CN101926817A - 索拉拉胶在降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种索拉拉胶在降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇方面的应用，首先配置培养液，将培养液加热灭菌；向冷却的培养液内加入平皿菌落液；将培养液放置在摇床中发酵，使之形成种子培养液；将所获得的培养液冷却，加入所获得的种子培养液，在摇床中发酵，使之获得粘稠的代谢产物；向所获得的发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，沉淀；将所获得的沉淀物抽真空干燥，即可得到索拉拉胶粗品，单独服用索拉拉胶粗品，或者将索拉拉胶粗品与食物混合服用能够降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇。本发明索拉拉胶产量大，提取方法简便，可直接溶于冷水；索拉拉胶能够有效地降低肝脂、血脂、体脂、体重、胆固醇等指标：索拉拉胶安全无毒，可直接食用。
Description
技术领域
本发明涉及土壤杆菌Agrobacterium sp.ZX09的代谢产物(中文名：索拉拉胶，英文名：Salenacan)的应用技术，在降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇等方面的应用。
背景技术
随着经济的大步向前发展，人类的生活质量和生活方式也随之改变。但，“吃得好，吃得精，营养过剩，运动少”这样的现代生活方式，也给人类带来了疾病，例如肥胖、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病等。据不完全统计，中国目前脂肪肝患者一亿三千万，糖尿病患者五千万到七千万……随着经济的腾飞，这些疾病的发病率日益提高。寻找高效、安全的控制、治疗方式迫在眉睫。
目前，人类已经研制了很多治疗药物，但多数是化学药品，有一定的疗效，但存在副作用大，不能持久服用，停药后效果反弹等弊端。
而本发明提供了一种安全有效的降血脂、肝脂、体脂、体重和胆固醇等作用的索拉拉胶。经过急性毒理学和慢性毒理学的评价，该胶无毒安全。该胶的结构为β-葡聚糖。早在上世纪四十年代，就由图伦大学Diluzio博士从酵母细胞壁中分离出这种物质。
在国际上已有研究报道说，β-葡聚糖是高效的生物反应调节因子(BRM)，具有抗肿瘤、抗氧化等功能，长时间食用含β-葡聚糖的食物能够降低人的血脂和肝脂(RobertNicolosi，Stacey J Bell，Bruce R Bistrian，Isaac Greenberg，R Armour Forse and George LBlackburn.August 1999.Plasma lipid changes after supplementation with β-glucan fiber fromyeast.American Journal of Clinical Nutrition，Vol.70，No.2，208-212)。进而也能控制体重(Daniёlle AJM Kerckhoffs，Gerard Homstra and Ronald P Mensink.August 2003.Cholesterol-lowering effect of β-glucan from oat bran in mildly hypercholesterolemic subjectsmay decrease when β-glucan is incorporated into bread and cookies.American Journal ofClinical Nutrition，Vol.78，No.2，221-227)。经特殊步骤萃取且不含内毒素的β-葡聚糖在美国FDA已认定是一种安全的物质，可添加在一般食品。
但现有的β-葡聚糖存在两个缺点。
第一，β-葡聚糖虽然广泛地分布于真菌、细菌和植物体内，但是目前药用、食用β-葡聚糖主要来源于食用、药用担子真菌和子囊酵母菌的细胞壁，从这些物质中提取β-葡聚糖的工艺较复杂，且产量较低。燕麦和大麦胚乳的细胞壁中，也存在β-葡聚糖，但其含量低，结构杂，不利纯化。
第二，β-葡聚糖功效的发挥需要一定溶解度、空间结构和合适的分子量的支撑。很多β-葡聚糖的水溶性较低，例如，可得然胶是由土壤杆菌或产碱杆菌产生的一种水不溶的凝胶多糖型葡聚糖，它由D-葡萄糖残基经β-葡萄糖苷键在C1，C3线性连接而成(Kim，M.K.，K.E.Ryu，W.A.Choi，Y.H.Rhee，and I.Y.Lee.2003.Enhanced productionof(1→3)-β-D-glucan by a mutant strain of Agrobacterium species.Biochem.Eng.J.16：163-168)；香菇多糖对肿瘤有抑制作用，但它在水中的溶解度也不高。而非水溶性的葡聚糖进入人体后很难被直接吸收，使其应用范围受到极大的限制。
为解决这一难题，很多学者研究了β-葡聚糖的衍生物来提高它的水溶性和生物活性，如在对从虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)中提取的β-葡聚糖进行硫酸化前后抗肿瘤活性的变化研究中发现，硫酸化后多糖溶解度增大，同时抗肿瘤能力也相应的增加(LinaZhang，Mei Zhang，Jing Dong，Ji Guo，Yinyin Song，Peter Chi keung Cheung.2001.Chemical structure and chain conformation of the water-insoluble glucan isolated fromPleurotus tuber-regium.Biopolymers 59：457-464.张俐娜，张玫，张志强，黄荣春。虎奶菇葡聚糖硫酸酯在水溶液中的链构象及构效关系。2003年全国高分子学术论文报告会)。另外，在中国专利(C N：1583802A)中对非水溶性酵母β-(1，3)-葡聚糖通过甲酸降解，得到不同分子量的可溶于水的β-(1，3)-葡聚糖。但所有这些解决方法都增加了获得所需β-葡聚糖的难度，使制备成本大大提高，限制了在工业领域中的大规模使用。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种水溶性好的、产量高的、工艺简单的、可以降低肝脂、血脂、体脂、体重、胆固醇等的索拉拉胶的应用方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种索拉拉胶在降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇方面的应用，步骤如下：
(1)配置培养液：将NaH2PO40.75‰-2‰，KNO32.5‰-3.5‰，CaCl20.08‰-0.14‰，MgCl20.25‰-0.45‰，FeSO4·7H2O 0.006‰-0.012‰，MnSO40.001‰-0.003‰，ZnCl20.006‰-0.007‰，NaCl 1-6％，蔗糖2％-4％，溶于1000mL H2O中，调节pH至6-10，以上百分号为质量比；
(2)将培养液加热至110-121℃，灭菌20-30分钟；
(3)向冷却至32-36℃的培养液内加入100-200μL平皿菌落液；
(4)将培养液放置在28℃～30℃摇床中发酵12-24h，使之形成种子培养液；
(5)将步骤(2)所获得的培养液冷却至32-36℃，加入步骤(4)所获得的种子培养液，在28℃～30℃摇床中发酵24-48h，使之获得粘稠的代谢产物；
(6)向步骤(5)所获得的发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，沉淀；
(7)将步骤(6)所获得的沉淀物放于50-70℃抽真空干燥，即可得到索拉拉胶粗品，单独服用索拉拉胶粗品，或者将索拉拉胶粗品与食物混合服用能够降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇。
本发明与现有技术相比，其显著优点为：(1)索拉拉胶产量大，提取方法简便，可直接溶于冷水；(2)索拉拉胶能够有效地降低小鼠的肝脂、血脂、体脂、体重、胆固醇等指标：(3)索拉拉胶安全无毒，可直接食用。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是小鼠体重变化图。
图2是小鼠身体脂肪含量变化图。
图3是小鼠血清中甘油三酯含量图。
图4是小鼠血清中胆固醇含量图。
图5是小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇含量图。
图6是小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇含量图。
图7是小鼠肝脏中甘油三酯含量图。
图8是小鼠肝脏中胆固醇含量图。
图9是小鼠肝脏中高密度脂蛋白胆固醇含量图。
图10是小鼠肝脏中低密度脂蛋白胆固醇含量图。
图11是小鼠肝组织切片图。
具体实施方式
本发明从土壤杆菌ZX09的菌株中提取出大分子的索拉拉胶结构通式为：
→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]3-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}n→
上述结构中的n基指具有100～10000个葡萄糖基相连的聚合物，本发明化合物是其中n为100～200的化合物。有关土壤杆菌ZX09，用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降低血糖上的应用内容已于2010年4月14日申请了专利(201010146371.2)
本发明利用土壤杆菌ZX09生产水溶性β-葡聚糖(索拉拉胶)，其步骤包括如下：
a.配置培养液：将NaH2PO40.75‰-2‰，KNO32.5‰-3.5‰，CaCl20.08‰-0.14‰，MgCl20.25‰-0.45‰，FeSO4·7H2O 0.006‰-0.012‰，MnSO40.001‰-0.003‰，ZnCl20.006‰-0.007‰，NaCl 1-6％，蔗糖2％-4％，溶于1000mL H2O中，调节pH至6-10。以上百分号为质量比。
b.将培养液加热至110-121℃，灭菌20-30分钟；
c.向冷却至32-36℃的培养液内加入100-200μL平皿菌落液；
d.培养液在28℃～30℃摇床中发酵12-24h，使之形成种子培养液；
e.将步骤b所获得的培养液冷却至32-36℃，加入步骤d所获得的种子培养液，在28℃～30℃摇床中发酵24-48h，使之获得粘稠的代谢产物；
f.向步骤e所获得的发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，沉淀；
g.将步骤f所获得的沉淀物于50-70℃抽真空干燥，即可得到索拉拉胶粗品。
通过上述方法制备的索拉拉胶，其水溶液具有有很高的粘度。这一特性使其具有广泛的应用价值。索拉拉胶单独服用，或作为食物添加剂，都具有降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇等方面的功效。
将索拉拉胶粗品与高脂食物按比例混合(见表1)，喂养ICR雄鼠3周。每天跟踪其体重(见图1)、食物摄取量和饮水量。每四天测一次身体脂肪含量(见图2)。在试验的最后一天，收集老鼠一天的粪便，测其重量、含水率、甘油三酯含量、胆固醇含量(见表2)，然后将老鼠禁食15小时后，杀死，取血、取肝，分别测其甘油三酯含量、胆固醇含量、高密度脂蛋白胆固醇含量及低密度脂蛋白胆固醇含量(见图3，图4，图5，图6，图7，图8，图9，图10)。并取部分肝组织做切片(见图11)。
表1
实施例1：索拉拉胶粗品的制备
配置培养液，NaH2PO4 0.75g，KNO3 2.5g，CaCl2 0.07g，MgCl2 0.25g，FeSO4·7H2O0.006g，MnSO4 0.001g，ZnCl2 0.006g，NaCl 10g，蔗糖20g，H2O1000mL，pH 6。将培养液加热121℃灭菌20分钟，冷却至32℃接入平皿菌落液200μL，28℃培养12h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌20分钟)并冷却至32℃的培养液中加入5％的种子培养液，28℃发酵24h。在该发酵液中加入两倍体积的丙醇，沉淀，将沉淀物于50℃抽真空干燥，即得到索拉拉胶粗品。
实施例2：索拉拉胶粗品的制备
配置培养液，NaH2PO4 2g，KNO3 2.5g，CaCl2 0.14g，MgCl2 0.45g，FeSO4·7H2O 0.0012g，MnSO40.002g，ZnCl20.0065g，NaCl 35g，蔗糖30g，H2O1000mL，pH 10。将培养液加热121℃灭菌30分钟，冷却至36℃接入平皿菌落液100μL，28℃培养24h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌30分钟)并冷却至36℃的培养液中加入10％的种子培养液，28℃发酵48h。向发酵液内加入两倍体积的95％乙醇，沉淀，将沉淀物于70℃抽真空干燥，即得到索拉拉胶粗品。
实施例3：索拉拉胶粗品的制备
配置培养液，NaH2PO41.0g，KNO33g，CaCl20.08g，MgCl20.2g，FeSO4·7H2O 0.0075g，MnSO40.003g，ZnCl20.007g，NaCl 60g，蔗糖30g，H2O1000mL，pH 7.2，将培养液加热121℃灭菌25分钟，冷却至34℃接入平皿菌落液200μL，30℃培养36h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌25分钟)并冷却至34℃的培养液中加入7％的种子培养液，28℃发酵36h。向发酵液内加入两倍体积的95％乙醇，沉淀，将沉淀物于60℃抽真空干燥，即得到索拉拉胶粗品。
实施例4：索拉拉胶对降低肝脂、血脂、体脂、体重、胆固醇等方面的实验研究
将索拉拉胶粗品研磨至粉状，按照食物配方制作小鼠食物。32只ICR雄鼠随机喂养一周后，编号分笼，饲养在23±1℃，12小时光照-12小时黑暗循环的动物房内。按组别进食。CK为普通食物对照组，HFD为高脂食物对照组，HFD+LG为低剂量组，HFD+HG为高剂量组。实验期间，每天早九点测定每只小鼠的体重、食物摄取量和饮水量；每四天再测定其身体脂肪含量。经过三周的喂养，收集最后一天小鼠的粪便进行化学成分分析，然后让小鼠从晚6点开始禁食，至第二天九点开始杀死，取血取肝，进行化学成分分析。并取部分肝组织做组织切片。
体重、食物摄取量和饮水量是由电子天平测得；身体脂肪含量是由德国布鲁克公司的minispec测得；血清和肝脏中化学成分指标则是按试剂盒说书所陈述的方法测得。肝组织切片由南京中医院制作。
试验结果表明：
①图1表明索拉拉胶具有明显的降低体重的功能。低剂量组和高剂量组小鼠的体重变化曲线位于高脂食物对照组之下，甚至略低于普通食物对照组。在整个实验期间，高脂食物对照组体重增加了11.6g，而低剂量组体重增加了8.2g，高剂量组体重只增加了7.4g，与此同时，普通食物对照组体重增加了9.7g。
②图2表明索拉拉胶具有明显的降低体脂的功能。低剂量组和高剂量组小鼠的身体脂肪含量变化曲线位于高脂食物对照组与普通食物对照组之间，接近于普通食物对照组。在实验最后，高脂食物对照组的身体脂肪含量高达到了17.34％，而低剂量组的身体脂肪含量只有8.63％，，高剂量组的身体脂肪含量只有8.13％，与此同时，普通食物对照组身体脂肪含量为6.07％。
③图3、图4、图5、图6表明索拉拉胶具有明显的降低血脂和血中胆固醇的功能。通过对小鼠血清中的甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的测定分析，高脂食物对照组的甘油三酯含量为165.08mg/dL，胆固醇含量为237.49mg/dL，高密度脂蛋白胆固醇含量为141.60mg/dL，低密度脂蛋白胆固醇为78.11mg/dL。而低剂量组的甘油三酯含量为114.60mg/dL，胆固醇含量为157.12mg/dL，高密度脂蛋白胆固醇含量为103.32mg/dL，低密度脂蛋白胆固醇为41.67mg/dL。高剂量组的甘油三酯含量为125.79mg/dL，胆固醇含量为171.02mg/dL，高密度脂蛋白胆固醇含量为80mg/dL，低密度脂蛋白胆固醇为65.75mg/dL。于此同时，普通食物对照组的甘油三酯含量为90.91mg/dL，胆固醇含量为150.79mg/dL，高密度脂蛋白胆固醇含量为77.48mg/dL，低密度脂蛋白胆固醇为55.55mg/dL。
由此可见，低剂量组和高剂量组小鼠的甘油三酯、胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均远低于高脂食物对照组。
④索拉拉胶具有明显的降低肝脂和肝脏中胆固醇的功能。通过对小鼠肝脏中的甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的测定分析，高脂食物对照组的甘油三酯含量为13.99mg/g肝，胆固醇含量为5.67mg/g肝，高密度脂蛋白胆固醇含量为0.35mg/g肝，低密度脂蛋白胆固醇含量为2.10mg/g肝。而低剂量组的甘油三酯含量为3.78mg/g肝，胆固醇含量为3.48mg/g肝，高密度脂蛋白胆固醇含量为0.34mg/g肝，低密度脂蛋白胆固醇含量为2.47mg/g肝。高剂量组的甘油三酯含量为4.65mg/g肝，胆固醇含量为3.17mg/g肝，高密度脂蛋白胆固醇含量为0.46mg/g肝，低密度脂蛋白胆固醇含量为2.00mg/g肝。于此同时，普通食物对照组的甘油三酯含量为6.10mg/g肝，胆固醇含量为3.22mg/g肝，高密度脂蛋白胆固醇含量为0.49mg/g肝，低密度脂蛋白胆固醇为1.29mg/g肝。
由此可见，低剂量组和高剂量组小鼠肝中的甘油三酯和胆固醇均远低于高脂食物对照组，接近于普通食物对照组。由图11肝组织切片结果分析，也能证明它这一功能。从图B(高脂食物对照组)，可以很明显的看到，细胞核周围围绕了很多脂肪，而图C(低剂量组)、图D(高剂量组)，可以发现，细胞核周围没有出现明显的脂肪堆积，细胞情况与图A(普通实物对照组)相似。
⑤由表2表明索拉拉胶不会造成便秘、食欲下降等不良影响。高脂食物对照组总食物摄取量为1932.4g，排便量为0.1111g/g体重，含水率为18.64％。而低剂量组总食物摄取量为1504g，排便量为0.1191g/g体重，含水率为38.51％。高剂量组总食物摄取量为1252.2g，排便量为0.1105g/g体重，含水率为32.69％。于此同时，普通食物对照组总食物摄取量为1265.5g，排便量为0.1169g/g体重，含水率为32.19％。
由此可见，低剂量组和高剂量组的小鼠，其总食物摄取量、排便量和含水率均与普通食物对照组相近。相反，高脂食物对照组出现了排便量少、粪便干结等不良现象。
结构决定性质。索拉拉胶具有降低血脂、肝脂、体脂和体重等功能的原因，应该是由其本身的结构决定。该胶是一种β-葡聚糖，聚合度高、分支多决定了其不宜被体内分解吸收。多羟基又决定了它良好的吸水性。经吸水溶胀后，它具有很高的粘稠度，它可以将脂肪、胆固醇等大分子包裹，阻碍其在小肠内的消化和吸收，进而随粪便排出了体外。脂肪和胆固醇就不会在体内分解、吸收和累积。
表2小鼠粪便重、含水率、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量
Claims (1)
1.一种索拉拉胶在降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇方面的应用，其特征在于步骤如下：
(1)配置培养液：将NaH2PO40.75‰-2‰，KNO32.5‰-3.5‰，CaCl20.08‰-0.14‰，MgCl20.25‰-0.45‰，FeSO4·7H2O 0.006‰-0.012‰，MnSO40.001‰-0.003‰，ZnCl20.006‰-0.007‰，NaCl 1-6％，蔗糖2％-4％，溶于1000mL H2O中，调节pH至6-10，以上百分号为质量比；
(2)将培养液加热至110-121℃，灭菌20-30分钟；
(3)向冷却至32-36℃的培养液内加入100-200μL平皿菌落液；
(4)将培养液放置在28℃～30℃摇床中发酵12-24h，使之形成种子培养液；
(5)将步骤(2)所获得的培养液冷却至32-36℃，加入步骤(4)所获得的种子培养液，在28℃～30℃摇床中发酵24-48h，使之获得粘稠的代谢产物；
(6)向步骤(5)所获得的发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，沉淀；
(7)将步骤(6)所获得的沉淀物放于50-70℃抽真空干燥，即可得到索拉拉胶粗品，单独服用索拉拉胶粗品，或者将索拉拉胶粗品与食物混合服用能够降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: SICHUAN KELUN XINGUANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT C Free format text: FORMER OWNER: NANJIANG UNIV. OF SCIENCE + ENGINEERING Effective date: 20130902 |
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Effective date of registration: 20130902 Address after: 610041 B6, building 88, Life Science Park, 703 South Garden Road, Chengdu hi tech Zone, Sichuan, China Patentee after: Sichuan Kelun Xinguang Biological Science and Technology Development Co., Ltd. Address before: 210094 Xiaolingwei, Jiangsu, No. 200, Patentee before: Nanjing University of Science and Technology |
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Address after: 610041 B6, building 88, Life Science Park, 703 South Garden Road, Chengdu hi tech Zone, Sichuan, China Patentee after: SICHUAN HETAI SYNLIGHT BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 610041 B6, building 88, Life Science Park, 703 South Garden Road, Chengdu hi tech Zone, Sichuan, China Patentee before: Sichuan Kelun Xinguang Biological Science and Technology Development Co., Ltd. |