CN101921292A

CN101921292A - 一种新型siRNA化学修饰单体及其制备方法和用途

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Publication number: CN101921292A
Application number: CN 201010210043
Authority: CN
Inventors: 王玉成; 李祎亮; 邵荣光; 任开环; 何红伟; 王菊仙; 白晓光; 许乐幸; 吴香玫; 李保卫
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-06-22
Also published as: CN101921292B

Abstract

本发明涉及一种新型siRNA化学修饰单体，以及所述单体在制备肿瘤基因治疗药物中的应用；实验研究证明，化学修饰siRNAs对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制活性及核酸酶稳定性均有明显提高，有望开发成为临床有效的肿瘤基因治疗药物。

Description

一种新型siRNA化学修饰单体及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及一种新型化学修饰单体的设计、合成；提供不同化学修饰siRNA的制备以及使用化学修饰siRNA在抗肿瘤基因治疗中的应用。

背景技术：

近年来，新发展的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，是双链RNA(dsRNA)特异性地诱发与其序列同源的mRNA分子降解，导致相应基因表达被抑制，是一种特殊的转录后基因沉默现象。目前已证实，RNA干扰是生物界普遍存在的一种有效的基因沉默过程，被广泛发现于植物、动物等真核生物细胞内，具有高特异性抑制靶基因表达、作用机制明确、疗效显著、副作用轻微等特点。应用RNA干扰技术开发新型靶向药物，已成为药物研究领域中重点发展的方向之一。但是，未经修饰的干扰RNA普遍存在生物稳定性差、半衰期短等问题，限制了其实际应用。

本发明的目的是，提供一种新型化学修饰单体及其制备方法，应用该修饰单体制备化学修饰的siRNA，以保留或明显提高未修饰siRNA基因沉默作用，同时能克服未修饰siRNA在体内稳定性差的缺陷。本发明所述应用化学修饰单体制备化学修饰的siRNA以提高其在体内的稳定性及抗肿瘤活性的技术，迄今尚未见有相关报道。

前期研究中，本实验室筛选获得一种高选择、高活性抑制Mdm2表达的siRNA序列。Mdm2基因(murine double mimute 2)是从转化小鼠细胞系的双微染色体上克隆获得的癌基因，在鼠和人的很多组织中都有表达(Cahilly，SL.et al.Somatic Cell and Molecular Genetics.1987，13(3)：235-244)。Mdm2的重要功能是抑制野生型p53的转录激活，促进p53蛋白经泛素化途径降解，将p53的生长抑制活性限制在一种相对平衡的水平上，使细胞能够继续增殖。此外，Mdm2还能抑制另一种重要的肿瘤抑制基因Rb的功能，甚至与p21发生直接相互作用并抑制其功能。降低Mdm2基因的表达，可以解除Mdm2与p53的相互作用，恢复野生型p53介导细胞周期阻滞和凋亡的功能，增强Rb、p21等对肿瘤的抑制功能，从而抑制肿瘤的发生和发展。本实验室原使用的siRNA序列在中国已经申请专利，并于2005年11月2日获得授权(专利号：CN 1225286C)。体内外实验结果显示，Mdm2-siRNA具有显著的抑制乳腺癌增殖作用，但是存在生物稳定性差、半衰期短以及非特异性脱靶效应等缺陷，限制了其进一步的开发。本发明以Mdm2-siRNA为例，提供一种新型化学修饰单体，并应用该修饰单体制备化学修饰的siRNA，以提高其在体内的稳定性和体内抗肿瘤活性。

发明内容：

本发明提供了一种新型化学修饰单体；

本发明提供了具有通式X结构化合物的制备方法；

本发明提供了化学修饰siRNAs的制备方法；

本发明还提供了化学修饰siRNAs在抗肿瘤基因治疗中的应用。

本发明所述通式X化合物的结构如下所示：

其中：

R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基，单取代或双取代氨基；R1可以是单取代，也可以是多取代的基团；R1优选自氢、氟、氯、甲基。

本发明所述一种化学修饰Mdm2-siRNA，其核苷酸序列如下：

正义链：5’-GCUUCGGAACAAGAGACCC-3’

反义链：3’-CGAAGCCUUGUUCUCUGGG-5’

针对所述核苷酸序列3’末端的悬挂端2个碱基进行化学修饰。其修饰的特征在于：单独的正义链、反义链或者双链靠近3’末端1位、2位碱基或者1，2位碱基，均可由通式X结构的新型修饰单体替代；3’末端两个碱基中，正义链、反义链或者两条链的一个碱基，由通式X结构的新型修饰单体替代，另一个碱基采用目前常用的化学修饰单体替代，例如：2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸 (2’-Deoxy-2’-fluoro-β-D-arabino nucleic acid，FANA)进行修饰；将不同修饰的正义链和反义链分别进行交叉组合，制备不同化学修饰的siRNA。

本发明所述通式X化合物经以下步骤合成：

以苯酚化合物1a～1d和氯代环氧丙烷为原料，在碱性条件下通过醚化反应，二甲基甲酰胺催化水解开环，可定量制备4a～4d；选择吡啶为溶剂，化合物4的两个羟基用4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)选择性保护，柱分离、纯化，制备5a～5d，收率50～70％；在无水条件下，二异丙氨四氮唑盐为催化剂，按照常用的磷酰胺化反应，获得化学修饰的单体X1～X4；最末端修饰单体的引入，可以采用RNA合成仪中常规的可控微孔玻璃珠(controlled pore glass，CPG)作为固相载体，通过偶联反应，直接引入。反应合成路线如下：

本发明所述化学修饰siRNA通过以下步骤制备：

将合成制备获得的修饰单体(X)，采用RNA合成中常规的亚磷酰胺化的合成方法，利用BLP-192 DNA/RNA High Throughput Synthesizer仪制备获得不同化学修饰的siRNA单链寡核苷酸粗品。所合成的寡核苷酸通过HPLC(SepPakcartridges，Millipore，Nepean ON)去盐、纯化。将化学合成的等比例siRNA正义链和反义链的寡核苷酸加入10mM磷酸钠与100mM的氯化钠缓冲溶液中，加热90℃，保持15min，缓慢冷却至室温，4℃保存过夜，制备获得双链的siRNA，-80℃冷冻保存备用。

本发明所述化学修饰siRNA的生物学活性通过以下方式测定：

按照Lipofectamine RNAiMAX Reagent产品说明书所描述的24孔及96孔板操作规程，转染siRNA，转染后24h，倒掉培养液，加入Trizol试剂，提取总RNA，用无RNA酶水稀释，于紫外分光光度计上测RNA的浓度。利用实时定量RT-PCR方法(Invitrogen，Cat.No.：18064-022，，014，071)，测定不同修饰Mdm2-siRNA的基因沉默作用。

以4ng RNase处理0.25uL siRNAs，反应体系为10uL，置37℃，5％CO2培养箱培养。在不同时间点加入RNA上样缓冲液，终止反应，-80℃冷冻保存备用。将不同时间点收集的siRNAs和对照样品，进行20％聚丙酰胺凝胶电泳(80V，30mA，120min)，SYBR Gold法染色，采用灰度扫描法测定siRNAs的体外半衰期。

取对数生长期的乳腺癌细胞(MCF-7)悬浮于含10％小牛血清(FBS)的培养液中，以每孔9000细胞接种于96孔培养板中，参照Invitrogen公司LipofectamineTM 2000转染试剂说明进行转染，48小时后通过SRB方法检测细胞生长抑制率。

实验结果表明，化学修饰siRNAs对人乳腺癌MCF-7细胞的活性抑制和核酸酶稳定性均有明显提高，其中siRNA6体外RNA水解酶的半衰期约为5.5h，相对于未修饰siRNA1，基因沉默作用、稳定性以及体外抗肿瘤活性，分别提高约2、2和3倍左右。siRNA6能显著降低肿瘤细胞Mdm2的表达，同时也显示出非常明显的抑制肿瘤生长的活性。说明化学修饰的siRNA6是通过提高未修饰siRNA1的特异性基因沉默作用，增强未修饰siRNA1抑制肿瘤细胞生长的结果。

附图说明：

图1：30nM，不同化学修饰siRNA对Mdm2表达的影响

其中：1-siRNA1；2-siRNA2；3-siRNA3；4-siRNA4；5-siRNA5；6-siRNA6

图2：50nM，不同化学修饰siRNA对Mdm2表达的影响

其中：1-siRNA1；6-siRNA6；7-siRNA7；8-siRNA8；9-siRNA9；10-siRNA10；11-siRNA11；12-siRNA12；13-siRNA13；14-siRNA14；15-siRNA15

图3：不同化学修饰siRNA在RNase溶液中

其中：

1，siRNA1；

6，siRNA6；

7，siRNA7；

9，siRNA9；

11，siRNA11；

14，siRNA14；

15，siRNA15

图4：化学修饰siRNA和未修饰siRNA抑制肿瘤细胞生长作用的对比

其中：1，siRNA1；

6，siRNA6

具体实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚的制备

取苯酚(90mmol)，150mL的丁酮，碳酸钾(180mmol)，加入500mL的三口反应瓶中，45℃搅拌下，滴加环氧氯丙烷(630mmol)，约30min滴加完毕，反应液变浑浊，升温到80℃，回流反应10h，冷却，过滤，减压蒸出大部分溶剂，加水100mL，二氯甲烷萃取(100mL×3)，有机层用20％NaOH洗(10mL×3)次，有机层无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸出二氯甲烷。得到黄色油状物2，3-环氧丙基苯醚。

取2，3-环氧丙基苯醚粗品(90mmol)，水(90mmol)，DMF(9mmol)加入反应瓶中，密闭，升温至110℃搅拌反应，反应8h，反应液由浑浊变澄清，结束反应，倒入水中，石油醚洗一次，弃石油醚，水层用2-丁酮萃取三次，无水硫酸镁干燥，蒸出丁酮得到黄色油状物2，3-二羟基丙基苯醚。

加入2，3-二羟基丙基苯醚(90mmol)，70mL的吡啶，搅拌溶解，在45℃下，缓慢滴加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(72mmol)与80mL的吡啶溶液，约2h加毕，室温搅拌反应12h，TLC跟踪(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1，Rf＝0.4)，反应完全，停止搅拌，加200mL水，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机层，有机层用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，柱分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)，得化合物2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，淡黄色油状物，收率61.3％。

1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：3.09(m，2H；CH2)，3.72(s，6H；2OCH3)，3.96-4.04(m，3H；CH2CH)，5.14(d，J＝4.8Hz，1H；OH)，6.84-6.93(m，7H；ArH)，7.19-7.21(m，1H；ArH)，7.25-7.29(m，8H；ArH)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H；ArH)。

《实施例2》2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯基醚的制备

采用4-氟苯酚替代苯酚，操作方法参照实施例1，得淡黄色油状物，收率71.0％。

1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：3.09(d，J＝4.8Hz，2H，CH2)，3.73(s，6H；2OCH3)，4.04-4.13(m，3H；CH2CH)，5.29(d，J＝4.8Hz，1H；OH)，6.89-6.97(m，6H；ArH)，7.08-7.54(m，11H；ArH)。

《实施例3》2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯基醚的制备

采用4-甲基苯酚替代苯酚，操作方法参照实施例1，得淡黄色油状物，收率55.4％。

1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：2.21(s，3H；CH3)，3.07(m，2H；CH2)，3.72(s，6H；2OCH3)，3.90-3.99(m，3H；CH2CH)，5.11(d，J＝4.8Hz，1H；OH)，6.77(d，J＝8.4Hz，2H；ArH)，6.84-6.86(m，4H；ArH)，7.05(d，J＝8.4Hz，2H；ArH)，7.19-7.29(m，7H；ArH)，7.38(d，J＝7.6Hz，2H；ArH)。

《实施例4》2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯基醚的制备

采用4-氯苯酚替代苯酚，操作方法参照实施例1，得淡黄色油状物，收率63.5％。

1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：3.09(d，J＝4.8Hz，2H；CH2)，3.71(S，6H；2OCH3)，3.97(m，2H；CH2)，4.03(m，1H；CH)，5.16(d，J＝5.2Hz，1H；OH)，6.82-6.93(m，6H；ArH)，7.08-7.30(m，11H；ArH)。

《实施例5》2-(3-(2氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰胺氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)-丙基苯基醚的制备

加入2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚(20mmol)，无水二异丙氨四氮唑盐(5mmol)，50mL二氯甲烷，室温搅拌溶解，通氮气保护条件下，冰浴，缓慢滴加2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷酰胺(40mmol)与20mL的二氯甲烷溶液，温度控制在0-5℃，搅拌反应24小时，TLC跟踪，反应完全，停止反应。盐水洗，有机层用无水硫酸镁干燥后，过滤，减压浓缩至尽，快速制备柱分离纯化(正己烷∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶1∶0.1)，得化合物2-(3-(2氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰胺氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)-丙基苯基醚(X1)，白色膏状固体，收率82％。

1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.03(m，3H；CH3)，1.19(m，9H；3CH3)，2.45-2.55(m，2H；CH2)，3.37-3.38(m，2H；2CH)，3.72-3.79(m，4H；2CH2)，3.83(s，6H；2CH3)，4.11-4.14(m，1H；CH)，4.30(m，2H；CH2)，6.81-6.82(m，4H；ArH)，6.85-6.95(m，3H；ArH)，7.20-7.35(m，9H；ArH)，7.43-7.46(m，2H；ArH)。

MS(ESI)m/z(M+H+)：671.3。

《实施例6》2-(3-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯醚的制备

采用2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯基醚替代2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，操作方法参照实施例5，得2-(3-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯醚(X2)，白色膏状固体，收率92％。

1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：0.96(m，3H；CH3)，1.09(m，9H；3CH3)，2.37-2.49(m，2H；CH2)，3.27-3.29(m，2H；2CH)，3.45-3.75(m，4H；2CH2)，3.80(s，6H；2CH3)，3.89-4.05(m，1H；CH)，4.15-4.25(m，2H；CH2)，6.69-6.77(m，6H；ArH)，6.86-6.91(m，2H；ArH)，7.13-7.25(m，7H；ArH)，7.34-7.37(m，2H；ArH)。

MS(ESI)m/z(M+H+)：689.3。

《实施例7》2-(3-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯醚的制备

采用2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯基醚替代2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，操作方法参照实施例5，得2-(3-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯醚(X3)，浅黄色油状物，收率75％。

1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.06(m，3H；CH3)，1.17(m，9H；3CH3)，2.28(s，3H；3CH3)，2.45-2.56(m，2H；CH2)，3.21-3.37(m，2H；2CH)，3.52-3.75(m，4H；2CH2)，3.81(s，6H，2CH3)，3.99-4.08(m，1H；CH)，4.21-4.32(m，2H；CH2)，6.72-6.81(m，6H；ArH)，7.05-7.10(m，2H；ArH)，7.19-7.37(m，7H；ArH)，7.42-7.47(m，2H；ArH)。

MS(ESI)m/z(M+H+)：685.1。

《实施例8》2-(3-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯醚的制备

采用2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯基醚替代2-羟基-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，操作方法参照实施例5，得2-(3-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯醚(X4)，白色泡状物，收率84％。

1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：0.96(m，3H；CH3)，1.08(m，9H；3CH3)，2.35-2.49(m，2H；CH2)，3.27-3.28(m，2H；2CH)，3.46-3.75(m，4H；2CH2)，3.80(s，6H；2CH3)，3.90-4.05(m，1H；CH)，4.15-4.25(m，2H；CH2)，6.69-6.75(m，6H；ArH)，7.13-7.25(m，9H；ArH)，7.34-7.37(m，2H；ArH)(见附录二，Fig.31)。MS(ESI)m/z(M+H+)：705.3。

《实施例9》化学修饰的寡核苷酸合成

以可控微孔玻璃珠(controlled pore glass，CPG)作为固相载体，将0.01M的化学修饰单体X溶于无水乙腈中，加入等比例的5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)进行活化，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，与CPG所连羟基，或者CPG所连脱氧胸腺嘧啶(dT)的5′羟基，或者CPG所连2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖胸腺嘧啶(dTf)的5′羟基，偶联反应15min，将化学修饰单体X连接到预设计的寡核苷酸序列中；向制备获得的寡核苷酸固相载体中，加入新鲜的浓氨水，55℃反应12h，裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键，断裂下来的寡核苷酸带有自由的3′羟基，由此制备获得化学修饰的寡核苷酸粗品。所合成的寡核苷酸通过HPLC(SepPakcartridges，Millipore，Nepean ON)去盐、纯化，制备获得不同修饰的寡核苷酸(oligonucleotides，ONs)，寡核苷酸的序列见表1。

表1 不同化学修饰的寡核苷酸(oligonucleotides，ONs)序列表

《实施例10》化学修饰的寡核苷酸合成

将等比例不同修饰的正义链和反义链寡核苷酸加入10mM磷酸钠与100mM的氯化钠缓冲溶液中，加热90℃，保持5min，缓慢冷却至室温，4℃保存过夜，制备获得化学修饰的siRNA，-80℃冷冻保存备用，化学修饰siRNA的序列见表2。

表2不同化学修饰siRNA的序列表

说明：dT，脱氧核糖腺苷；dTf，FANA修饰的脱氧核糖腺苷；siRNA1为未修饰对照，黑体字，含不同取代基团芳香结构的修饰单体Xn；G、C、U、A为4种RNA的碱基；两条双链上面的序列是正义链，下面的序列是反义链。

《实施例11》Mdm2生物活性检测

按照Lipofectamine RNAiMAX Reagent产品说明书所描述的24孔及96孔板操作规程，转染siRNA，转染后24h，倒掉培养液，收集细胞于玻璃离心管中，室温离心10min，用真空泵吸尽上清，加入Trizol试剂，于15-30℃放置5min，裂解细胞。加0.2mL氯仿/(1mL Trizol试剂)，振摇均匀。2-8℃离心15min，离心后水相转移至另一个EP管中，向其中加入0.5mL异丙醇/(1mL Trizol)试剂。在15-30℃放10min，2-8℃离心10min，弃尽上清，洗涤沉淀，短时间干燥RNA沉淀。用20μL双蒸水(RNase-free water)溶解RNA沉淀，提取到的RNA用无RNA酶水稀释于紫外分光光度计上测浓度，其余-80℃冻存。利用实时定量RT-PCR方法(Invitrogen，Cat.No.：18064-022，，014，071)测定30nM和50nM不同修饰的Mdm2-siRNA的基因沉默作用。结果如图1和2所示，1、2、3、4、6号siRNA浓度为30nM时，细胞MDM2表达率分别为71.53％、75.61％、66.89％、38.24％、34.39％；1、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15号siRNA浓度为50nM时，细胞MDM2表达率分别为49.09％、25.41％、26.31％、27.74％、19.39％、21.86％、36.95％、40.71％、46.23％、15.32％、16.53％。

《实施例12》siRNA稳定性检测

用双蒸水将siRNA配制成40μM的溶液，RNase配制成2ng/μL的溶液。取0，30，60，90，120，180，240min作为检测点。

每个时间点溶液配比如下：

siRNA 0.25μL

双蒸水 5μL

RNase 1μL

混匀后，置37℃、5％CO2计时，时间到时，每管加Loading buffer(5×)2μL，-80℃保存。

电泳条件：

聚丙烯酰胺凝胶，上样量7μL，电压80V，电泳一小时后，用SYBR Gold(0.01％)染色10min。

聚丙烯酰胺凝胶配比：

20％丙烯酰胺 24mL

TBE(5×) 6mL

AP(10％) 0.2mL

TEMED 10μL

实验结果如图3所示，siRNA1、6、7、9、11、14、15的半衰期分别为100、330、100、180、230、160、170min。

《实施例13》SRB法检测siRNA对肿瘤细胞的增殖抑制作用

根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的贴壁肿瘤细胞以200μL/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24h后转染，每个浓度设3个复孔，并设相应浓度的培养液对照。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48h。取出培养板，倒掉培养液，每孔加入200μL PBS生理盐水，而后加入50μL 50％(m/v)TCA固定细胞，4℃放置1h。弃固定液，用去离子水洗涤5次，空气中自然干燥。每孔加SRB溶液100μL，室温振荡10min。吸去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μL/孔的Tris溶液，振荡10min。在酶联免疫检测仪(Model3550，Bio-Rad)测定OD值，用空白对照调零，所用波长为492nm。

按以下公式计算肿瘤细胞生长的抑制率：

抑制率＝[(OD492对照孔-OD492给药孔)/OD492对照孔]×100％

结果如图4所示，siRNA1在10nM、30nM、100nM、300nM时对细胞的抑制率分别为15.98％、27.42％、39.57％、63.01％，IC₅₀值为150.6nM；siRNA6在10nM、30nM、100nM、300nM时对细胞的抑制率分别为22.26％、35.38％、61.76％、88.00％，IC₅₀值为46.5nM.。siRNA6比未修饰siRNA1对细胞的抑制活性提高约3倍。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>一种新型siRNA化学修饰单体及其制备方法和用途

<140>201010210043.4

<141>2010-06-22

<160>4

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>MDM2-siRNA A正义链

<400>1

cuucggaac aagagaccc 19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>MDM2-siRNA A反义链

<400>1

gggucucuug uuccgaagc 19

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>n＝dT或X1dT或X2dT或X1或dTf或X2

<400>1

gcuucggaac aagagacccn n 21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>n＝dT或X1dT或X2dT或X1或dTf或X2

<400>1

gggucucuug uuccgaagcn n 21

Claims

1.一种新型化学修饰单体化合物，其结构如通式X所示：

其中：

R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基，单取代或双取代氨基；

R1可以是单取代，也可以是多取代的基团，多取代基团可以为邻位、间位或者对位。

2.如权利要求1所述单体化合物，其中R1优选自氢、氟、氯、甲基。

3.一种化学修饰siRNA，其特征在于，用权利要求1所述单体化合物对siRNA正义链、反义链核苷酸序列进行3′末端的悬挂端碱基化学修饰。

4.如权利要求3所述化学修饰siRNA，其特征在于，3′末端两个碱基，正义链、反义链或者两条链靠近3′末端1位、2位碱基或者1，2位碱基均可由通式X结构的新型修饰单体替代。

5.如权利要求3或4所述化学修饰siRNA，其特征在于，3′末端两个碱基中，正义链、反义链或者两条链的一个碱基，由通式X结构的新型修饰单体替代，另一个碱基采用目前常用的化学修饰单体替代。

6.如权利要求5所述化学修饰siRNA，其特征在于，常用的化学修饰单体优选2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-Deoxy-2′-fluoro-β-D-arabino nucleic acid，FANA)。

7.如权利要求3、4、5或6所述化学修饰siRNA，其特征是，将不同修饰的正义链和反义链进行交叉组合，制备不同化学修饰的siRNA。

8.权利要求1所述化学修饰单体修饰的siRNA在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。