CN101209056A - 一种病毒杀虫增效剂与其制法及其在病毒杀虫剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒杀虫增效剂，是ENAHANCIN增强蛋白活性中心片段的原核表达菌液，该活性中心片段为ENAHANCIN蛋白质N端22氨基酸到380氨基酸，分子量大小为33000道尔顿。本发明还提供这种病毒杀虫增效剂的制备方法及其在病毒杀虫剂中的应用方法。该病毒杀虫增效剂能极大地提高病毒的致病力，对病毒杀虫剂的增效作用明显，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程，尤其涉及一种病毒杀虫增效剂。
背景技术
近年来，化学农药对夺取农业增产丰收是起到了巨大的作用，但是也引发了一些具体问题，一方面农林害虫产生了极强的抗性，另一方面严重污染了自然环境，因此生物农药的开发和应用日益受到国内外的高度重视。杆状病毒杀虫剂是生物农药的重要代表，它具有杀虫效果好、不污染环境、不伤害天敌、对人类和其它高等动物无害等诸多优点，因此具有广阔的应用前景。然而，杆状病毒杀虫剂具有杀虫速度慢的突出缺陷，在田间施用野生型病毒杀虫剂3～7天才能看到明显的杀虫效果，这一缺陷极大地限制了它的进一步推广和应用。为了克服杆状病毒杀虫剂的这一缺点，目前多采用增效剂来提高其杀虫速度，这些增效剂可以分为化学增效因子和生物增效蛋白两大类。化学增效因子具有价格低廉和施用方便的优点，但是它具有细胞毒性、会影响有益昆虫在田间的活动、其高残留影响了农产品的出口创汇，这些问题给它的推广带来了难度。为了解决这一问题，目前增效剂开发的热点开始转向对环境相对安全的生物增效蛋白，其中ENHANCIN增强蛋白是近几年研究的热点。
ENHANCIN增强蛋白是一种主要在杆状病毒科(Baculoviridae)的颗粒体病毒属(Granulovirus，GV)中发现的金属蛋白酶性质的蛋白质，这种蛋白能够有效地提高昆虫病毒和其他病原物的感染性，对TnGV的ENHANCIN研究表明，ENHANCIN能降解昆虫中肠围食膜粘蛋白IIM，提高围食膜的通透性，以增加病毒的相对感染速度和感染量来实现其增强作用。纯化的粉纹夜蛾颗粒体病毒(TnGV)增效蛋白与AcMNPV一同饲喂粉纹夜蛾幼虫时，能使AcMNPV的感染力提高12倍；与Bt混合使用，能使Bt的毒力提高2-7倍。因此，增强蛋白在提高杆状病毒杀虫效率和拓宽害虫综合防治等方面具有广阔的应用前景。
值得注意的是，虽然目前ENHANCIN已被应用于重组病毒和转基因植物的研究，但真正能够被实施的应用方式是将增强蛋白原核表达后与病毒制剂混合施用，或将GV直接与NPV混合施用，成本高而效果差。这些问题的存在原因可以归结于目前对ENHANCIN功能的研究还很不深入。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病毒杀虫增效剂，进一步地，提供这种病毒杀虫增效剂的制备方法，并提供其在病毒杀虫剂中的应用方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种病毒杀虫增效剂，是ENAHANCIN增强蛋白活性中心片段的原核表达菌液，该活性中心片段为ENAHANCIN蛋白质N端22氨基酸到380氨基酸，分子量大小为33000道尔顿。
这种病毒杀虫增效剂的制法，是在无菌LB培养液中直接接种转入了包含ENHANCIN活性片段的重组质粒的大肠杆菌，37℃进行扩大培养至饱和状态，收集菌液即可。
所述病毒杀虫增效剂在病毒杀虫剂中的应用。
所述病毒杀虫增效剂在病毒杀虫剂中的应用方法，是将所述的病毒杀虫增效剂直接加入病毒杀虫剂并混合均匀即可，病毒杀虫增效剂的加入量为每毫升病毒杀虫剂中加入20～40亿。
发明人对已测序的ENHANCINs进行了生物信息学分析，并对TnGV的ENHANCIN分别进行了原核和真核表达，发现这个近800个氨基酸残基组成的蛋白质的表达量相对较低，认为其原因可能是这个大分子量的蛋白质给载体和宿主带来了很大生存压力。发明人利用分子克隆手段，将ENHANCIN的活性中心划定在了蛋白质锌指结构区附近的300多个氨基酸残基范围内。此活性中心片段的原核表达产物对载体的压力小、表达量高，同时又保持了增强蛋白的高活性。发明人将此表达产物与杆状病毒混合感染幼虫时，发现幼虫的死亡时间可以缩短到2-4天，五龄幼虫的死亡率由12％上升到70％，说明该病毒杀虫增效剂能极大地提高病毒的致病力，对病毒杀虫剂的增效作用明显，具有很好的应用价值。
具体实施方式
实施例1：先制备病毒杀虫增效剂：在无菌LB培养液中直接接种转入了包含ENHANCIN活性片段的重组质粒的大肠杆菌，37℃进行扩大培养至饱和状态，OD≈4，收集菌液即可。
然后制备病毒杀虫剂：准备以下体积份的原料：氟啶脲0.01～0.05，色氨酸0.01～0.1，分散剂1～2，甘油2～5，荧光增白剂0.2～0.5，无菌水92.35～96.78，将它们搅拌均匀后，向其中按5～20亿PIB/ml的比例加入杆状病毒，最后按20～40亿/ml的比例加入病毒杀虫增效剂，搅拌均匀即可。分散剂可以是L602、LH656或L656的任一种。
实施例2：在本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲0.1毫升，色氨酸0.3毫升，L656分散剂10毫升，甘油20毫升，荧光增白剂5毫升，杨扇舟蛾颗粒体病毒20000亿PIB，病毒杀虫增效剂20000亿菌体。首先将杨扇舟蛾颗粒体病毒、氟啶脲、病毒杀虫增效剂混合，然后依次加入甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂，最后加入无菌水定容到1升，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
实施例3：在本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲0.5毫升，色氨酸1毫升，LH656分散剂10毫升，甘油20毫升，荧光增白剂2毫升，杨扇舟蛾颗粒体病毒5000亿PIB，病毒杀虫增效剂20000亿菌体。首先将杨扇舟蛾颗粒体病毒、氟啶脲、病毒杀虫增效剂混合，然后依次加入甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂，最后加入无菌水定容到1升，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
实施例4：在本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲0.5毫升，色氨酸1毫升，L602分散剂10毫升，甘油20毫升，荧光增白剂3毫升，杆状病毒10000亿PIB，病毒杀虫增效剂40000亿菌体。首先将杆状病毒、氟啶脲、病毒杀虫增效剂混合，然后依次加入甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂，最后加入无菌水定容到1升，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
实施例5：在本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲0.5毫升，色氨酸1毫升，LH656分散剂10毫升，甘油20毫升，荧光增白剂4毫升，杨扇舟蛾颗粒体病毒5000亿PIB，病毒杀虫增效剂40000亿菌体。首先将杨扇舟蛾颗粒体病毒、氟啶脲、病毒杀虫增效剂混合，然后依次加入甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂，最后加入无菌水定容到1升，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
实施例6：在本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲5毫升，色氨酸10毫升，L656分散剂200毫升，甘油500毫升，荧光增白剂50毫升，无菌水9235毫升，杨扇舟蛾颗粒体病毒60000亿PIB，病毒杀虫增效剂300000亿菌体。首先将氟啶脲、甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂、无菌水混合均匀，然后加入杨扇舟蛾颗粒体病毒、病毒杀虫增效剂，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
实施例7：本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲0.1毫升，色氨酸1毫升，L602分散剂20毫升，甘油30毫升，荧光增白剂3毫升，无菌水945.9毫升，杨扇舟蛾颗粒体病毒8000亿PIB，病毒杀虫增效剂35000亿菌体。首先将氟啶脲、甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂、无菌水混合均匀，然后加入杨扇舟蛾颗粒体病毒、病毒杀虫增效剂，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
实施例8：本实施例中，用与实施例1相同的方法制备病毒杀虫增效剂。
选用氟啶脲0.1毫升，色氨酸0.1毫升，L656分散剂10毫升，甘油20毫升，荧光增白剂2毫升，无菌水967.8毫升，杆状病毒5000亿PIB，病毒杀虫增效剂35000亿菌体。首先将氟啶脲、甘油、色氨酸、分散剂、荧光增白剂、无菌水混合均匀，然后加入杆状病毒、病毒杀虫增效剂，搅拌均匀，得到悬浮剂即可。
Claims (4)
1.一种病毒杀虫增效剂，其特征在于：是ENAHANCIN增强蛋白活性中心片段的原核表达菌液，该活性中心片段为ENAHANCIN蛋白质N端22氨基酸到380氨基酸，分子量大小为33000道尔顿。
2.如权利要求1所述的病毒杀虫增效剂的制法，其特征在于：在无菌LB培养液中直接接种转入了包含ENHANCIN活性片段的重组质粒的大肠杆菌，37℃进行扩大培养至饱和状态，收集菌液即可。
3.如权利要求1所述的病毒杀虫增效剂在病毒杀虫剂中的应用。
4.如权利要求1所述的病毒杀虫增效剂在病毒杀虫剂中的应用方法，其特征在于：将所述的病毒杀虫增效剂直接加入病毒杀虫剂并混合均匀即可，病毒杀虫增效剂的加入量为每毫升病毒杀虫剂中加入20～40亿。
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