CN101919409A

CN101919409A - 一种复合型昆虫病毒增效剂及其制备方法

Info

Publication number: CN101919409A
Application number: CN2010100136304A
Authority: CN
Inventors: 王敦; 张雅林; 李坚; 项林平; 刘强; 徐红星; 甘恩宇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-01-20
Filing date: 2010-01-20
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-01-20
Also published as: CN101919409B

Abstract

本发明公开的一种复合型昆虫病毒增效剂，按照体积百分比，由以下组分组成：毒素蛋白水溶液：2％-8％，斑蝥素乳油：0.3％-1.5％，Tween-80乳化剂：1％-3％，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％。制备该增效剂的方法，具体按照以下步骤实施：构建表达毒素蛋白基因工程菌株；诱导表达毒素蛋白；收集表达毒素蛋白；制备活性毒素蛋白水溶液；将上述组分混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂。本发明复合型昆虫病毒增效剂及其制备方法，制备过程简单，制备得到的增效剂能够达到提高昆虫病毒杀虫剂杀虫活性、提高防治效果的作用。

Description

一种复合型昆虫病毒增效剂及其制备方法

技术领域

本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种复合型昆虫病毒增效剂，本发明还涉及该增效剂的制备方法。

背景技术

杆状病毒在害虫的可持续治理中呈现出诱人的前景，国内外已经有多种杆状病毒应用于害虫的生物防治。其中NPV已经被成功地应用于害虫的防治。NPV是我国第一个商品化昆虫病毒杀虫剂，具有使用安全，害虫不产生抗药性等优点。但病毒对昆虫的致死作用相对缓慢，通常在1周～2周，在这种情况下，尽管害虫最终被病毒杀死，但害虫被致死前往往已经对农林作物造成了不可挽回的经济损失，这也正是昆虫病毒杀虫剂在生产应用上的主要瓶颈问题之一，许多昆虫病毒杀虫剂因此而不被生产单位所采纳。因此，研究和利用昆虫病毒的增效剂，来缩短害虫的致死时间、增强昆虫病毒的杀虫效率，最大程度地挽回害虫对农林作物造成的损失具有重要的现实意义。

CryIAB毒蛋白是来源苏云金杆菌的昆虫特异性毒素蛋白，其作用目前认为是对昆虫的中肠结构产生了破坏，而对人畜无害(Xu W.T.et al.，Food andChemical Toxicology，2009，47(7)：1459-1465)。对该蛋白的研究主要集中在将该蛋白编码基因转入植物获得抗虫转基因植物(Peferoen M.，Trends inBiotechnology，1997，15(5)：173-177)。但目前的研究发现，一些昆虫已经对CryIAB产生了抗性，意味着单用CryIAB毒蛋白防治害虫并不可靠(Wu X.Y.et al.，Journal of Invertebrate Pathology，2009，102(1)：44-49)。但利用CryIAB毒蛋白作为病毒的增效剂截止目前尚无报道。

斑蝥素(Cantharidin，C₁₀H₁₂O₄)是来源于鞘翅目(Coleopera)芫菁科(Meloidae)昆虫体内的一种天然单萜类昆虫毒素，是斑蝥体内的防卫性物质。斑蝥素的化学名称为exo型，1，2顺式-二甲基，3，6-氧桥六氢化邻苯二甲酸酐；分子量为196.2。斑蝥素目前主要的应用和研究在医药上，已经有斑蝥素及其衍生物的医药产品，主要作为为抗癌有效物质，对多种癌症有治疗作用，除抗癌外，尚有治疗病毒性慢性乙型肝炎、白血病、狂犬病、皮肤感染的作用。在农药方面，斑蝥素具有一定的的杀虫作用，斑蝥素对多种害虫表现有拒食、胃毒和一定的触杀作用。斑蝥素添加饲喂后可引起菜蛾幼虫某些细胞及组织发生病变，其中最为明显的是中肠组织(张志勇，植物保护学报，1998，25(2)：166-170)。通过对粘虫中肠组织病理学观察结果，为研究斑蝥素对昆虫的作用方式提供了最直观的证据，斑蝥素的胃毒作用能引起粘虫瘫痪并大量失水而死亡，对试虫中肠细胞膜和内膜系统的破坏作用可能是斑蝥素的主要致毒机理之一，主要表现在它很容易穿过细胞膜结构，可能与杯状细胞和其它细胞内的线粒体上某个位点有亲合性，阻断了杯状细胞和线粒体的正常功能，引起相关的代谢失调或受阻，进而引起杯状细胞和线粒体的解体死亡(张雅林，昆虫学报，2003，46[3]：272-276)。由于CryIAB毒蛋白和斑蝥素都是作用于昆虫中肠的毒素，能够对昆虫中肠结构造成一定程度的破坏；而昆虫病毒侵染虫体也是通过中肠组织侵入，CryIAB毒蛋白和斑蝥素是否有助于病毒的侵染，是本发明的切入点。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合型昆虫病毒增效剂，能够达到提高昆虫病毒杀虫剂杀虫活性、提高防治效果的作用。

本发明的另一目的是提供一种上述增效剂的制备方法。

本发明所采用的技术方案是，一种复合型昆虫病毒增效剂，按照体积百分比，由以下组分组成：

毒素蛋白水溶液：2％-8％

斑蝥素乳油：0.3％-1.5％

Tween-80乳化剂：1％-3％

其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％。

本发明所采用的另一技术方案是，一种制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1：制备毒素蛋白水溶液

1)构建表达毒素蛋白基因工程菌株；

2)诱导表达毒素蛋白；

3)收集表达毒素蛋白；

4)制备活性毒素蛋白水溶液；

步骤2：制备复合型昆虫病毒增效剂

按照体积百分比，量取2％-8％的步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0.3％-1.5％的斑蝥素乳油，1％-3％的Tween-80乳化剂，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂。

本发明的特点还在于，

其中的构建表达毒素蛋白基因工程菌株，具体按照以下步骤实施：从分离的Bacillus thuringiensis中克隆获得CryIAB基因，通过基因克隆、测序鉴定无误后，构建表达载体PET-28a-CryIAB，表达载体电击转化E.coli BL21，获得含有CryIAB毒素蛋白基因的工程菌株E.coli BL21-28a-CryIAB。

其中的诱导表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施：挑取工程菌株E.coliBL21单菌落，接种在10ml含有100ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，按体积百分比为1％接种于含100ug/ml氨苄青霉素1L液体LB培养基中，37℃、260r/min培养至菌液OD600为0.3-0.5时，加入适当浓度的IPTG，进行诱导表达，25-35℃，200-320rpm，诱导4-8hr。

其中的收集表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施：1L表达菌经过6000rpm离心5min收集，100mlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去培养基成分，重复以上过程1-2次，离心收集菌体，10ml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎菌体，强度10-20Hz，处理3-10s，间隔1min，重复2-6次，获得粗裂解液，以粗裂解液作为CryIAB毒素蛋白母液。

其中的制备活性毒素蛋白水溶液，具体按照以下步骤实施：1L粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0.5-1.5g。

其中的斑蝥素乳油的质量浓度为0.1％。

本发明的有益效果是，利用基因工程表达的CryIAB毒素蛋白和斑蝥素复配作为昆虫杆状病毒的生物增效剂，对昆虫NPV和GV病毒均具有明显的增效作用，可显著缩短病毒对害虫的致死时间，对研发绿色环保的生物农药和可持续农业的发展具有积极意义。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

基因工程表达的CryIAB毒蛋白和斑蝥素在极其微量的添加水平(10～80ug/L)对试虫虽然没有明显的毒杀作用，但可以明显缩短昆虫病毒NPV或GV对害虫的致死时间。因此，利用基因工程表达的C毒素蛋白和斑蝥素作为昆虫病毒生物增效剂，就可以有效地克服了传统病毒防治中害虫感染后发病时间长、造成经济损失相对化学农药较大的缺点。

本发明复合型昆虫病毒增效剂，按照体积百分比，由以下组分组成：

毒素蛋白水溶液(0.5g/L)：2％-8％

斑蝥素乳油(0.1％)：0.3％-1.5％

Tween-80乳化剂：1％-3％

其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％。

本发明复合型昆虫病毒增效剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1：

a.制备毒素蛋白水溶液

(1)毒素蛋白基因来源与表达毒素蛋白基因工程菌株构建：

从分离的Bacillus thuringiensis中克隆获得CryIAB基因，通过基因克隆、测序鉴定无误后，构建表达载体PET-28a-CryIAB。表达载体电击转化成E.coliBL21，获得含有CryIAB毒素蛋白基因的工程菌株E.coliBL21-28a-CryIAB。

CryIAB基因的序列为：

ATGGATAACAATCCGAACATCAATGAATGCATTCCTTATAATTGTTTAAG

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ACATCATCGTGGACAGCGTGGAATTACTTCTTATGGAGGAATAA

(2)诱导表达毒素蛋白：

挑取工程菌株E.coli BL21-28a-CryIAB单菌落，接种在10ml含有100ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。按1％(V/V)接种于含100ug/ml氨苄青霉素1L液体LB培养基中，37℃、260r/min培养至菌液OD600为0.3-0.5时，加入适当浓度的IPTG(终浓度10uM)，进行诱导表达，25-35℃，200-320rpm，诱导4-8hr。

(3)表达蛋白的收集：

1L表达菌经过6000rpm离心5min收集，100mlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去培养基成分；重复以上过程1-2次。离心收集菌体，10ml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎菌体(强度10-20Hz；处理3-10s，间隔1min，重复2-6次)，获得粗裂解液。以粗裂解液作为CryIAB毒素蛋白母液。经过测定表达的毒蛋白含量约0.5g/L。

(4)表达蛋白鉴定：

SDS-PAGE和Western blot(HIS单抗)：按《分子克隆》中标准步骤进行。活体测试毒性：以诱导表达空载体的融合蛋白为对照，分别测试CryIAB毒素蛋白母液对棉铃虫和小菜蛾的毒性。

(5)活性蛋白水溶液制备：

1L粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0.5-1.5g。

b.制备斑蝥素乳油

称取1克斑蝥素溶解于300ml二甲基甲酰胺，溶解后加入100mlTween-80，用苯甲醇补足至1L，配制得0.1％斑蝥素乳油1L。

步骤2：制备复合型昆虫病毒增效剂

按照体积百分比，称取2％-8％的步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0.3％-1.5％的步骤1制备的斑蝥素乳油，1％-3％的Tween-80乳化剂，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白10-40mg/L，含斑蝥素3-15mg/L。使用浓度：稀释1000倍。即以1‰比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效剂主要成分的使用终浓度为：毒素蛋白10-40ug/L，含斑蝥素3-15ug/L。

实施例1

步骤1：

a.制备毒素蛋白水溶液

(1)诱导表达毒素蛋白：

(2)表达蛋白的收集：

(3)活性蛋白水溶液制备：

1L粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0.5-1.5g。

b.制备斑蝥素乳油

步骤2：制备复合型昆虫病毒增效剂

按照体积百分比，量取2％步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0.3％的步骤1制备的斑蝥素乳油，1％的Tween-80乳化剂，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白10mg/L，含斑蝥素3mg/L。使用浓度：稀释1000倍。即以1‰比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效剂主要成分的使用终浓度为：毒素蛋白10ug/L，含斑蝥素3ug/L。

实施例2

步骤1：

a.制备毒素蛋白水溶液

(1)诱导表达毒素蛋白：

(2)表达蛋白的收集：

(3)活性蛋白水溶液制备：

1L粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0.5-1.5g。

b.制备斑蝥素乳油

按照体积百分比，量取8％步骤1制备的毒素蛋白水溶液，1.5％的步骤1制备的斑蝥素乳油，3％的Tween-80乳化剂，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白40mg/L，含斑蝥素15mg/L。使用浓度：稀释1000倍。即以1‰比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效剂主要成分的使用终浓度为：毒素蛋白40ug/L，含斑蝥素15ug/L。

实施例3

步骤1：

a.制备毒素蛋白水溶液

(1)诱导表达毒素蛋白：

(2)表达蛋白的收集：

(3)活性蛋白水溶液制备：

1L粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0.5-1.5g。

b.制备斑蝥素乳油

按照体积百分比，称取5％步骤1制备的毒素蛋白水溶液，0.7％的步骤1制备的斑蝥素乳油，2％的Tween-80乳化剂，其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％，混合得到本发明复合型昆虫病毒增效剂，其中每升增效剂含毒素蛋白25mg/L，含斑蝥素7mg/L。使用浓度：稀释1000倍。即以1‰比例添加到使用的病毒悬浮液中。增效剂主要成分的使用终浓度为：毒素蛋白25ug/L，含斑蝥素7ug/L。

本发明病毒增效剂分别以棉铃虫核型多角体病毒HearNPV和小菜蛾颗粒体病毒PxGV为例，进行室内生物测定，以明确本发明增效剂和病毒复配后的增效作用。

①HearNPV增效试验：

供试药剂：

按以下处理，分别口服感染试虫，每处理幼虫40只×3个重复：

A.病毒对照：病毒HearNPV用1×PBS稀释至终浓度为1×10³PIB/ml。

B.增效剂对照：复合型病毒增效剂用1×PBS稀释1000倍。

C.病毒+增效剂组合：病毒HearNPV用1×PBS稀释至终浓度为：1×10³PIB/ml，和复合型病毒增效剂按999∶1的比例混合。

D.阴性对照(无病毒或增效剂)：1×PBS缓冲液。

试虫与感染方法：

2龄蜕皮后饥饿处理12hr的3龄棉铃虫，独立放置于饲养格中，分别将以上A、B、C、D不同处理的药液5ul加到人工饲料块上，确保每只试虫将含药液的饲料块完全取食后，再加入新的无毒饲料，按常规方法养殖。

数据统计与分析：

逐日统计试虫的死亡率，用增效剂对照死亡率校正个药剂处理组的死亡率，计算LT₅₀和LT₉₀，采用DPS系统进行数据分析处理。结果显示：上述三种不同配比的增效剂，病毒+增效剂组合比病毒对照组的LT₅₀和LT₉₀分别至少缩短了1.45d和1.89d，LT₅₀和LT₉₀比对照缩短达到29％和21％以上；增效剂对照组死亡率与阴性对照基本一致，无显著差异，表明低浓度的毒素蛋白和斑蝥素对试虫的死亡率无明显影响。

②PxGV增效试验：

供试药剂：

A.病毒对照：病毒PxGV用1×PBS稀释至终浓度为1×10⁴PIB/ml。

B.增效剂对照：复合型病毒增效剂用1×PBS稀释1000倍。

C.病毒+增效剂组合：病毒PxGV用1×PBS稀释至终浓度为：1×10⁴PIB/ml，和复合型病毒增效剂按999∶1的比例混合。

D.阴性对照(无病毒或增效剂)：1×PBS缓冲液。

试虫与感染方法：

2龄蜕皮后饥饿处理12hr的3龄小菜蛾，分别将以上A、B、C、D不同处理的药液5ul加到人工饲料块上，确保每只试虫将含药液的饲料块完全取食后，再加入新的无毒饲料，按常规方法养殖。

数据统计与分析：

逐日统计试虫的死亡率，用增效剂对照死亡率校正个药剂处理组的死亡率，计算LT₅₀和LT₉₀，采用DPS系统进行数据分析处理。结果显示：上述三种不同配比的增效剂，病毒+增效剂组合比病毒对照组的LT₅₀和LT₉₀分别至少缩短了1.38d(23％以上)和2.97d(27％以上)；而增效剂对照组死亡率与阴性对照基本一致，无显著差异，表明低浓度的毒素蛋白和斑蝥素对试虫的死亡率无明显影响。

Claims

1.一种复合型昆虫病毒增效剂，其特征在于，按照体积百分比，由以下组分组成：

毒素蛋白水溶液：2％-8％

斑蝥素乳油：0.3％-1.5％

Tween-80乳化剂：1％-3％

其余为1×PBS缓冲液，以上各组分的体积百分比之和为100％。

2.根据权利要求1所述的复合型昆虫病毒增效剂，其特征在于，所述的斑蝥素乳油的质量浓度为0.1％。

3.一种制备权利要求1所述的复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1：制备毒素蛋白水溶液

1)构建表达毒素蛋白基因工程菌株；

2)诱导表达毒素蛋白；

3)收集表达毒素蛋白；

4)制备活性毒素蛋白水溶液；

步骤2：制备复合型昆虫病毒增效剂

4.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步骤1中构建表达毒素蛋白基因工程菌株，具体按照以下步骤实施：从分离的Bacillus thuringiensis中克隆获得CryIAB基因，通过基因克隆、测序鉴定无误后，构建表达载体PET-28a-CryIAB，表达载体电击转化E.coliBL21，获得含有CryIAB毒素蛋白基因的工程菌株E.coli BL21-28a-CryIAB。

5.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步骤1中诱导表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施：挑取工程菌株E.coli BL21单菌落，接种在10ml含有100ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，按体积百分比为1％接种于含100ug/ml氨苄青霉素1L液体LB培养基中，37℃、260r/min培养至菌液OD600为0.3-0.5时，加入适当浓度的IPTG，进行诱导表达，25-35℃，200-320rpm，诱导4-8hr。

6.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步骤1中收集表达毒素蛋白，具体按照以下步骤实施：1L表达菌经过6000rpm离心5min收集，100mlPBS缓冲液重新悬浮菌体、洗涤除去培养基成分，重复以上过程1-2次，离心收集菌体，10ml PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎菌体，强度10-20Hz，处理3-10s，间隔1min，重复2-6次，获得粗裂解液，以粗裂解液作为CryIAB毒素蛋白母液。

7.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的步骤1中制备活性毒素蛋白水溶液，具体按照以下步骤实施：1L粗裂解CryIAB毒素蛋白母液中添加苯甲酸钠0.5-1.5g。

8.根据权利要求3所述的制备复合型昆虫病毒增效剂的方法，其特征在于，所述的斑蝥素乳油的质量浓度为0.1％。