CN101914438A - 一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统 - Google Patents
一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统。本发明Lipus辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统包括设置有转轴的培养主体，培养主体外面套有气室，转轴设置在气室的两端，培养器主体一端设置有Lipus超声仪，Lipus超声仪的超声发射探头插入培养器主体内部，气室的内壁设置有氧气浓度可控部件。本发明培养系统可以在线供氧、供液，有利于培养系统内氧气、二氧化碳和代谢物的运输，同时可精确控制氧气浓度，采用Lipus超声仪作为辅助手段，为细胞或组织的增殖或分化营造了良好的微环境，最终模拟微重力环境进行三维动态培养，并可实现定向的扩增和诱导分化功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程技术领域，具体涉及一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统。
背景技术
美国国家自然科学基金会(NSF)在1987年8月召开的一次学术讨论会上提出了“组织工程”这一概念，并于1988年明确界定其内涵为：“应用工程科学和生命科学的原理和方法，来解释哺乳动物组织的功能-结构关系，并且发展具有活性的人工替代物，来恢复、维持或提高组织的功能”。其关键在于通过对哺乳动物细胞进行离体培养，形成具有特定功能的活组织或各种生物替代物并将其应用于临床。组织工程涉及多方面的科学问题，三维细胞/组织培养系统是其重要技术之一，它与制药工业、乳发酵工程等现代生物化学工程中所采用的生物反应系统以及传统的细胞培养方法存在本质上的不同。如现代生物化学工程中所用的摇瓶、摇床等生物反应系统借助吹气或机械搅拌引起强迫对流等方法保持培养物的悬浮状态，进而改善营养供应，这在微生物培养(如青霉素生产)中是完全可行的，但并不适合哺乳动物细胞培养。原因如下：(1)哺乳动物细胞远比微生物脆弱，机械搅拌形成的直接作用及流动剪切力很容易造成细胞损伤甚至死亡；(2)细胞聚集是细胞培养形成组织的关键一步，然而机械搅拌造成的流动剪切力使得细胞聚集程度降低甚至无法聚集。
另外，在90年代中期以前，医学界利用传统细胞培养方法无法培养出功能与在体组织相同或相似的生物组织，其原因主要在于重力作用导致的细胞沉降以及细胞在培养器器壁之间的接触抑制使得所培养的细胞不能实现真正的三维生长，限制了细胞功能分化，无法长成所需的组织，而空间微重力环境恰好为细胞创造了三维生长的条件。80年代中期美国宇航局(NASA)就开始研制空间生物反应器。90年代初期，NASA Johnson中心发展了旋转管式生物反应器(Rotating Wall Vessel，RWV)，并在1995年航天飞机搭载实验中成功地培养出结肠癌组织，组织切片观察表明其结构与在体组织相似，而且尺寸比传统方法培养的组织大30倍，直径达2cm。又在1997年进行关节软骨组织培养实验，成功地培养出与在体软骨组织结构和功能相似的关节软骨组织，尺寸为厘米量级。这种新型的生物反应器在地面运行时，借助反应器内培养液的流体力学效应也可以有效避免重力沉降，进而确保细胞三维生长。
RWV在底座上用一个支架支撑培养器的内、外筒，其特点在于通过与培养室同轴旋转的内筒利用气/液交换膜在线供气，培养液可停机通过端口更新。这种装置操作简便，而且整个培养过程可视化，适宜用于肿瘤组织药物毒理试验等，但也有一定的局限性：①、只能在线供气不能供氧。经验表明，对细胞/组织培养来说，氧供应比营养物质供应更为紧迫，氧的消耗量大，这对于某些组织(如组织工程等)的培养不利；②、现有培养器不能在线供液。每次更换营养液都必须停机，这会影响细胞的生长；③、现有培养器采用的气液交换膜不耐高温，不便于消毒；④、现有培养器没有采用低强度脉冲超声波等辅助手段为细胞/组织的增殖分化营造良好的微环境，不能很好地诱导细胞定向分化，形成组织。；⑤、供氧浓度不可测定和控制；⑥、价格昂贵。
超声是一种在人类听力频率之外的声压波，可进入生物组织。传导入人体的超声波可引起局部微环境应力的改变，导致机体组织产生细胞水平的生物学反应，其中超声强度在100mW/cm2以下属低强度脉冲式超声波(Low intensity pulsed ultrasound，Lipus)。Lipus是一种使用频率较低和剂量较小的脉冲式超声波，其传递给组织的机械压能量一般＜3mg/cm2，不会引起组织致热效应，从而避免了热副作用。1952年，意大利学者在对兔桡骨骨折的研究中发现超声波治疗可刺激骨痂形成，加快骨折愈合。Lipus最先于1983年应用于骨不连合中的临床治疗，治愈率达68％。由于大量动物实验以及临床试验的验证，美国食品和药物管理局(FDA)对低强度超声波在加速新鲜骨折愈合及治疗骨折不愈合中的作用予以了认可。Lipus目前主要用于骨折治疗，特别是骨延迟愈合、骨不连或放射性骨坏死的治疗。近年来Lipus逐渐被应用于关节软骨、韧带的创伤治疗。另外，Lipus应用于细胞培养方面的研究越来越受到重视，并逐渐取得了瞩目的成果(Takakura Y，Matsui N，Yoshiya S，et al.Low-intensity pulsed ultrasound enhances early healing of medial collateral ligament injuries in rats.Ultrasound Med，2002，21(3)：283-288.Jia XL，Chen WZ，Zhou K，et al.Effects oflow-intensity pulsed ultra sound in repairing injured articular cartilage[J].Chin JTraumatol，2005，8(3)：175-178.)。
目前，应用于细胞培养增殖的Lipus大都采用以下参数：频率1.5MHz，强度30mW/cm2，重复频率1kHz，脉宽200μs。国内外研究表明Lipus对多种细胞如干细胞、软骨细胞、成纤维细胞等的培养有显著促进效果，其可能是通过调节细胞的增殖，促进胶原及非胶原蛋白的合成，影响细胞因子的分泌，从而加速细胞增殖，并在一定条件下诱导细胞分化。
Lipus对细胞增殖的调控与细胞类型、作用条件和环境因素的影响有关。
Warden等人用低强度脉冲超声单次作用于成骨样细胞UMR-106细胞株20min，发现其可提高转录早期反应基因c-fos、COX-2、BMP以及ALP的表达，促进骨折的愈合。Zhang等报道用1.5MHz，脉冲频率1kHz，占空比20％的脉冲超声30mW/cm2可使软骨细胞合成II型胶原和聚合蛋白多糖基因表达增加(Zhang ZJ，Huckle J，Francomano CA，et al.The effects of pulsed low-intensity ultrasound on chondrocyte viability，proliferation，gene expression and matrix production[J].Ultrasound Med Biol，2003，29(11)：1645-1651.)。Schumann也在对骨髓间充质干细胞的研究中发现，Lipus作用后其细胞外基质明显增加(Schumann D，Kujat R，Zellner J，et al.Treatment of human mesenchymal stem cells with pulsed low intensity ultrasound enhances the chondrogenic phenotype in vitro[J].Biorheology，2006，43(3-4)：431-443.)。Li JK用低强度脉冲超声作用于造骨细胞，发现其不仅增加了造骨细胞的数量，还增加了TGF-β1、IL-6、TNF-α的分泌。Lipus可增加NO合成酶的活性，提高NO水平，促进血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor，VEGF-A)基因表达，从而有利于血管内皮细胞的生成，促进血管再生(Wang FS，Kuo YR，Wang CJ，et al.Nitric oxide mediates ultrasound-induced hypoxia-inducible factor-1alpha activation and vascular endothelial growth factor-A expression in human osteoblasts[J].Bone，2004，35(1)：114-123.)，梁国穗教授等人发现这种效应呈剂量依赖性，治疗时间越长，VEGF增加越明显，且治疗后期更明显，可能与治疗后期，细胞分化成熟，需要更多的营养供应有关，同时Lipus作用后人骨膜细胞合成DNA的能力增加，通过对体外培养的人骨膜细胞的研究表明，Lipus可促进骨膜细胞向成熟骨细胞分化，且这种效应呈剂量依赖性，每天治疗20min连续4d较每天治疗10min 2d的效果更好。同时该研究还发现治疗中Lipus对细胞的增殖影响不大，而对细胞分化效应影响更大。Lipus连续治疗28d，与对照组相比骨钙沉积明显增加(Leung KS，Cheung WH，Zhang C，et al.Low Intensity Pulsed Ultrasound Stimulates Osteogenic Activity of Human Periosteal Cells[J].Clin Orthop Relat Res，2004，(418)：253-259.)。Ikeda对间叶来源的多能干细胞的研究发现，Lipus通过活化的磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和p38有丝分裂原蛋白激酶(p38-MAPK)，刺激间叶干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化(Ikeda K，Takayama T，Suzuki N，et al.Effects of low intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells.Life Sci，2006，79(20)：1956-1943)。因此，若能将Lipus应用于细胞/组织培养系统，就能为细胞的增殖、分化营造良好的微环境，更好的加速细胞增殖与诱导细胞分化，形成组织。
此外，新近的研究表明不同氧浓度对各种细胞如干细胞、成骨细胞、软骨细胞、滑膜细胞具有重要的影响。
适度低氧可促进间充质干细胞增殖及凋亡，有利于迁移和趋化，其对分化的影响因细胞类型不同而有所差异。低氧影响间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)的分子机制主要涉及低氧诱导因子1、趋化因子及其受体、基质金属蛋白酶，可形成适合干细胞存在及生长的微环境，促进细胞外基质降解(钟启，曾慧兰.低氧对间充质干细胞生物学特性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(40)：7942-7946.)。不同氧浓度微环境影响MSCs的分化，高浓度氧有助于MSCs成骨和成脂分化，而低浓度氧则表现为分化抑制。低氧对人单核细胞来源成熟树突状细胞基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase，MMP-9)及其组织抑制剂(Tissue Inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)表达的影响，MMP-9和TIMP-1在关节疾病中有着重要的作用，低氧微环境可能同样影响关节软骨等结构(李宁，吴桂英，李启明，等.不同氧浓度微环境对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂肪分化的影响[J].重庆医学，2009，38(19)：2448-2450.宋海波，杨美香，孙锦堂，等.低氧对人成熟树突状细胞MMP-9/TIMP-1及CCR7表达的影响[J].中国病理生理杂志，2009，25(10)：2012-2016)。
缺氧可抑制成骨细胞增殖，同时可以诱导细胞VEGF的表达，加强局部血管形成，从而促进成骨细胞的分化，完成骨创伤的自身修复，并且缺氧对成骨细胞凋亡的促发作用是随缺氧时间的延长而加重的(姚琦，张元和，姜华，等.缺氧对成人成骨细胞增殖及分化的影响[J].中国骨伤，2006，19(7)：417-419.)。缺氧能诱导人滑膜成纤维细胞环氧合酶2(Cyclaoxygenase，COX-2)表达上调的途径显著促进人滑膜成纤维细胞分泌前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)，从而影响关节炎性病变进程(柯金，龙星，刘羽，等.缺氧状态下人颞下颌关节滑膜成纤维细胞环氧合酶2的表达及意义[J].中华医学杂志，2005，85(25)：1747-1751)。5％左右的低氧浓度相当于软骨细胞的体内生存环境，有利于单层和三维培养体系对软骨细胞的培养，过高或过低的氧浓度都不适合。关注氧浓度在软骨细胞生长不同时期的影响，将有利于调控好氧浓度，使细胞较长时间处于较好的生长增殖状态(吴华，吴纪饶，王曼莹.氧浓度对关节软骨细胞体外培养的影响[J].医学综述，2006，12(8)：454-456)。
目前，很多热点研究大多需要控制不同氧浓度进行组织、细胞的培养，以研究高氧、低氧对组织/细胞的生物学特性的影响，但现有的生物反应器虽然能够初步调节供养浓度，但是不够精确，且存在可用的培养仪器少、价格昂贵等问题，这就需要在现有生物反应器中增加一种精确的供氧浓度可控部件。
随着培养技术的成熟、培养规模扩大和骨与软骨组织工程的需求，如何更好地快速扩增干细胞、成骨细胞、软骨细胞、滑膜细胞等，同时定向调控细胞的分化方向，以获得产量多、质量好的骨与软骨组织工程种子细胞应用于临床，将会开拓应用前景，但是现有的生物反应器并不能很好的做到这一点，因此，发明一种能够精确监测和控制氧浓度的生物反应器，使仪器获得更好的研究适应性能，而且将Lipus应用于该系统，就能为细胞/组织的增殖分化营造良好的微环境，更好的诱导细胞增殖与分化，形成组织。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的细胞培养器中存在的不能在线供氧、供液，无法精确控制供氧浓度，交换膜不耐高温、不便于消毒，没有采用辅助手段刺激细胞/组织的增殖、分化，难以提供良好的生长微环境，价格昂贵等问题，提供一种Lipus辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
本发明Lipus辅助下、氧气浓度可控的旋转管式细胞/组织培养系统主要由培养器主体、气室、Lipus超声仪和供氧浓度控制部件组成，培养器主体中包括细胞/组织培养室、培养液流动室和气室，细胞/组织培养室和培养液流动室连为一体并用轴通过转速调节结构与马达带动，可绕轴做变速转动，而气室则独立，不随轴转动，气室的上端设置供氧浓度控制部件。通过绕水平轴旋转模拟微重力环境以及Lipus的辅助共同营造一个更有利于细胞、细胞聚集体和组织三维增殖分化的环境，同时更有利于培养室内氧气、二氧化碳和代谢物的运输。
具体地，本发明Lipus辅助下、氧气浓度可控的旋转管式细胞/组织培养系统结构包括设置有转轴的培养器主体，转轴设置在培养器主体的两端，培养器主体一端设置有Lipus超声仪，Lipus超声仪的超声发射探头插入培养器主体内部。作为一种优选方案，所述Lipus超声仪的超声发射探头上设置有用于固定超声发射探头的分离部件，使之不随着转轴的转动而转动。
其中，所述培养器主体包括设置在同一轴上的内筒和外筒，内筒为培养液流动室，外筒为细胞/组织培养室，在外筒的外面套有气室，在内外筒之间的环形开口上安装有Lipus超声仪的超声发射探头。所述内筒为镂空金属，内筒外壁上固定有液液交换膜；所述外筒为镂空金属，外筒内壁上固定有气液交换膜。所述气液交换膜是用白炭黑、聚乙烯、聚酰胺、玻璃纤维增强的硅橡胶材料，模拟人体肺泡膜，能有效地在线供气供氧，满足细胞对氧气的需要。聚二甲基硅氧烷(PDMS)即硅橡胶膜，具有极为优良的透气性，室温下对氮气、氧气和空气的透过量比天然橡胶高30～40倍，比丁基橡胶则要高600～800倍，是现有气体透过率最高的高分子材料。另外，PDMS化学性质非常稳定，具有显著的疏水性，其常温下的蒸汽压较低，不容易挥发，加之燃点和闪点较高，可在-50～180℃温度范围内长期使用。虽然均质硅橡胶膜存在成膜性和机械强度差等缺点，但是用白炭黑、聚乙烯、聚酰胺、玻璃纤维增强的硅橡胶膜，其机械强度和透过性均有提高，完全可以满足气液交换膜的要求。本发明所用PDMS规格如下：厚度约1.5mm，其孔径小于1μm，最大曝气量为5m3/h；氧利用率＞25％；充氧能力＞0.145kgO2/h。所述液液交换膜为醋酸纤维素滤膜(Acetylcellulose，CA)，CA有很高的流速、热稳定性，以及非常低的吸附性，是水相溶液如缓冲液、血清、培养基除菌过滤的理想用膜。CA中各组分重量比例：醋酸纤维素16～22％；二氧六环5～15％；丙酮55～75％；高氯酸镁1～4％；生物类酯0.1～6％；该滤膜pH4～8范围内稳定，可耐受大多数纯类和油类，最高可耐受180℃。本发明所用CA的规格如下：厚约60μm，其孔径小于1μm，能够过滤分子量小于1000的物质，可采用的灭菌方式为高压灭菌(121℃或者134℃)，干热灭菌180℃)，γ射线或环氧乙烷熏蒸。
作为一种优选方案，所述内筒一端的端轴上设置有分离部件，分离部件上设置有培养液进口和培养液出口，使培养液进、出口和旋转内筒轴分离开来，不随轴的转动而转动。
所述培养系统还包括用于提供新鲜培养液的供液装置、用于存储培养液的培养液存储器和用于收集培养液的培养液收集器，供液装置通过输液泵液管与培养液存储器相连，通过多孔管管道穿过培养器主体内筒的培养液出口，直达培养器主体内筒的另一端，培养液均匀进入细胞/组织培养室，细胞/组织培养室的输出管道与培养液收集器相连。
所述气室还包括进气口和出气口，系统还包括提供气源的供气装置和收集余气的余气收集器，气室的进气口通过进气管与供气装置连接，气室的出气口通过排气管与余气收集器连接。
本发明系统还可以包括驱动装置，驱动装置带动培养器主体以转轴为轴心旋转。其中，所述驱动装置优选变速马达。
本发明培养系统的工作过程如下：
1、本发明使用前需要常规消毒，以保证生物反应器不受污染，本发明采用的两种交换膜均可耐180℃的高温，因此可以采用高温消毒，方便重复使用。
2、根据实际需要加入适当的培养液，同时根据所培养的细胞/组织或研究目的决定培养液的供给速度，选择供氧浓度，同时计算生物反应器的旋转速度和调节Lipus的参数。例如培养软骨细胞可选择参数：强度30mW/cm2，频率1.5MHz，脉宽200μs，重复频率1kHz。生物反应器的旋转速度可以近似使用下式确定：ω＝1.38951×102(L0t)-1/3(ω-回转器的最佳转速，单位为r/min；L0-实验样品到转轴的距离，单位为cm；t-试验持续时间，单位为s)
3、本发明接通电源后，水平旋转，可以模拟微重力环境，促进细胞三维生长，同时辅助以Lipus技术，使细胞更好地增殖分化。在连续供气供氧的条件下，可连续培养，经过一定时间后，便可切断电源，得到产物。
本发明采用的Lipus参数如下：频率1.5MHz，强度30mW/cm2，重复频率1kHz，脉宽200μs，可以根据研究的目的调节相应的参数。
本发明的培养系统是综合考虑了超声波、氧气浓度、旋转、液液交换、气液交换等多重因素的相互制约和影响，通过多次试验摸索而开发出来的，可以适应于干细胞、成骨细胞、软骨细胞、滑膜细胞等多类细胞培养的有机系统。。
Lipus最先于1983年应用于骨不连合中的临床治疗，目前主要用于骨延迟愈合、骨不连或缺血性骨坏死的治疗，且逐渐被应用于关节软骨、韧带损伤的治疗。另外，Lipus应用于细胞培养方面的研究越来越受到重视，并逐渐取得了瞩目的成果(Takakura Y，Matsui N，Yoshiya S，et al.Chin J Traumatol，2005，8(3)：175-178.)。Lipus对多种细胞如干细胞、软骨细胞、成纤维细胞等的培养有显著促进效果，其可能是通过调节细胞的增殖，促进胶原及非胶原蛋白的合成，影响细胞因子的分泌，从而加速细胞增殖，并在一定条件下诱导细胞分化。
但如何将现有的Lipus细胞培养原理跟旋转培养原理结合起来，需要克服Lipus的介入问题、动态刺激和诱导问题、超声力学作用问题等一些技术难题。本发明采用分离部件，即可获得Lipus界面与培养液的接触，也可以让Lipus部件独立不随转轴运转；运用Lipus连续发生和均匀作用等特性，实现培养过程中的动态刺激和诱导；通过计算Lipus超声作用的强度衰减情况，在10cm内超声强度的衰减可以忽略不计，且同时可以部分抵消普通生物反应器旋转培养时的“顶端效应”，使得引入Lipus后的旋转培养更佳均匀、力学分布更好，有利于细胞的增殖和分化。
三维动态的细胞/组织培养系统是骨与软骨组织工程中的重要技术之一，但现有生物反应器培养系统存在不能在线供氧、供液，没有采用辅助手段刺激细胞/组织的增殖、分化，无法精确地控制供氧浓度，交换膜不耐高温、不便于消毒，价格昂贵、仪器少等问题，且随着培养技术的成熟、培养规模扩大和骨组织工程与软骨组织工程的需求，如何更好地快速扩增干细胞、成骨细胞、软骨细胞、滑膜细胞等各类细胞，同时定向调控细胞的分化方向，以获得产量多、质量好的骨组织工程与软骨组织工程种子细胞应用于临床。因此本发明针对现有情况，设计一种能够精确监测和控制氧浓度的生物反应器，使仪器获得更好的研究适应性能，而且将Lipus应用于该系统，就能为细胞/组织的增殖分化营造良好的微环境，更好的诱导细胞增殖与分化，形成组织。本发明克服现有生物反应器的问题，最终实现各部件互相弥补，相互促进的统一、有机效果，利于骨与软骨组织工程的研究和开发，应用前景广泛。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在细胞培养室的一端添加了Lipus超声仪作为辅助装置，能够有效地诱导细胞增殖和/或分化，形成组织；
(2)本发明将气体流动室设置在培养室的外部，气体交换面积更大，交换效率更高；
(3)本发明将内筒设置为培养液流动室，提供在线供液，不需停机更换营养液，能及时、持续地更新培养液，添加营养物质，排除代谢产物，让培养过程更连续，效率更高；
(4)本发明的气液交换膜采用了用白炭黑、聚乙烯，聚酰胺、玻璃纤维增强的硅橡胶材料，模拟人体肺泡膜，能有效地在线供气供氧，满足细胞对氧气的需要；
(5)本发明增加了氧气浓度可控部件，通过此种微调方式可以使培养室内的氧气浓度得到精确控制，利于在低氧、高氧条件下开展研究工作，仪器的研究适应性更好；
(6)本发明使复杂的生物反应器装置小型化，使用的主体材料，液液和气液交换膜均为耐高温材料，可直接高温消毒，清洗、消毒方便彻底；
(7)本发明培养系统价格较低廉。
附图说明
图1为本发明的主体结构图，其中：1为气罩；2为气室；3为外筒；4为细胞培养室；5为内筒；6为培养液流动室；7为进气口；8为出气口；9为出液口；10为进液口；11为分离结构；12为马达；13为齿轮；14为Lipus超声仪；15为水平支撑板；16为超声传导线；17为Lipus超声探头；
图2为供液系统的示意图，其中：20为鲜培养液存贮器；21为流量、压力可调的输液泵；22为培养液输入用的多孔管管道，经阻尼器进入培养室至培养室终端，阻尼器用以调节培养室内压力；23为培养液回收器；10为培养液进口；9为培养液出口；
图3为供气系统的示意图，其中：24为气源，用气管与稳压，调压阀相连，气管出气口连接到培养器气室2；25为稳压调压阀，安装载气路之中；26为进气管与培养器进气口7相连；27为排气管与培养器出气口8相连；28为余气收集器；气室出气口通过排气管27连接余气收集器28上；29为氧气浓度传感器，通过导线30与控制电路31相连，将气室内的氧气浓度情况反应到控制电路；30为导线，连接氧气浓度传感器及控制电路；31为控制电路，与稳压调压阀25相连接，控制气压，进而控制气体浓度。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
采用本发明培养骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stem Cells，MSCs)分化增殖为骨细胞。具体步骤如下：
将MSCs与培养液(其中DMEM与无血清DMEM以1∶1体积比混合)混合加入细胞培养室中，开动培养系统，调到适合的旋转速度，且将Lipus参数调为频率1.5MHz，强度30mW/cm2，重复频率1kHz，脉宽200μs，在37℃的温度下开始进行旋转刺激培养。通过在线供液系统定时向培养室内供应培养液，通过在线供气系统实时向气室内供气，并通过氧气浓度传感系统将氧气浓度控制在适宜的范围内。培养48h后在供液系统中加入骨细胞定向诱导培养基(100ml高糖DMEM诱导液含骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protien，BMP-2)100ng/L、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)100ng/L、维生素C 50μg/ml、胰岛素10U/ml、甲状腺素50μg/ml、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)20ml/L以及牛血清白蛋白1.25μg/ml)，定向诱导细胞分化为成骨细胞，并进一步分化为骨细胞。连续培养4d后停机取出培养物。利用HE染色和扫描电镜对细胞的分化增殖情况进行观察。
实施例2
采用本发明进行MSCs与“胶原/纳米三磷酸钙/透明质酸”(Collagen/nano Tri-calcium Phosphate/Hyaluronic Acid，Col/nano-TCP/HA)骨软骨支架材料联合培养，构建组织工程软骨。具体步骤如下：
将Col/nano-TCP/HA生物材料修剪成直径5mm、厚3mm，取第3代MSCs以1×106/ml密度接种于支架材料内，然后与培养液(其中DMEM与无血清DMEM以1∶1比例混合)混合加入细胞培养室中，开动培养系统，调到适合的旋转速度，将Lipus参数调为频率1.5MHz，强度2mW/cm2，重复频率1kHz，脉宽200μs，在37℃的温度下开始进行旋转刺激培养。通过在线供液系统定时向培养室内供应培养液，通过在线供气系统实时向气室内供气，并通过氧气浓度传感系统将氧气浓度控制在适宜的范围内。培养48h后在供液系统中加入软骨细胞定向诱导培养基(100ml高糖DMEM诱导液含TGF-β100ng/ml、地塞米松100ng/L、维生素C50μg/ml、胰岛素10U/ml、甲状腺素50μg/ml、β-甘油磷酸钠20ml/L以及牛血清白蛋白1.25μg/ml)，定向诱导细胞分化为软骨组织。连续培养4天后停机取出培养物。利用相差倒置显微镜观察和扫描电镜观察复合细胞后的材料结构，对材料的三维立体结构和细胞的粘附、增殖情况进行观察，同时实施病理组织学切片，评估软骨形成情况。
Claims (10)
1.一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统，其特征在于所述培养系统包括设置有转轴的培养器主体，转轴设置在培养器主体的两端，培养器主体一端设置有Lipus超声仪，Lipus超声仪的超声发射探头插入培养器主体内部，培养器主体的上端设置有供氧浓度控制部件。
2.根据权利要求1所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述培养器主体包括设置在同一轴上的内筒和外筒，内筒为培养液流动室，外筒为细胞/组织培养室，在外筒的外面套有气室，在内外筒之间的环形开口上安装有Lipus超声仪的超声发射探头，在气室上端内壁设置有供氧浓度控制部件。
3.根据权利要求2所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述内筒为镂空金属，内筒外壁上固定有液液交换膜；所述外筒为镂空金属，外筒内壁上固定有气液交换膜。
4.根据权利要求2或3所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述内筒一端的端轴上设置有分离部件，分离部件上设置有培养液进口和培养液出口。
5.根据权利要求4所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述培养系统还包括用于提供新鲜培养液的供液装置、用于存储培养液的培养液存储器和用于收集培养液的培养液收集器，供液装置通过输液泵液管与培养液存储器相连，通过多孔管管道穿过培养器主体内筒的培养液出口，直达培养器主体内筒的另一端，培养液均匀进入细胞/组织培养室，细胞/组织培养室的输出管道与培养液收集器相连。
6.根据权利要求1或2所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述气室还包括进气口和出气口，系统还包括提供气源的供气装置和收集余气的余气收集器，气室的进气口通过进气管与供气装置连接，气室的出气口通过排气管与余气收集器连接。
7.根据权利要求1或2所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述系统还包括驱动装置，驱动装置带动培养器主体以转轴为轴心旋转；所述Lipus超声仪的超声发射探头上设置有用于固定超声发射探头的分离部件。
8.根据权利要求1或2或6所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述供氧浓度控制部件、气室的进气口和出气口各连接一个气泵，气泵与两位三通电磁阀连接，光感模式的氧气浓度传感器感知气室内的氧气浓度，将信号传递到控制电路，控制三通阀，进而开启或关闭气泵，调节气室的氧气浓度。
9.根据权利要求8所述的细胞培养系统，其特征在于所述驱动装置为变速马达。
10.根据权利要求3所述的细胞/组织培养系统，其特征在于所述液/液交换膜为醋酸纤维素滤膜，滤膜厚度为60μm，孔径小于1μm；所述气/液交换膜是用白炭黑、聚乙烯、聚酰胺、玻璃纤维增强的硅橡胶材料，厚度为1.5mm，孔径小于1μm，最大曝气量为5m3/h，氧利用率＞25％，充氧能力＞0.145kgO2/h。
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