CN107345255A - Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法 - Google Patents

Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107345255A
CN107345255A CN201710690605.1A CN201710690605A CN107345255A CN 107345255 A CN107345255 A CN 107345255A CN 201710690605 A CN201710690605 A CN 201710690605A CN 107345255 A CN107345255 A CN 107345255A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mc3t3
lipus
stent material
dimensional stent
dimensional
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710690605.1A
Other languages
English (en)
Inventor
吴�琳
刘洁
冯丽芳
曹洪娟
刘笑涵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HOSPITAL OF STOMATOLOGY CHINA MEDICAL UNIVERSITY
Original Assignee
HOSPITAL OF STOMATOLOGY CHINA MEDICAL UNIVERSITY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOSPITAL OF STOMATOLOGY CHINA MEDICAL UNIVERSITY filed Critical HOSPITAL OF STOMATOLOGY CHINA MEDICAL UNIVERSITY
Priority to CN201710690605.1A priority Critical patent/CN107345255A/zh
Publication of CN107345255A publication Critical patent/CN107345255A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种LIPUS对三维支架材料上MC3T3‑E1细胞内RNA表达影响的研究方法，包括：将MC3T3‑E1细胞接种到三维支架材料上；将接种完毕的三维支架材料和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5cm，从材料底部加载LIPUS，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3‑E1细胞的培养基；停止加载LIPUS后，收集材料上的MC3T3‑E1细胞，进行全转录组和miRNA的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA，并结合GO和KEGG进行整合分析。本发明为后续研究LIPUS促进三维材料内成骨分化的分子生物学机制提供可靠数据和新的研究思路。

Description

LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内 RNA表达影响的研究方法。
背景技术
低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound stimulation，LIPUS)是一种使用频率和剂量较低的超声波。有文献报道：LIPUS有利于体外三维材料内骨髓间充质干细胞的成骨向分化、促进兔股骨多孔材料内的血管化和骨形成、可提高兔脊椎与多孔材料间的骨融合率[1-3]。还有文献报道：LIPUS可以明显促进成骨细胞在多孔材料内的长入、增殖和早期分化[4，5]； LIPUS与人工骨材料联合修复Beagle犬节段性骨缺损可提高新骨形成速度及骨组织密度，缩短骨愈合时间[6]。本课题组与中科院金属研究所合作的国家“863”计划项目：2015AA033702 高强韧多孔钛人工骨材料研发，对利用电子束逐层熔化技术三维打印制备的多孔钛合金 (Ti-6Al-4V，ELI粉，医疗外科植入用)材料的生物学性能进行了全面评价，实验发现LIPUS 可以促进钛合金多孔材料内MC3T3-E1细胞的分化和长入，对细胞的增殖无明显影响[7]；动物实验结果是在兔下颌骨大面积骨缺损修复过程中，LIPUS促进了钛合金多孔材料内的骨形成和骨成熟。以上数据均提示LIPUS可以提高多孔人工骨材料修复骨缺损的疗效，“超声波+ 多孔材料”方法应用于大面积骨缺损修复具有可行性。
但到目前为止，对于超声波促进骨愈合机制的研究基本上都是基于二维空间[8]，基于三维空间的研究尚未见报道。但是基于二维空间阐述的机制不能用于解释三维支架上的实验结果。超声波在三维支架材料内的传播非常复杂，完全不同于二维空间，并且骨缺损修复本身就是对缺损三维空间的修复过程，因此LIPUS对三维支架材料内骨愈合的作用机制的探索具有重要意义。
越来越多的证据表明非编码RNA，特别是长链非编码RNA(long noncoding RNA，1ncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)参与调控成骨分化[9，10]，而1ncRNA和 miRNA之间的相互调控关系是发挥作用的重要形式[11]。1ncRNA调控miRNA的作用机制中最主要的是竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)途径，即lncRNA竞争结合具有相同miRNA应答元件的miRNA，发挥内源性“miRNA海绵”功能，抑制该miRNA 表达及对靶基因的负向表达调控[12]。ceRNA是一种全新的基因表达调控模式，相比其它调控网络，更为精细和复杂[13]。但现有关于LIPUS对三维支架材料内骨愈合的作用机制的探索主要集中在NF-κβ1、p38α、m-TOR[14]、MAPK[15]、α5β1/PI3K/Akt[16]、ROCK-Cot/Tpl2-MEK[17]这些通路，且这些研究都是基于二维空间阐述的机制，不能用于解释三维支架上的实验结果。现在还未见LIPUS对三维支架材料内成骨机制有关转录组学非编码RNA方面的研究，所以对于LIPUS对三维支架材料内成骨机制在转录组学非编码RNA方面的探索具有非常重要的意义。
参考文献：
1.Zhou X，Castro NJ，Zhu W，Cui H，Aliabouzar M，Sarkar K，ZhangLG.Improved human bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis in 3Dbioprinted tissue scaffolds with low intensity pulsed ultrasoundstimulation.Sci Rep，2016，6：32876.
2.Yan H，Liu X，Zhu M，Luo G，Sun T，Peng Q，Zeng Y，Chen T，Wang Y，Liu K，Feng B，Weng J，Wang J.Hybrid use of combined and sequential delivery of growthfactors and ultrasound stimulation in porous multilayer composite scaffoldsto promote both vascularization and bone formation in bone tissueengineering.J Biomed Mater Res A，2016，104(1)：195-208.
3.Hui CF，Chan CW，Yeung HY，Lee KM，Qin L，Li G，Leung KS，Hu YY，Cheng JC.Low-intensity pulsed ultrasound enhances posterior spinal fusion implantedwith mesenchymal stem cells-calcium phosphate composite without bonegrafting.Spine，2011，36(13)：1010-1016.
4.Wu L，Lin L，Qin YX.Enhancement of cell ingrowth，proliferation，andearly differentiation in a three-dimensional silicon carbide scaffold usinglow-intensity pulsed ultrasound.Tissue Eng Part A，2015，2(1-2)：53-61.
5.秦丽梅，吴琳.低强度脉冲超声波作用下羟基磷灰石/磷酸三钙三维支架上成骨细胞的生物学行为的研究.生物医学工程与临床，2014，18(6)：517-522.
6.胡莹，刘笑涵，王靖宇，吴琳，高勇，张劲松.低强度脉冲超声波辐照与泡沫TiC/Ti对犬节段性骨缺损修复的促进作用.中国比较医学杂志，2013，23(4)：44-47.
7.Cao HJ，Feng LF，Wu ZX，Hou WT，Li SJ，Hao YL，Wu L.Effect of low-intensity pulsed ultrasound on the biolodical behavior of osteoblasts onporous titanium alloy scaffolds：an in vitro and in vivo study.Mater Sci Eng CMater Biol Appl，2017，80：7-17.
8.Padilla F，Puts R，Vico L，Guignandon A，Raum K.Stimulation of bonerepair with ultrasound. Adv Exp Med Biol，2016，880：385-427.
9.Huang Y，Zheng Y，Jia L，Li W.Long noncoding RNA H19 promotesosteoblast differentiation via TGF-β1/Smad3/HDAC sighaling pathway derivingmiR-675.Stem Cells，2015，33(12)： 3481-3492.
10.He P，Zhang Z，Huang G，Wang H，Xu D，Liao W，Kang Y.miR-141 modulatesosteoblastic eell proliferation by regulating the target gene of lncRNA H19and lncRNA H19-derived miR-675.Am J Transl Res，2016，8(4)：1780-1788.
11.Dou C，Cao Z，Yang B，Ding N，Hou T，Luo F，Kang F，Li J，Yang X，Jiang H，Xiang J，Quan H， Xu J，Dong S.Changing expression profiles of lncRNAs，mRNAs，circRNAs and miRNAs during osteoclastogenesis.Sci Rep，2016，6：21499.
12.Salmena L，Poliseno L，Tay Y，Kats L，Pandolfi PP.A ceRNA hypothesis：the rosetta stone of a hidden RNA language.Cell，2011，146(3)：353-358.
13.Yang C，Wu D，Gao L，Liu X，Jin Y，Wang D，Wang T，Li X.Competingendogenous RNA networks in human cancer：hypothesis，validation，andperspectives.Oncotarget，2016，7(12)： 13479-13490.
14.Tassinary JA，Lunardelli A，Basso BS，Stülp S，Pozzobon A，Pedrazza L，Bartrons R，Ventura F， Rosa JL，Melo DA，Nunes FB，Donadio MV，OliveiraJR.Therapeutic ultrasound stimulates MC3T3-E1 cell proliferation through theactivation of NF-κB1，p38α，and mTOR.Lasers Surg Med，2015，47(9)：765-772.
15.Gao Q，Walmsley AD，Cooper PR，Scheven BA.Ultrasound stimulation ofdifferent dental stem cell populations：role of mitogen-activated proteinkinase signaling.J Endod，2016，42(3)： 425-431.
16.Watabe H，Furuhama T，Tani-Ishii N，Tani-Ishii N，Mikuni-TakagakiY.Mechanotransduction activates α5β1 integrin and PI3K/Akt signaling pathwaysin mandibular osteoblasts.Exp Cell Res，2011，317(18)：2642-2649.
17.Kusuyama J，Bandow K，Shamoto M，Kakimoto K，O hnishi T，MatsuguchiT.Low intensity pulsed ultrasound influences the multilineage differentiationof mesenchymal stem and progenitor cell lines through ROCK-Cot/Tpl2-MEKsignaling pathway.J Biol Chem，2014， 289(15)：10330-10344.
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内 RNA表达影响的研究方法，为进一步研究LIPUS促进三维材料内成骨分化的分子生物学机制提供新的研究思路。本发明的技术方案为：
LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法，包括以下步骤：
(1)将MC3T3-E1细胞接种到三维支架材料上；
(2)将接种完毕的三维支架材料和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5 cm，从材料底部加载LIPUS，加载参数为：超声频率1～3.3MHz，强度10～100mW/cm2，10～30min/次，1次/d，加载周期为1～21d，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3-E1细胞的培养基；
(3)停止加载LIPUS后，收集材料上的MC3T3-E1细胞，进行全转录组和miRNA的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA，并结合GO和KEGG进行整合分析。
进一步地，所述将MC3T3-E1成骨细胞接种到三维支架材料上，具体接种方法为：将经过真空除气和预湿的三维支架材料放入六孔板中；将融合度达到80％的MC3T3-E1细胞用胰蛋白酶消化得到细胞悬液；将细胞悬液均匀接种到三维支架材料上，然后在六孔板中加入培养基孵育。
进一步地，所述三维支架材料为Ti-6Al-4V多孔支架材料。
本发明的有益效果为：本发明将三维支架材料与MC3T3-E1成骨细胞复合培养后加载 LIPUS，然后收集细胞测序后，根据测序结果可以初步了解LIPUS对三维支架材料上细胞分化影响的机制是由于LIPUS引起蛋白编码基因和非编码RNA的改变，为后续研究LIPUS 促进三维材料内成骨分化的分子生物学机制提供可靠数据和新的研究思路。
附图说明
图1为本发明实施例采用的LIPUS加载装置的结构简图。
图2为本发明实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的高通量测序全转录组差异表达的热图结果，其中，L：超声组；K：对照组。
图3为本发明实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的全转录组GO富集结果。
图4为本发明实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的全转录组KEGG富集结果。
图5为本发明实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的高通量测序miRNA差异表达的热图结果，其中，L：超声组；K：对照组。
图6为本发明实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的miRNA的GO富集结果。
图7为本发明实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的miRNA的KEGG富集结果。
具体实施方式
本发明实施所采用的LIPUS加载装置型号为Sonicator 740，如图1所示，图中显示，接种MC3T3-E1细胞的材料放置于六孔板中，将孔板和超声仪器的探头放置于装水的容器中，材料位于上方，探头位于下方，从材料底部加载LIPUS，并且材料和探头之间保持5cm的距离。
本发明实施例所采用的Ti-6Al-4V多孔支架材料为中国科学院金属研究所提供，该材料的加工方法是采用粉末原料为Ti-6Al-4V ELI医疗(外科植入)用合金粉末，平均粒度约为 50μm。通过Materialise/Magics软件生成钛合金多孔支架模型，利用瑞典Arcam(A1)型电子束熔融金属快速成形系统制备钛合金多孔支架，该材料的压缩强度高于150MPa，疲劳强度高于50MPa，弹性模量低于20GPa。直径10mm，高度3mm的圆柱体，孔径400～500um，孔隙率为65％～70％。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供一种LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法，包括以下步骤；
(1)将MC3T3-E1细胞接种到Ti-6Al-4V多孔支架材料上，具体接种方法为：将经过真空除气和预湿的24个三维支架材料放入4组六孔板中；将融合度达到80％的小鼠MC3T3-E1 细胞用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化得到细胞悬液；将细胞悬液均匀接种到这些三维支架材料上，然后在4组六孔板中加入α-MEM培养基，放入恒温培养箱中孵育24h，将细胞脱落较多的样本材料丢弃，并从余留样本材料中至少选择6个较好地样本材料随机分为两组：超声组和对照组(各至少3个样本材料)，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3-E1细胞的培养基；
(2)将超声组孔板和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5cm，从材料底部加载LIPUS，加载参数为：超声频率1MHz，强度30mW/cm2，脉冲宽度1ms，脉冲频率100Hz，20min/次，1次/d，加载周期为7d；
(3)将对照组以和超声组同样的方式放置在水中，区别在于：对照组进行不开功率源的假辐照，20min/次，1次/d，加载天数为7d，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3-E1细胞的培养基；
(4)停止加载LIPUS后，收集两组样本材料上的MC3T3-E1细胞，进行全转录组和miRNA 的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA，并结合GO和KEGG进行整合分析。
结果分析：图2提供了本实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的高通量测序全转录组差异表达的热图结果，利用TopHat 2.0程序与参考基因组比对，每个样本的转录本单独组装后，利用Cuffmerge命令将所有样本的转录本信息汇总与合并，使用cufflinks估算所有转录本的丰度，cuffdiff命令筛选差异基因。筛选差异表达基因的标准是fold-change＞1.5，P value≤0.05 和Q value≤0.05。结果显示差异转录本聚类分析，颜色的深浅代表基因表达量的高低，深灰色代表表达量高，浅灰色代表表达量低，横坐标显示为样本编号，其中L：超声组；K：对照组。LIPUS作用后引起163条lncRNA上调，309个基因表达上调。
图3提供了本实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的全转录组GO富集结果，GeneOntology (简称GO)显著性富集分析以GO term为单位，应用超几何检验(phyper)，找出与所有表达基因背景相比，在差异表达基因中显著性富集的GO term。对检验P值＜0.05的GOterm 定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行驶的主要生物学功能。结果显示富集的条形图，表示富集个数从大到小前10位 (Top10)：ovarian follicle development(卵泡发育)，cellular response tohypoxia(细胞内缺氧应答)，positive regulation of peptidyl-tyrosinephosphorylation(肽酪氨酸磷酸化的正调控)， positive regulation ofprotein kinaseD signaling(蛋白激酶-D信号的正调控)，neuropilin bingding (神经纤毛蛋白结合)，basophil chemotaxis(嗜碱性粒细胞的趋化作用)，regulation of cell shape (细胞形态调控)，response to sulfur dioxide(二氧化硫反应)，T cell antigen processingand presentation(T细胞抗原加工提呈)，positive regulation of ERK1 and ERK2cascade(ERK1 和ERK2级联的正调控)。
图4提供了本实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的全转录组KEGG富集结果，KEGG显著性富集分析以KEGG term为单位，应用超几何检验(phyper)，找出与所有表达基因背景相比，在差异表达基因中显著性富集的KEGG term。对检验P值＜0.05的Pathway定义为在差异表达基因中显著富集的KEGG term。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，通过KEGG功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学代谢途径及信号转导途径。结果显示富集的条形图，表示富集个数从大到小前10位(Top10)：Rheumatoid arthritis (类风湿性关节炎)，InfluenzaA(甲型流感)，Aminobenzoate degradation(氨基苯甲酸降解)，Folate biosynthesis(叶酸合成)，Two-copmponent system(双组份系统)，Africantrypanosomiasis (非洲锥虫病)，Bladder cancer(膀胱癌)，Malaria(疟疾)，Staphylococcus aureus infection (金黄色葡萄球菌感染)，VEGF signaling pathway(VEGF信号通路)。
图5提供了本实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的高通量测序miRNA差异表达的热图结果，将miRNA数据进行标准化处理，差异表达miRNA分析，对于单重复，reads数较多的(两样本都大于20)miRNA采用卡方检验，较少的采用Fisher精确检验；对于多重复，在不事先假设其分布的情况下采用置换检验。差异miRNA筛选标准：|log2(fold-change)|≥1且 pvalue≤0.05。结果显示为用差异表达miRNA与样品进行的双向聚类图，深灰色代表表达量高，浅灰色代表表达量低，横坐标为样本编号。L1、L2、L3：超声组3个样本；K1、K2、K3：对照组3个样本，纵坐标为miRNA名称。LIPUS可以下调钛合金多孔材料上成骨细胞内miRNA的表达量，下调的miRNA 30个，分别为：mmu-miR-5128_R6-23L23， mmu-miR-3471R16-1L22，mmu-miR-7667-5p_R15-1L22，mmu-miR-30c-1-3p_R1-20L22， hsa-miR-6754-3p_R19-5L22，mmu-miR-1187_R6-20L23，mmu-miR-9-3p_R1-21L22， rno-miR-3473_R4-18L22，mmu-miR-5114，mmu-miR-6239_R1-18L20，等。
图6提供了本实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的miRNA的GO富集结果，差异miRNA靶基因预测采用软件miRanda，对靶基因进行GO富集分析，结果显示GO富集的条形图，表示富集个数从大到小前10位(Top10)：mitochondrion(线粒体)，death domain binding(死亡结构域的结合)，viral release fromhost cell(宿主细胞的病毒释放)，cytoplasm(细胞质)， N-acetylneuraminate metabolic process(N-乙酰神经氨酸的代谢过程)，long-term synaptic potentiation(长时程突触增强)，positive regulation of focaladhesion assembly(黏着斑附着的正调控)，structure-specific DNA bingding(结构特异性DNA结合)，(ceramide biosynthetic process神经酰胺的生物合成过程)，nucleoplasm(核浆)。
图7提供了本实施例最终收集的MC3T3-E1细胞的miRNA的KEGG富集结果，差异miRNA靶基因预测采用软件miRanda，对靶基因进行KEGG富集分析，结果显示KEGG富集的条形图，表示富集个数从大到小前10位(Top10)：Other types of O-glycan biosynthesis(其他类型O-聚糖的生物合成)，Sphingolipid signaling pathway(神经鞘脂的信号转导通路)， Pancreatic cancer(胰腺癌)，Tuberculosis(肺结核)，Dopaminergic synapse(多巴胺能神经突触)，Pathways in cancer(癌症中的通路)，Colorectal cancer(结直肠癌)，Hepatitis C(C型肝炎)，Chagas disease(American trypanosomiasis)(南美锥虫病)，GABAergic synapse(GABA 能突触)。
综上，在采用超声频率1MHz，强度30mW/cm2，脉冲宽度1ms，脉冲频率100Hz，20min/次，1次/d的LIPUS对Ti-6A1-4V多孔支架材料上的MC3T3-E1细胞作用后，引起该细胞中的309个基因表达上调、163条lncRNA上调(图2)、30条miRNA下调(图5)、 193条Go terms富集上调和8条信号通路差异上调(图3、4、6、7)。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将MC3T3-E1细胞接种到三维支架材料上；
(2)将接种完毕的三维支架材料和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5cm，从材料底部加载LIPUS，加载参数为：超声频率1～3.3MHz，强度10～100mW/cm2，10～30min/次，1次/d，加载周期为1～21d，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3-F1细胞的培养基；
(3)停止加载LIPUS后，收集材料上的MC3T3-E1细胞，进行全转录组和miRNA的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA，并结合GO和KEGG进行整合分析。
2.根据权利要求1所述的LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法，其特征在于，所述将MC3T3-E1成骨细胞接种到三维支架材料上，具体接种方法为：将经过真空除气和预湿的三维支架材料放入六孔板中；将融合度达到80％的MC3T3-E1细胞用胰蛋白酶消化得到细胞悬液；将细胞悬液均匀接种到三维支架材料上，然后在六孔板中加入培养基孵育。
3.根据权利要求1或2所述的LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法，其特征在于，所述三维支架材料为Ti-6Al-4V多孔支架材料。
CN201710690605.1A 2017-08-14 2017-08-14 Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法 Pending CN107345255A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710690605.1A CN107345255A (zh) 2017-08-14 2017-08-14 Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710690605.1A CN107345255A (zh) 2017-08-14 2017-08-14 Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107345255A true CN107345255A (zh) 2017-11-14

Family

ID=60257998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710690605.1A Pending CN107345255A (zh) 2017-08-14 2017-08-14 Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107345255A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914438A (zh) * 2010-08-12 2010-12-15 中山大学 一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914438A (zh) * 2010-08-12 2010-12-15 中山大学 一种低强度脉冲超声波辅助下的旋转管式细胞/组织培养系统

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOU,C等: "Changing expression profiles of lncRNAs, mRNAs,circRNAs and miRNAs during osteoclastogenesis", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
TABUCHI, Y等: "Genes Responsive to Low-Intensity Pulsed Ultrasound in MC3T3-E1 Preosteoblast Cells", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》 *
TASSINARY, JAF等: "Therapeutic Ultrasound Stimulates MC3T3-E1 Cell Proliferation Through the Activation of NF-kappa B1, p38 alpha, and mTOR", 《LASERS IN SURGERY AND MEDICINE》 *
XU, Y: "Upregulation of long non-coding RNA HIF 1 alpha-anti-sense 1 induced by transforming growth factor-beta-mediated targeting of sirtuin 1 promotes osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells", 《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》 *
ZHOU, X等: "Improved Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis in 3D Bioprinted Tissue Scaffolds with Low Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
任军帅等: "生物医用钛合金材料发展现状及趋势", 《材料导报》 *
宋鸿等: "细胞培养技术的研究进展", 《遵义医学院学报》 *
杨佑成等: "《简明口腔科学》", 30 September 1998 *
秦丽梅等: "低强度脉冲超声波作用下羟基磷灰石/磷酸三钙三维支架上成骨细胞的生物学行为的研究", 《生物医学工程与临床》 *
邓迎生: "低强度脉冲式超声波对三维培养兔关节软骨细胞、基质的生物学效应及相关基因研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Boularaoui et al. An overview of extrusion-based bioprinting with a focus on induced shear stress and its effect on cell viability
Elder et al. Effect of compressive loading on chondrocyte differentiation in agarose cultures of chick limb‐bud cells
Makhluf et al. Age-related decline in osteoprotegerin expression by human bone marrow cells cultured in three-dimensional collagen sponges
Chen et al. Characterization and optimization of cell seeding in scaffolds by factorial design: quality by design approach for skeletal tissue engineering
ES2739201T3 (es) Construcción 3D in vitro bifásica cartílago-hueso
Bernhardt et al. Primary human osteocyte networks in pure and modified collagen gels
Nowlan et al. Identification of mechanosensitive genes during embryonic bone formation
Qu et al. Treatment of traumatic brain injury in mice with bone marrow stromal cell–impregnated collagen scaffolds
Tee et al. Improved zonal chondrocyte production protocol integrating size-based inertial spiral microchannel separation and dynamic microcarrier culture for clinical application
Minehara et al. A new technique for seeding chondrocytes onto solvent-preserved human meniscus using the chemokinetic effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2
Selig et al. Cell morphology as a biological fingerprint of chondrocyte phenotype in control and inflammatory conditions
Min et al. Versatile human cardiac tissues engineered with perfusable heart extracellular microenvironment for biomedical applications
Ngan et al. Matured myofibers in bioprinted constructs with in vivo vascularization and innervation
Salerno et al. Liquid flow in scaffold derived from natural source: experimental observations and biological outcome
Jarrahy et al. Osteogenic differentiation is inhibited and angiogenic expression is enhanced in MC3T3-E1 cells cultured on three-dimensional scaffolds
Lange et al. Exosomes: A New Hope for Angiogenesis-Mediated Bone Regeneration
Benya et al. Pulsed electromagnetic field (PEMF) transiently stimulates the rate of mineralization in a 3-dimensional ring culture model of osteogenesis
Gyorgy et al. Capturing mesenchymal stem cell heterogeneity during osteogenic differentiation: an experimental–modeling approach
CN107345255A (zh) Lipus对三维支架材料上mc3t3‑e1细胞内rna表达影响的研究方法
Mosabbir et al. Engineered cell migration to lesions linked to autoimmune disease
Yang et al. Research progress on the regulatory mechanism of integrin‐mediated mechanical stress in cells involved in bone metabolism
Kronemberger et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building‐block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication
Metzger et al. Expansion and differentiation of human primary osteoblasts in two-and three-dimensional culture
Inui et al. Enhanced chondrogenic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells in zirconia microwell substrata
Lim et al. Evaluation of the osteogenic potential of stem cells in the presence of growth hormone under magnetic field stimulation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171114

RJ01 Rejection of invention patent application after publication