示意图。
图4为过滤系统组成示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
制作载带阳电荷滤料，主要实施步骤如下：
①氢氧化镁铝胶体的制备
a.分别称取192克AlCl3·6H2O和488克MgCl2·6H2O溶解到8L去离子水中，在300转/分钟的搅拌下，缓慢均匀的加入3mol/L NaOH溶液2.4L左右至不再产生沉淀为止。用盐酸调节pH至8.0左右，继续搅拌2h后进行静置老化。
b.静置老化过程中隔天倾倒出上清液，并用去离子水补足体积后搅拌均匀。共进行3次换水操作，持续时间约5天左右。
②滤料的制备
a.将老化完成后的氢氧化镁铝胶体进行离心，离心参数为6000rpm×10min。倾倒出上清，保留氢氧化镁铝沉淀。
b.将氢氧化镁铝沉淀置于55℃烘箱烘烤48小时左右至基本干燥。
c.将干燥的氢氧化镁铝沉淀置于马弗炉中进行烘烤，烘烤过程及参数如下：200℃下烘烤2小时，400℃烘烤2小时然后600℃烘烤4小时。
d.破碎氢氧化镁铝块体，并过孔径0.45mm和0.2mm标准筛，保留直径为0.20～0.45mm的颗粒。
e.氢氧化镁铝颗粒在马弗炉中以800℃烘烤4小时后自然冷却。
实施例2
制作过滤装置及组建过滤系统，主要实施步骤如下：
①滤器的制作
a.取直径6cm长度20cm的有机玻璃管一根，一端封闭插入直径0.5cm长约2cm的硬质塑料管作为出水管。距离出水端1cm左右固定一与有机玻璃管内径相同的200目左右的不锈钢网承载滤料并可过滤出水。有机玻璃管另一端加工出一段螺纹，并配直径相当的塑料螺帽。该螺帽中间开一小孔并配合安装直径0.5cm长度2cm的硬质塑料进水管。
b.打开螺帽装入高度15cm左右的氢氧化镁铝滤料后重新拧紧螺帽。
②过滤系统的组建
将容积为3L左右的高位水槽、容积2L的灭菌容器、内径0.5cm的塑料导管、制作的滤器及流量控制以橡胶软管按图3连接，组成过滤系统。
实施例3
配制洗脱液，主要实施步骤如下：
a.3.723gNa2HPO4和9.238gNaH2PO4完全溶解到1L去离子水中，配成pH值为6.5左右的缓冲溶液。
b.1L上述缓冲溶液中加入5mL分析纯的tween-80，并搅拌均匀。
c.配好的洗脱液分装到试管中每份10mL，在121℃下高压灭菌20分钟。
实施例4
过滤富集回收自来水中的细菌及致病菌，利用实施例2中制作的过滤系统实施浓集回收，主要实施步骤如下：
a.取20L自来水分多次注入到高位水槽中，调节流量控制使自来水以匀速流过滤器，用灭菌容器收集过滤水样。
b.从过滤系统中取出滤器，将10mL洗脱液注入滤器中，封闭出、入水管后震荡洗脱滤料约3分钟后将洗脱液放出。洗脱操作进行4～5次，每次均用10mL洗脱液。
c.将多次洗脱的溶液混合作为最终的浓集液。
d.取1mL浓集液或1mL经过一定梯度稀释的浓集液接种普通营养琼脂平板经培养菌落计数后可推算出所富集的自来水水样的含菌量。
e.取1mL浓集液涂布接种选择性培养基经培养后可确定自来水中所含的致病菌的种类及菌量。
实施例5
过滤富集回收水源水中的细菌及致病菌，利用实施例2中制作的过滤系统实施浓集回收，主要实施步骤如下：
a.取20L水源水，如较洁净的河水、湖泊水或水库水，分多次注入到高位水槽中，调节流量控制使自来水以匀速流过滤器，用灭菌容器收集过滤水样。
b.从过滤系统中取出滤器，将10mL洗脱液注入滤器中，封闭出、入水管后震荡洗脱滤料约3分钟后将洗脱液放出。洗脱操作进行4～5次，每次均用10mL洗脱液。
c.将多次洗脱的溶液混合作为最终的浓集液。
d.取1mL浓集液或1mL经过一定梯度稀释的浓集液接种普通营养琼脂平板经培养菌落计数后可推算出所富集的水源水水样的含菌量。
e.取1mL浓集液涂布接种选择性培养基经培养后可确定水源水中所含的致病菌的种类及菌量。
实施例6
过滤富集回收污染较重水体中的细菌及致病菌，利用实施例2中制作的过滤系统实施浓集回收，主要实施步骤如下：
a.取5L污染较重的水，如海河水，分多次注入到高位水槽中，调节流量控制使自来水以匀速流过滤器，用灭菌容器收集过滤水样。
b.从过滤系统中取出滤器，将10mL洗脱液注入滤器中，封闭出、入水管后震荡洗 脱滤料约3分钟后将洗脱液放出。洗脱操作进行4～5次，每次均用10mL洗脱液。
c.将多次洗脱的溶液混合作为最终的浓集液。
d.取1mL浓集液或1mL经过一定梯度稀释的浓集液接种普通营养琼脂平板经培养菌落计数后可推算出所富集的海河水水样的含菌量。
e.取1mL浓集液涂布接种选择性培养基经培养后可确定海河水中所含的致病菌的种类及菌量。
实施例7
过滤富集回收污水中的细菌及致病菌，利用实施例2中制作的过滤系统实施浓集回收，主要实施步骤如下：
a.取5L污水，分多次注入到高位水槽中，调节流量控制使自来水以匀速流过滤器，用灭菌容器收集过滤水样。
b.从过滤系统中取出滤器，将10mL洗脱液注入滤器中，封闭出、入水管后震荡洗脱滤料约3分钟后将洗脱液放出。洗脱操作进行4～5次，每次均用10mL洗脱液。
c.将多次洗脱的溶液混合作为最终的浓集液。
d.取1mL浓集液或1mL经过一定梯度稀释的浓集液接种普通营养琼脂平板经培养菌落计数后可推算出所富集的污水水样的含菌量。
e.取1mL浓集液涂布接种选择性培养基经培养后可确定污水中所含的致病菌的种类及菌量。
Claims (1)
1.水环境中致病菌高效富集方法，其特征是包括如下步骤：
(1)载带阳电荷滤料氢氧化镁铝的制备
①氢氧化镁铝胶体的制备
a.将AlCl3·6H2O和MgCl2·6H2O按摩尔比为1∶3溶解到一定体积去离子水中，使Al3+和Mg2+的终浓度分别达到0.1mol/L和0.3mol/L，在150～500转/分钟的搅拌下，缓慢均匀的加入一定浓度的NaOH溶液若干至不再产生沉淀为止，用盐酸调节pH至8.0左右，继续搅拌2h后进行静置老化；
b.静置老化过程中隔天倾倒出上清液，并用去离子水补足体积后搅拌均匀，共进行3次换水操作，持续时间约5天左右；
②滤料的制备
a.将老化完成后的氢氧化镁铝胶体进行离心，离心参数为6000rpm×10min；倾倒出上清，保留氢氧化镁铝沉淀；
b.将氢氧化镁铝沉淀置于55℃烘箱烘烤48小时左右至基本干燥；
c.将干燥的氢氧化镁铝沉淀置于马弗炉中进行烘烤，烘烤过程及参数如下：200℃下烘烤2小时，400℃烘烤2小时然后600℃烘烤4小时；
d.破碎氢氧化镁铝块体，并过孔径0.45mm和0.2mm标准筛，保留直径为0.20～0.45mm的颗粒；
e.氢氧化镁铝颗粒在马弗炉中以800℃烘烤4小时后自然冷却；
(2)滤器及过滤系统的组建
①滤器的制作
a.直径2～6cm一定长度的有机玻璃管一端封闭，插入直径0.5cm长约2cm的硬质塑料管作为出水管，距离出水端1cm左右固定一与有机玻璃管内径相同的200目左右的不锈钢网承载滤料并可过滤出水；有机玻璃管另一端加工出一段螺纹，并配直径相当的塑料螺帽，该螺帽中间开一小孔并配合安装直径0.5cm长度2cm的硬质塑料进水管；
b.打开螺帽装入一定量的氢氧化镁铝滤料后重新拧紧螺帽；
②过滤系统的组建
过滤系统由高位水槽、灭菌容器、塑料导管、滤器及流量控制装置组成，以橡胶软管连接各个部件；
(3)洗脱液的配制
a.称取一定量的Na2HPO4和NaH2PO4完全溶解到一定体积去离子水中，配成pH值为6.5左右的缓冲溶液；
b.在上述缓冲溶液中加入分析纯的吐温-80并搅拌均匀，使吐温-80的终浓度达到0.5％；
c.配好的洗脱液分装后在121℃下高压灭菌20分钟；
(4)过滤浓集方法
a.一定量的水样置于高位水槽中，调节流量控制使水样以匀速流过滤器，用灭菌容器收集过滤水样；
b.从过滤系统中取出滤器，将10mL洗脱液注入滤器中，封闭出、入水管后震荡洗脱滤料约3分钟后将洗脱液放出；洗脱操作进行4～5次，每次均用10mL洗脱液；
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