CN101914545A - 文昌鱼富含亮氨酸蛋白alm基因及其应用 - Google Patents

文昌鱼富含亮氨酸蛋白alm基因及其应用 Download PDF

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本发明涉及文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因及其编码的富含亮氨酸蛋白ALM，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明通过引物扩增基因片段和RACE基因UTR序列，从文昌鱼总RNA中克隆得到ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的ALM蛋白的氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本发明的富含亮氨酸蛋白ALM经初步验证，能较为广泛地结合多种细菌，具有明显的细菌结合、细菌凝集和抑制细菌生长的作用，可开发为天然的抑菌活性物质以及用于制备治疗感染性疾病的药物。

Description

文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因及其应用
技术领域
本发明涉及文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因及其编码的蛋白ALM，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
背景技术
文昌鱼(Branchiostoma Japonicum)属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门(Cephalochordate)，是脊椎动物“姐妹群”(Sister Group)头索动物亚门的代表动物，其形态与脊椎动物相似，具有脊椎动物的一些共同特征。大量数据表明，现存的文昌鱼虽然不是现代脊椎动物的直接祖先，但是它和脊椎动物的直接祖先相似，在从无脊椎动物到脊椎动物的进化过程中，具有非常重要的位置。文昌鱼独特的进化地位使其成为人们研究免疫学的一个重要对象，近年来的研究已经发现了不少具有重要意义的免疫基因。
作为蛋白质的一个重要组分，氨基酸的重复越来越引起人们的重视，尤其是真核生物的蛋白质。人们第一次认识那种重复结构是在富含亮氨酸的α2-糖蛋白中，因此被命名为富含亮氨酸的结构重复(Leucine-Rich repeat，LRR)。自那以后，人们陆续发现越来越多的具有不同功能的蛋白质也存在这种LRR结构。LRR通常由20-29个氨基酸且含有保守的11个氨基酸的基本序列所构成，这11个氨基酸的基本序列是L**L*L**N(C)*L(*可以是任何氨基酸，L的位置也可以为亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸，N可以为天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，C为丝氨酸和半胱氨酸)。除了这11个氨基酸外，其他的氨基酸表现屡可变。第一个LRRs的三维晶体结构是在核糖酶抑制剂中发现的，LRRs在整个蛋白中是一种结构单元，每一个单元由一个β链以一个环与α螺旋相接，这种结构使得所有链都螺旋围绕着公共轴旋转而呈现平行结构，从而最终形成了非球形的马蹄结构，该结构内部为平行的β折叠，外部则为螺旋结构。
LRR参与许多重要的生命活动，如激素-受体的的相互作用、酶的抑制、细胞粘附和细胞内的交通。近来研究也证实LRR蛋白参与早期哺乳动物的发育、神经的发育、细胞的极化、基因表达的调节和细胞凋亡。研究还显示：LRR结构域对细胞骨架的形态和运动起着十分重要的作用。在以上所有的功能中，LRR结构域都可能是通过介导细胞与细胞间的相互作用来实现。除了提供细胞与细胞间的相互作用外，这种重复结构还有利于快速产生新的突变，如植物的抗病和细菌的毒力，因为其进化非常快。研究显示，一系列的人类疾病与编码含LRR的蛋白的基因突变有关。这种突变至今报道的主要有两种类型：典型的和核糖酶抑制剂型。这些突变很可能影响其与配体亲和性的改变或不同蛋白的其他结构域的相互作用，有时还可能引起功能的丧失，这些规律对引导我们进行药物设计和治疗疾病具有重要的参考价值。
植物基因组水平上存在的大量抗病基因(Resistance Gene，R基因)可使之在生长发育过程中抵抗病原微生物的侵染。R基因同病原微生物的致病基因存在着基因对基因(Gene for Gene)的遗传学关系。目前已从11种植物中克隆了30余个R基因，这些基因绝大多数编码了植物信号传导途径的相关蛋白。在上述克隆的R基因中，至少有25个属于带有富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点(LRR-NBS)的基因家族。LRR-NBS类抗病基因作为植物抗病基因中分布最广和数量最大的一个基因家族，其作用日益受到人们关注。拟南芥测序计划完成后，分析它的基因组，发现其中有近200个NBS-LRR类抗病基因。研究表明，LRR结构域与直接或间接的病原相互识别有关。有证据支持单一的LRR的氨基酸空间结构可以参与蛋白质识别。
通过对文昌鱼基因组全序列进行比较基因组学分析显示：大约有6600个LRR模序结构其编码约1776个富含LRR的蛋白存在于文昌鱼的基因组中。我们同时也用smart soft和tmhmm soft对NCBI数据库中已有的一些物种的基因组进行了分析预测(Homo sapiens，Mus musculus，Takifugu rubripes，Xenopus tropicalis，Gallus gallus，Drosophila melanogaster，Danio rerio，Ciona intestinalis和Caenorhabditis elegans来自ensembl，Arabidopsis thaliana来自tigr，Branchiostoma Floridae来自JGI，urchin Strongylocentrotus_purpuratus来自NCBI)。每一个物种的非冗余蛋白通过BLAST program和hmmer程序比对SMART database来获得每一个序列的结构域信息。在所有预测的含LRR蛋白中，大致可将其分成两类：一是分泌型蛋白或细胞内蛋白，共占69％。在这一组中，约44％的蛋白只由LRR结构域构成，另外还有25％的蛋白除了LRR结构域外还有其他类型的结构域组成。另一组则为细胞表面蛋白，共占31％，这类蛋白或者是跨膜蛋白，或者是能过一个GPI结构将其锚定在细胞膜上发挥其作用。在所有选择的12个物种中，文昌鱼中含LRR蛋白的数量最多，约有1770个，文昌鱼中种类繁多的这种含LRR蛋白的功能是个值得深入研究的的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因及其编码的富含亮氨酸蛋白ALM。
本发明的另一个目的在于提供文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM的表达方法。
本发明的再一个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
本发明通过引物扩增基因片段和RACE基因UTR序列的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
由文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因编码的富含亮氨酸蛋白ALM，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。该蛋白的等电点为4.67，分子量为57KDa。
根据文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM的结构域预测结果，通过表达载体pET-21b，分段在大肠杆菌中以胞内包涵体的形式表达重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3，具体包括以下步骤：
1)重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的构建；
2)将重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
3)对转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行培养；
4)重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的提取和变复性处理。
本发明所选择的文昌鱼属于中国青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)，采自山东省青岛市沙子口水域。
本发明通过引物PCR从文昌鱼的cDNA一链中克隆得到了目标基因的部分片段，并对该片段两端进行RACE扩增，再设计引物克隆得到目标基因全长序列，命名为ALM基因(Amphioxus LRR-containing Molecule)，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码520个氨基酸，其氨基酸序列如序列表<400>2序列所示，N端含有22个氨基酸组成的信号肽，接下来是含35个氨基酸的LRRNT和1个含有18个氨基酸的LRR结构，然后是14个串联重复的含标准结构的由24个氨基酸所构成的富含亮氨酸的LRR结构，其二级结构如图1A所示。ALM蛋白约为57KDa，理论等电点pI为4.67，为酸性蛋白。通过对ALM蛋白的C端氨基酸残基进行GPI结构预测，发现其具有典型的GPI结构(SAA)，因此是一GPI锚定蛋白。和其他富含LRR的蛋白相比，ALM蛋白的三维结构也呈现典型的马蹄形(见图1B)，据此可与外源微生物结合。ALM基因的基因组结构中不含内含子(见图1C)。
本发明通过设计三对引物，将ALM基因三段肽链的序列克隆到原核非融合表达载体pET-21b上，构建重组表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3以T7为启动子，C端有6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。非融合表达蛋白LRR1的等电点为5.44，编码293个氨基酸，分子量约为33KDa；LRR2的等电点为5.78，编码258个氨基酸，分子量约为29KDa；LRR3的等电点为5.39，编码173个氨基酸，分子量约为19.6KDa。通过对培养时间、诱导时间和温度等条件的摸索和优化，LRR1、LRR2和LRR3三个非融合蛋白的表达量都较高，但大部分处于包涵体状态。
本发明还摸索和优化了LRR1、LRR2和LRR3三个非融合蛋白的变复性和纯化条件，得到较纯的可溶性蛋白。
本发明的表达质粒复制方法：参照SBjbrook(SBjbrook，et al.1989，Molecular cloing.ColdSpring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB加富培养基培养转化菌株，用Omega公司试剂盒提取质粒。
本发明的文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM经初步验证，能较为广泛地结合多种细菌，具有明显的细菌结合、细菌凝集和抑制细菌生长的作用，可开发为天然的抑菌活性物质以及用于制备治疗感染性疾病的药物。
附图说明
图1A为ALM蛋白根据SMART软件预测的二级结构以及分段表达蛋白LRR1、LRR2和LRR3的区域；图1B为ALM蛋白预测的三级结构；图1C为ALM基因所在的基因组结构图。
图2为扩增得到的ALM基因全长片段，其中，1为PCR扩增得到的产物，M为DNA分子量标准(DL2000)。
图3为ALM基因的分段重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的构建流程图。
图4为分段重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3诱导表达蛋白LRR1、LRR2和LRR3的SDS-PAGE电泳结果图，其中，1为LRR1，2为LRR2，3为LRR3，M为蛋白分子量标准。
图5A为LRR1、LRR2和LRR3包涵体变复性纯化后SDS-PAGE电泳结果图，其中，1为LRR1，2为LRR2，3为LRR3，M为蛋白分子量标准；图5B为LRR1、LRR2和LRR3包涵体变复性纯化后western blot结果图，其中，1为LRR1，2为LRR2，3为LRR3。
图6为LRR1、LRR2和LRR3蛋白对不同细菌的结合实验结果，其中，细菌包括华纳氏菌(S.warneri)、摩尔根菌(B.morgen)、气单孢菌(A.hydrophila)、解藻酸弧菌(V.alginolyticus)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
图7为LRR1、LRR2和LRR3蛋白对不同细菌的凝集试验结果，其中，细菌包括华纳氏菌(S.warneri)、摩尔根菌(B.morgen)、气单孢菌(A.hydrophila)、解藻酸弧菌(V.alginolyticus)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
图8为LRR2蛋白对细菌的生长抑制试验结果。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：文昌鱼总RNA的提取以及普通cDNA一链和Race cDNA一链的合成
总RNA的提取：取文昌鱼全鱼，采用Trizol试剂法提取总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质，获得文昌鱼总RNA。
普通cDNA一链的合成：取1μg总RNA，按照TOYOBO公司的First Strand cDNASynthesis Kit ReverTra Ace-α-TM(code No.FSK-100)说明书操作，进行逆转录合成用于扩增基因片段和克隆基因全长的cDNA第一链。
Race cDNA一链的合成：按照Invitrogen的GeneRacerTM Kit进行RNA的去磷酸化RACE、脱帽反应、RNA oligo的连接及mRNA的逆转录，从而合成用于Race的cDNA一链。
实施例2：ALM基因片段扩增以及Race 5′和3′末端
取2μl普通cDNA一链产物，根据差减杂交文库中所得片段设计引物5′PCR Primer：5′-GAGGTCGCTTGTGACGGTAG-3′和3′PCR Primer：5′-GTCAAGTTTCCGAGTCCGCT-3′，PCR扩增ALM基因的部分片段346bp。将扩增得到的目标片段连接到pGEX T easy vector(promega)后，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。
取0.5μl Race cDNA一链产物，根据上面扩增得到的部分ALM序列设计进行5′RACE扩增的基因特异的外套引物为5′-gene-specific primer：5′-CGCTGAAAACACCAACACTTAAGGATG-3′，内巢引物为5′-nested primer：5′-CTATTATCCCCAAGGTCAAGGTATCTC-3′；3′RACE扩增的基因特异的外套引物为3′-gene-specific primer：5′-GACGGTAGAGCCTTAACTGAACTGC-3′，内巢引物为3′-nested primer：5′-ATTCCCACTGACACCGCCACA-3′。将扩增得到的目标片段连接到pGEX T easy vector(promega)后，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序，并与前面得到的目标片段进行拼接，得到ALM基因的全长序列，长度是2392bp，编码520个氨基酸的ALM蛋白。
实施例3：ALM基因全长序列的扩增
根据实施例2拼接得到的ALM基因序列，设计引物5′-TCACAACATCTCAGCGAGAA-3′和5′-GGATAAACAGTTGGCACAATCT-3′，采用Takara的PrimeSTAR高保真聚合酶扩增ALM的ORF框基因，扩增得到的2226bp片段的电泳图谱如图2所示。将扩增得到的目标片段加A后连接到pGEX T easy vector(promega)，然后转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了ALM基因的全长序列。
实施例4：重组ALM分段表达质粒的构建
依据ALM基因的序列及其预测的二级结构，设计并合成三对分段表达的引物，上游引物均含BamH I切割位点，下游引物均含Xho I切割位点。
LRR1上游引物LRR1-up：5’-at  GGATCC  TATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’
                  保护碱基   BamH I    ALM基因序列
LRR1下游引物LRR1-low：5’-ta CTCGAG  CCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’
                  保护碱基   Xho I     ALM基因序列
LRR2上游引物LRR2-up：5’-at  GGATCC  GATGCTACAACTCAACAACAAC-3’
                  保护碱基   BamH I    ALM基因序列
LRR2下游引物LRR2-low：5’-ta CTCGAG  CCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’
                  保护碱基   Xho I     ALM基因序列
LRR3上游引物LRR3-up：5’-at  GGATCC  TATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’
                  保护碱基   BamH I    ALM基因序列
LRR3下游引物LRR3-low：5’-ta CTCGAG  CCGCAGAACAGACAGGACATC-3’
                  保护碱基   Xho I     ALM基因序列
以含有ALM基因全长序列的pGEM T easy vector质粒为模板，LRR1-up和LRR1-low、LRR2-up和LRR2-low、LRR3-up和LRR3-low为引物，得到特异扩增的单一条带，产物大小分别为902bp、797bp、542bp。用TaKaRa公司的BamH I和Xho I双酶切PCR扩增产物和质粒pET-21B，用OMEGA公司的试剂盒胶回收酶切产物。将基因的酶切产物克隆到双酶切的原核非融合表达载体pET-21b上，得到重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3(构建过程如图3所示)。重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3中的外源基因经测序鉴定正确。
实施例5：重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表达
将重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经0.5mM的IPTG诱导后有明显的特异表达产物带(见图4)，分子量与预测分子量相吻合。对培养时间、诱导浓度和温度等条件的摸索得出，基因工程菌的培养条件为：将单菌落接种于10ml含有100mg/L氨苄青霉素抗性LB液体加富培养基中，37℃剧烈震荡培养16小时，作为种子菌；取种子菌按1∶100的比例接种于含氨苄青霉素的LB液体加富培养基中，37℃剧烈震荡放大培养至OD600约为0.5～0.6；加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导表达6小时；4℃、8000rpm离心15分钟，收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在该培养条件下，非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表达量占菌体总蛋白的50％以上，但95％以上处于包涵体状态。
实施例6：重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的变复性处理
洗涤变性：将收集的沉淀用1M PBS洗涤两次，12,000rpm室温离心10min，收集沉淀，称湿重，按照1g∶10ml的比例加入Binding buffer，冰浴下超声4个循环(超声4s，间歇4s，重复99次为一个循环)破碎细菌细胞，加入终浓度为1％的Triton-X100，冰上搅拌约30min，12,000g 4℃离心15min，弃上清(留少许作电泳)，沉淀再称湿重，按照1g∶1ml的比例用dd H2O重悬，分成100ul/管共7管，于4℃保存。将分装出的100ul/管的重悬液12,000g 4℃离心15min，每份沉淀再重悬于100ul含不同浓度(1M，2M，3M，4M，5M，6M，8M)尿素的0.1MTris.HCl(pH 8.0)中，静置5min，12,000g 4℃离心15min，取上清作SDS-PAGE电泳，找出最佳包涵体洗涤和变性的条件。实验最后确定先将包涵体用3M尿素-TBS溶液洗去大部分杂蛋白，再将沉淀用6M尿素-TBS溶液进行溶解，进行后述的透析复性处理。
透析复性：将溶解好的包涵体用相应浓度尿素的0.1M Tris.HCl(pH 8.0)进行稀释，使其蛋白质终浓度维持在50ug/ml。将稀释好的包涵体溶解液预冷后装入已经处理好的透析袋中，将两侧透析袋的口扎紧，最后将透析袋转移至透析液中，4℃透析12hr，更换新的透析液(透析液中的尿素浓度逐渐递减，最后浓度为0M)，每隔12hr换一次透析液，透析液要用磁力搅拌器不停进行搅拌，但要注意磁力搅拌子不要碰到透析袋，以免扎破透析袋。透析结束后的包涵体复性液利用超滤手段进行浓缩。将保存在10％乙醇中的合适孔径的超滤膜用去离子水冲洗干净后，安装在超滤仪的罐底部。将超滤仪安装好后固定在磁力搅拌器的上方，通入氮气提供气体压力，操作在层析柜中进行，压力控制在0.1-0.3mPa(14-42psi)之间。闭合超滤仪气体阀门，打开磁力搅拌器，收集滤出液，待超滤仪罐中剩少许液体时，缓慢关闭液氮罐阀门，打开超滤仪气体阀门，停止搅拌，取出罐中液体和滤出液分别进行SDS-PAGE检测。实验结束后，超滤膜清洗后仍保存在10％乙醇中。本实验中使用了切割分子量为1K的超滤膜来进行样品的浓缩处理。
重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2、LRR3经变复性处理后，得到了较纯的蛋白(见图5)，纯度达到90％以上，可进行后续的功能实验分析。
实施例7：重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的细菌结合实验
将华纳氏菌(S.warneri)、摩尔根菌(B.morgen)、气单孢菌(A.hydrophila)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)保存的甘油菌株划线于LB固体固体培养基上，待长出克隆后挑取单克隆于LB液体培养基中于37℃培养活化菌株。解藻酸弧菌(V.alginolyticus)保存的甘油菌株划线于TCBS选择性固体培养基上，待长出克隆后挑取单克隆于高盐的LB液体培养基(3％NaCl)中于37℃培养活化菌株。将华纳氏菌(S.warneri)、摩尔根菌(B.morgen)、气单孢菌(A.hydrophila)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)各10ul接种于10ml LB液体培养基中(无氨苄抗性)，37℃培养过夜。将解藻酸弧菌(V.alginolyticus)以同样比例放大于高盐LB液体培养基中(3％NaCl)，26℃培养过夜。
将过夜培养的菌液于4℃6000g离心5min，弃上清，每管加入3ml预冷的PBS溶液洗涤沉淀三次。每管加入1.6ml预冷的TBS溶液重悬沉淀，重悬后将菌液分装500μl/管+0.1MCaCl2 30μl+20％BSA 30μl+等量的lrr蛋白(上样前先进行BCAP定量)。于4℃孵育2小时后，4℃、转速1000g/分下离心5分钟，弃上清，每管用1ml预冷的TBS溶液洗涤二次。每管用1ml预冷的TBS溶液(含5mM CaCl2)洗涤沉淀三次。弃上清，直接向沉淀中加入20ul SDS-PAGE Loading buffer，于100℃煮10分钟后，上样进行SDS-PAGE电泳，以抗His的单克隆抗体为一抗，Western blot检测(见图6)。
实施例8：重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的细菌凝集实验
将华纳氏菌(S.warneri)、摩尔根菌(B.morgen)、气单孢菌(A.hydrophila)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)各10ul接种于10ml LB液体培养基中(无氨苄抗性)，37℃培养过夜。将解藻酸弧菌(V.alginolyticus)以同样比例放大于高盐LB液体培养基中(3％NaCl)，26℃培养过夜。
取1.5ml过夜培养菌液于1.5ml EP管，4℃、转速10000g/分下离心1分钟。弃上清，每管加1ml预冷的PBS溶液洗涤沉淀二次。弃上清，每管加1ml预冷的PBS溶液重悬沉淀，视沉淀量加入等量的10mg/ml FITC溶液，混匀。室温避光孵育1小时。4℃、转速6000g/分下离心5分钟，弃上清，每管加1ml预冷的PBS溶液洗涤沉淀至上清液澄清。用Binding buffer(PH7.5)洗涤沉淀，4℃、转速6000g/分下离心5分钟。弃上清，加入500μl Binding buffer(PH7.5)重悬菌，每种菌分五组进行实验，每组加入等量的菌液(测OD600值)，各组加样如下：①菌液+Binding buffer，②菌液+Binding buffer+5mM CaCl2，③菌液+10％BSA+Binding buffer+5mM CaCl2，④菌液+lrr蛋白+Binding buffer+5mM CaCl2，⑤菌液+lrr蛋白+Binding buffer+5mM EDTA。室温孵育过夜，第二天在荧光显微镜下观察结果，拍照(见图7)。
实施例9：重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的细菌生长抑制实验
将华纳氏菌(S.warneri)、摩尔根菌(B.morgen)、气单孢菌(A.hydrophila)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)各10ul接种于10ml LB液体培养基中(无氨苄抗性)，37℃培养过夜。将解藻酸弧菌(V.alginolyticus)以同样比例放大于高盐LB液体培养基中(3％NaCl)，26℃培养过夜。
将培养饱和的10ml菌液于4℃、转速5000g/分下离心10分钟。沉淀用1×PBS(pH7.4)洗涤1次，4℃、转速5000g/分下离心2分钟。将菌液稀释之10e-3/ml，20ul菌液+20ul蛋白，混匀，TBS作阴性对照。每组分别涂布三个平板，37℃培养过夜。次日观察和计数平板上生长出的克隆。结果采用秩和检验的方法进行检验(见图8)。
Figure ISA00000202542600011
Figure ISA00000202542600021
Figure ISA00000202542600031

Claims (8)

1.通过引物扩增基因片段和RACE基因UTR序列的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.由权利要求1所述的文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因编码的富含亮氨酸蛋白ALM，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表达方法，其特征在于：根据权利要求2所述的富含亮氨酸蛋白ALM的结构域，通过表达载体pET-21b，分段在大肠杆菌中以胞内包涵体的形式表达。
4.根据权利要求3所述的表达方法，包括以下步骤：
1)重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的构建；
2)将重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
3)对转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行培养；
4)重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的提取和变复性处理。
5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，在步骤1)中所述的重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的构建包括以下步骤：
a)依据权利要求1所述的ALM基因的序列和权利要求2所述的ALM蛋白的结构，合成三对引物，LRR1上游引物LRR1-up为5’atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRR1下游引物LRR1-low为5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR2上游引物LRR2-up为5’-atGGATCCGATGCTACAACTCAACAACAAC-3’，LRR2下游引物LRR2-low为5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR3上游引物LRR3-up为5’-atGGATC CTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRR3下游引物LRR3-low为5’-taCTCGAGCCGCAGAACAGACAGGACATC-3’，其中，上游引物均含有BamH I切割位点，下游引物均含有Xho I切割位点；
b)以含有ALM基因的pGEM T easy vector质粒为模板，以LRR1-up和LRR1-low、LRR2-up和LRR2-low、LRR3-up和LRR3-low为引物，高保真聚合酶PCR扩增基因片段；
c)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pET-21b上，得到重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3。
6.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤3)的培养条件为：将单菌落接种于10ml含有100mg/L氨苄青霉素抗性LB液体加富培养基中，37℃剧烈震荡培养16小时，作为种子菌；取种子菌按1∶100的比例接种于含氨苄青霉素的LB液体加富培养基中，37℃剧烈震荡放大培养至OD600约为0.5～0.6；加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导表达6小时；4℃、8000rpm离心15分钟，收集菌体。
7.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤4)所述的变复性处理包括以下步骤：
a)洗涤变性：将收集的沉淀用1M PBS洗涤两次，12,000rpm室温离心10min，收集沉淀，称湿重，按照1g∶10ml的比例加入Binding buffer，冰浴下超声4个循环破碎细菌细胞，加入终浓度为1％的Triton-X100，冰上搅拌约30min，12,000g 4℃离心15min，弃上清，沉淀再称湿重，按照1g∶1ml的比例用dd H2O重悬，将重悬液12,000g 4℃离心15min，沉淀先用3M的尿素-TBS溶液洗去杂蛋白，再用6M的尿素-TBS溶液进行溶解；
b)透析复性：将稀释好的包涵体溶解液预冷后装入处理好的透析袋中，将两侧透析袋的口扎紧后转移至透析液中，4℃透析12hr，更换新的透析液，每隔12hr换一次透析液，透析液用磁力搅拌器不停进行搅拌，透析结束后的包涵体复性液利用切割分子量为1K的超滤膜进行浓缩。
8.由权利要求3所述的表达方法获得的重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
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