CN101912606A - 一种分子标记、免疫保护性能增强的结核杆菌弱毒疫苗及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分子标记、高免疫保护性的结核杆菌弱毒疫苗及制备方法，使用基因定向改造的技术，定向的改造已经沉默的BCG免疫保护性基因，以提高BCG的免疫保护性。提供的结核杆菌弱毒疫苗具有分子标记、免疫保护性能增强的特点，用血清学检测方法就能区分感染的人与动物是疫苗接种还是野生菌感染；该疫苗免疫保护性能较亲本株强。这对结核杆菌病监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用实践价值。

Description

一种分子标记、免疫保护性能增强的结核杆菌弱毒疫苗及构建方法

技术领域

本发明提供了一种分子标记、免疫保护性能增强的结核杆菌弱毒疫苗，本发明还公开了上述疫苗的构建方法，属于分子生物学技术与免疫疫苗生产技术领域。

背景技术

近几年，结核病发病率，与死亡人数趋年攀升。该病唯一的弱毒活疫苗(以下简称：BCG)是用牛结核杆菌在其不适培养基上连续培养200多代而成。在这个过程中，BCG的亲本株大部分毒力基因发生了钝化，使BCG毒力相对减弱，但是，同时也把BCG的保护性基因失去了活力，致使BCG的保护性能低下(成年人仅有30％)。

牛结核病的检测，在我国主要靠血清学变态反应(GB/T 18645-2002)，该检测方法人为操作因素大，主要靠眼观，主观因素较多，误差较高。

BCG的一个缺陷是接种BCG后的人与动物，使用现有的检测方法很难从野毒感染的人与动物中区分开。对流行病学调查，疫源的布控带来了严重的干扰。所以，研制出高保护性的BCG，建立起能区分野毒感染与接种BCG的检测方法，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明提供了一种分子标记、免疫保护性能增强结核杆菌弱毒疫苗，是对BCG加以分子标记，拯救出的BCG免疫保护性30KD基因的活性，增加其免疫保护性。

本发明还公开了该疫苗的构建方法，克隆出结核杆菌的与BCG差异免疫性基因，并表达出差异免疫原性蛋白，以差异免疫原性蛋白为抗原，建立起结核病快速诊断免疫胶体金检测方法。

本发明的分子标记、高免疫保护性的结核杆菌弱毒疫苗，特征在于：

该疫苗是将结核杆菌外分泌免疫保护基因30KD替换其亲本株BCG的MPT64基因，对其加以MPT64基因分子标记。

本发明结核杆菌弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

以结核杆菌的弱毒疫苗株BCG为起始材料，以PCR的方法从标准结核杆菌毒株的基因组中扩增出要改造的目的基因MPT64的引导序列，并把它克隆到T载体上，进行基因改造；把经改造的引导序列克隆到pBluescript SK+上而成重组质粒；用同样的方法得 到结核杆菌免疫保护性基因30KD的引导序列，克隆到T载体上，进行基因改造，并把它连接到pBluescript SK+重组质粒；

用电转化法把这两个自杀性质粒依次转入结核杆菌BCG中，转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀质粒便会被线性化，插入受菌体BCG的基因组中，线性化的质粒与MPT64基因发生置换，即得疫苗。

本发明的具体构建方法主要包括以下步骤：

(1)以结核杆菌弱毒疫苗基因组为模板，设计引物，用PCR的方法，扩增出分子标记目标基因与免疫保护基因的同源重组引导序列，而后克隆到T载体上对目标基因改造；

(2)用(1)得到的基因片段构建成同源重组载体(自杀性质粒)；

(3)使步骤(2)得到的重组载体转化到BCG中去，得到本发明的BCG基因突变；

本发明用PCR的方法扩增出MPT64基因，连接到到pET-28a上，转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导、高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白MPT64蛋白。

本发明的积极效果在于：使用基因定向改造的技术，定向的改造已经沉默的BCG免疫保护性基因，以提高BCG的免疫保护性。提供的结核杆菌弱毒疫苗具有分子标记、免疫保护性能增强的特点，用血清学检测方法就能区分感染的人与动物是疫苗接种还是野生菌感染；该疫苗免疫保护性能较亲本株强。这对结核杆菌病监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用实践价值。

附图说明

图1、在基因打靶引诱序列上，用PCR方法从△BCG基因组中扩赠出30KD在内的基因片段电泳图。

图2、MPT64在大肠杆菌中得到表达，并纯化，第1电泳道是Marker，2是少量盐洗脱，3、4、5是依次纯化的蛋白电泳图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1

一、同源重组载体(自杀性质粒)的构建

1  材料与方法

1.1菌株、质粒、载体    结核杆菌标准毒株、DH5a、T-sacB，pBluescript SK⁺本研究室保存；pMD18-T simple vector购自TakaRa公司。

1.2试剂    限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I(Klenow大片段)，大肠杆菌DNA聚合酶I，LA-Taq DNA polymerase、1kbp DNA Ladder Marker、质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品。

1.3PCR扩增

1.3.1含有MPT64基因同源重组指导序列的扩增    根据MPT64基因的序列以及pMD18-Tsimple vector和pBluescript SKⅡ(+)载体特点，设计引物从结核杆菌的基因组中扩增目标基因。

1.3.2含有结核杆菌30KD基因同源重组指导序列的扩增    设计引物。从结核杆菌BCG的基因组中扩增。

1.3.3sacB基因的扩增    分别设计5′端含有限制性内切酶BamH I的上游引物与含有Sal I酶切位点的下游引物。以质粒pIP279为模板，扩增sacB基因。

1.4自杀性质粒的构建

1.4.1含有MPT64基因同源序列自杀质粒的构建    把1.4.1中的扩增出的长度的基因片段(其中包含MPT64基因)，与pMD18-T相连得到重组质粒。把1.4.4扩增出sacB基因片段与pMD18-T相连而成重组质粒pSacB。再用限制性内切酶分别消化质粒pBluescriptSKⅡ(+)与上述重组质料，并把MPT64片段与线性化的pBluescript SKⅡ(+)相连而成重组质粒pBluescript-MPT64。再用限制性内切酶BamH I与Sal I分别消化重组质粒pBluescript-MPT64与pSacB，并把sacB基因片段与连接到线性化的pBK-MPT64而成最终自杀质粒。

1.4.2含有结核杆菌30KD基因同源序列自杀性质粒pBBs的构建把1.4.2中的扩增出的的基因片段(其中包含结核杆菌30KD基因)，与pMD18-T相连得到重组质粒p-30KD。并把的p-30KD用内切酶消化它，凝胶回收目标片段，使之与用消化过的pBluescript SKⅡ(+)相连而成重组质粒pB-30KD。再用限制性内切酶分别消化重组质粒pB结核杆菌30KD与pSacB，并把sacB基因片段与线性化的pB-30KD相连而成自杀质粒。

2结果

从结核杆菌BCG株基因组扩增出含有MPT64基因在内的基因片段，凝胶纯化后待用；从结核杆菌基因组扩增出含有结核杆菌30KD在内的基因片段，凝胶纯化后待用；从质粒pSP-Luc NF+扩增出1700bp大小的Luc NF+基因片段，凝胶纯化后待用；从质粒pIP279 扩增出1400bp大小sacB的基因片段，凝胶纯化后待用。它们经琼脂糖电泳验证，均可观察到与理论值大小相符条带。

几个主要的重组质粒酶切电泳鉴定pBb26经XhoI单酶切，电泳带与预期值相符；p-30KD经Xba I单酶切，电泳与预期值相符；pBK-MPT64单酶切，在12000bp左右有一条带，与预期值相符。

二、结核杆菌分子标记、免疫保护基因疫苗株△BCG的构建

1.1试剂    萤光素酶检测系统购自Promega公司，其它试剂同上。

1.27H10培养基    按照说明书配制后，高压灭菌后备用。

1.3电转化

1.3.1感受态的制备    取240mL对数生长前中期(OD₆₀₀＝0.15)结核杆菌液体培养物放入预冷的250mL离心管中，迅速将培养物置于冰水混和物中40min，不时的缓慢摇匀保证内容物充分冷却。然后4℃1200×g离心15min，回收细胞，倒去培养液，用冰冷10％的丙三醇重悬沉淀，以1000×g离心15min洗涤细胞3次。最后用3mL 10％的丙三醇重悬沉淀制成感受态。

1.3.2电转化操作步骤    取0.5μg自杀质粒加入100μL上述制作的结核杆菌电转感受态中混匀，加入电击杯中，以E＝13kv/cm电击，然后立即加入37℃预热的1mL的培养基中。放入生化培养培养48h。取出200mL涂布于含有筛选标记的琼脂平板上，12d后筛选出重组子，挑选出单菌落，进一步培养鉴定。

1.4同源重组子的筛选

1.4.1单交换子的筛选    把电转化受体菌涂布在含有筛选标记(Amp 100mg/L，Kan50mg/L)的琼脂平板上，因同源重组载体上带有筛选标记基因，所以很容易的筛选出单交换子。

1.4.2双交换子的筛选    将获得的同源重组单交换子液体培养3d，适当稀释，涂布于添加5％蔗糖的肝汤培养基平板上，37℃培养12d。所得细菌命名为△BCG菌株—即为改造的BCG菌株。

2结果

2.1PCR法法验证同源载体插入BCG染色体上与△BCG双交换子正确性，用PCR方法分别从BCG、同源载体插入后的BCG、△BCG的基因组中分别扩增出不同片段。

2.2PCR方法验证改造后的结核杆菌30KD基因在△BCG双交换子的正确性用PCR方法分别从BCG基因组中扩赠出包含结核杆菌30KD在内的基因片段。证实△BCG基因改造 成功见图1。

三、结核杆菌MPT64蛋白基因的克隆、表达及纯化

结核杆菌MPT64蛋白是一种具有强免疫原性的分泌蛋白。它由细胞内向外释放，具有可溶性，相对于固定的外膜蛋白易于检测。本发明克隆了结核杆菌的MPT64蛋白基因，并进行了表达，表达产物通过亲和层析进行了纯化。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与、质粒、载体

结核杆菌BCG、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21和pET28a+本研究室保存。

1.1.2限制性内切酶及其它试剂

限制性内切酶NdeI、EcoRI、SacI、HindⅢ、Sal I和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒同第一章；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自鼎国生物公司；RNase购于华美生物工程公司；IPTG及TMB购自Sigma公司；PVDF膜为Millipore公司产品；丙烯酸胺、双甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker购自TaKaRa公司；结核杆菌阳性牛血清本室研制，辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG购自鼎国生物公司；金属鳌合层析介质Sepharose-4-B购自Pharmacia公司。

1.1.4主要试剂的配制

1.1.4.1SDS-PAGE试剂

30％(w/v)Acrylamide100mL：称取29g Acrylamide 1g BIS置于100mL烧杯中，加入约80mL的去离子水后，加热使之溶解，加去离子水将溶液定容至100mL，用0.45μm过滤膜过滤除杂质，于棕色瓶中4℃保存。

1.5mol/L(pH8.0)Tris-HCl缓冲液：18.17g Tris加入90mol/L dH₂O使之溶解，用浓HCl调pH值至8.0，最后加dH₂O定容至100mL；

1.0mol/L(pH 6.8)Tris-HCl缓冲液：2.11g Tris加入90mL dH₂O使之溶解，浓HCl调pH值至6.8，最后加dH2O定容至100mL；

10％SDS：称取电泳级SDS 10g，加入90mL dH₂O使之溶解，调pH值至7.2，最后加dH2O定容至100mL；

10％(w/v)过硫酸胺1mL：称取100g过硫酸胺，加入1mL的去离子水后，充分搅拌溶解，于4℃保存，不宜久放；

10×电极缓冲液：3g Tris、14.4g甘氨酸、1g SDS，dH2O定容至1000mL；

2×SDS上样缓冲液：2.0mL甘油、1mL 2-巯基乙醇、0.6g SDS、1.0mL 1％溴酚蓝、2.5mL 1.0mol/L pH 6.8Tris-HCl，dH2O定容至10mL；

考马斯亮蓝R-250染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1000mL烧杯中，加入250mL的异丙醇，100mL冰醋酸，650mL去离子水后，充分搅拌溶解，过滤除去颗粒物质后，室温保存；

脱色液：量取50mL的乙醇、100mL冰醋酸、850mL去离子水，置于1000mL烧杯中，充分混合后待用。

1.1.4.2Western blot检测试剂

转移缓冲液：甘氨酸2.9g、Tris base 5.8g、SDS 0.37g、甲醇200mL，调pH8.3加水至1000mL；

封闭液：含3％BSA的TBS；

洗涤液：TBST(0.05％Tween-20)：称取8.8g NaCl，加入于800mL去离子水，充分溶解后，加入20mL pH 8.01.0mol/LTris-HCl、0.5mL Tween20，定容至1000mL。

1.1.5培养基

LB液体培养基：在950ml dH2O中加入细菌培养用胰蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 10g，完全溶解后用5mol/L NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃高压下蒸汽灭菌20min，4℃保存。LB固体培养基：在1L LB液体培养基中加入30g的琼脂粉，高压灭菌。

1.2方法

1.2.1目的基因的扩增与克隆

根据MPT64基因的序列以及pMD18-T simple vector和pET28a+表达载体的特点分别设计两端含有限制性内切酶Nde I、Sal I酶切位点的引物：

用PCR的方法从BCG基因组中扩增出MPT64基因片段。回收PCR产物，与pMD18-T simple vector相连构建重组质粒pMDMPT64，重组质粒pMDMPT64送上海生工生物公司进行测序。1.2.2重组表达质粒pETMPT64的构建、表达质粒转入BL21表达菌用限制性内切酶Nde I与Sal I同时消化pMDMPT64与pET28a+，分别凝胶回收纯化MPT64与pET28a+基因片段。用T4连接酶使之联接，构建重组质粒pETMPT64。

将质粒快速转化受体菌，用涂布棒均匀涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37℃孵箱过夜培养。

1.2.3融合蛋白MPT64-His的表达。

取单个转化菌落接种到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培养液中。加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，37℃继续震荡培养。4h后，收集菌体。

1.2.4Western-blot免疫鉴定

把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水中，借毛细作用使之从下往上湿润后，将之浸没于水中，浸泡5min以上以驱除留于滤膜上的气泡。把PVDF膜放在滤纸上，要保证精确对齐，而且在3mm滤纸与硝酸纤维素滤膜之间并不留有气泡。将阴极放于滤纸上，石墨一边朝下。接电源(将阳极导线接于底部石墨电极)。

按0.1mL/cm2的量加入第一抗体。将滤膜平放在平缓摇动的摇床上，于4℃温育2h。用50mlTBST洗涤3次，每次10min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶5000稀释)，于室温平缓摇动2h。用50mlTBST洗涤4次，每次10min。加入0.4mlTMB显色至目的条带清晰，加蒸馏水终止反应。

1.2.7亲和层析纯化重组蛋白

1.2.7.1菌体的裂解

每克菌(湿重)加入3ml裂解缓冲液(pH7.920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L imidazole，0.5mmol/L NaCl)，重悬细菌沉淀。按每毫升裂解缓冲液加入10μl MgSO₄(1mol/L)，10μlDnase(2mg/mL)，2μl PMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三种试剂，冰上孵育30min 5000转离心15min收集沉淀，按每克菌湿重加入5ml结合缓冲液的比例，将沉淀用结合缓冲液重悬，-70℃放置过夜。将-70℃放置的菌液冰上融化后，超声破碎菌体。5000rpm，4℃离心15min，收集上清。-70℃保存或立即用于纯化。

样品的吸附与洗涤：将待纯化的样品加到金属鳌合的柱中，并以最佳流速让其流过柱床。用洗涤缓冲液洗柱，一直到流出样品的紫外监测值为基线水平。

2结果：MPT64在大肠杆菌中得到表达，并纯化。纯化的蛋白质量见图2。

实验例1

△BCG分子标记功能的验证

△BCG分子标记功能是本发明的主要目的所在，为了进一步验证本发明的正确性，设计实验，验证本发明。用结核杆菌与△BCG接种小鼠实验，初步建立了这一诊断方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

结核杆菌本研究室保存；△BCG见上述。

1.1.2ELISA试剂配制：

(1)包被液碳酸盐缓冲液

Na₂CO₃(无水碳酸钠)1.6g，NaHCO₃(碳酸氢钠)2.9g，加去离子水至1000mL。

(2)洗涤液pH9.2磷酸盐缓冲液(Tween-20)

Na₂HPO₄ 12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 18g，吐温-20 0.5mL加去离子水至1000mL

(3)甲液0.1mol/L柠檬酸4.2g/200mL，乙液0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O 14.3g/200mL，取甲液24.3mL与乙液25.7mL混合，临用前加20mg邻苯胺(OPD)，加过氧化氢(H₂O₂)0.02mL。

(4)终止液2mol/L H₂SO₄溶液取分析纯浓硫酸110mL，加去离子水至100mL。

1.1.3实验动物

昆明鼠购自长春市生物制品所

1.2方法

1.2.1结核杆菌接种小鼠前的处理

用PBS洗6次，然后用生理盐水稀释到5000株/mL。

1.2.2实验小鼠的接种

把布鲁菌结核杆菌与△BCG培养到对数生长期，用生理盐水洗涤三次；用生理盐水稀释到目的浓度；对小鼠采用腹腔注射。

1.2.3被检动物血清的制备

对用结核杆菌与△BCG免疫14天的小鼠断尾采血，血样在37℃放置3个小时后，取上清即为制备血清。

1.2.4检测方法

(1)ELISA检测：按常规方法进行，将纯化的目的蛋白稀释到10ng/mL后包被酶标板，用被检动物血清1∶300稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 1∶3000稀释作为二抗。同时用标准阴性和标准阳性血清作对照。

(2)操作过程：用微量移液器向每个孔内加100μL包被液稀释的蛋白样品，置湿盒内于37℃恒温培养箱中1h，然后于4℃冰箱中包被过夜。次日，用洗涤液洗涤二次，甩去洗涤液，倒置在纱布上轻轻拍扣使孔内的液体充分流出，每次间隔3min。向孔内分别加入用稀释液稀释好的1∶100阳性血清、阴性血清0.1mL，置湿盒内于37℃恒温箱中 反应1h后，甩去血清，用上面的方法洗涤3次，再加入稀释好的1∶200酶标记兔抗牛IgG 0.1mL，置于湿盒内于37℃恒温箱静置，甩去残留的酶标记物溶液，以同法洗涤三次。加入底物溶液100μL/mL，置湿盒内于37℃恒温箱中静置30min，取出后立即向孔内加入0.02mL终止液，终止反应。

(3)结果判定：将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。2结果：用MPT64蛋白区分接种结核杆菌与△BCG菌体的小鼠

将纯化的MPT64蛋白作抗原，用ELISA法检测结核杆菌与△BCG接种7d的小鼠血清中是否含有MPT64蛋白的抗体，很易容区分结核杆菌和△BCG接种的小鼠。具体数具见表1。

表1结核杆菌与△BCG接种小鼠后ELISA检测血清结果

实验例2、

△BCG免疫保护性鉴定

理论上讲，△BCG的免疫保护性比一般的BCG强。本发明以小鼠为实验动物，接种相同剂量的△BCG与BCG，而后攻入标准毒株，而后检测观察小鼠的临床症状及最小致死数量，比较分析了它们的免疫保护性强弱。

1材料与方法

1.1细菌的处理

用无菌生盐水洗三次，再分别稀释到每mL 5亿、1千万、1百万个菌。

1.2接种小鼠的症状观察

取1万△BCG与BCG菌体接种的小鼠，14天后，用标准毒株攻毒，分别观察接种后 2d、5d、8d小鼠的临床表现和死亡情况，以此分析△BCG与BCG免疫保护性。2结果：△BCG与其亲本株BCG相比，免疫保护性明显增强。具体数据见下表2。

表2

Claims (2)

1.一种分子标记、高免疫保护性的结核杆菌弱毒疫苗，特征在于：

该疫苗是将结核杆菌外分泌免疫保护基因30KD替换其亲本株BCG的MPT64基因，对其加以MPT64基因分子标记。

2.根据权利要求1所述结核杆菌弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

以结核杆菌的弱毒疫苗株BCG为起始材料，以PCR的方法从标准结核杆菌毒株的基因组中扩增出要改造的目的基因MPT64的引导序列，并把它克隆到T载体上，进行基因改造；把经改造的引导序列克隆到pBluescript SK+上而成重组质粒；用同样的方法得到结核杆菌免疫保护性基因30KD的引导序列，克隆到T载体上，进行基因改造，并把它连接到pBluescript SK+重组质粒；

用电转化法把这两个自杀性质粒依次转入结核杆菌BCG中，转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀质粒便会被线性化，插入受菌体BCG的基因组中，线性化的质粒与MPT64基因发生置换，即得疫苗。

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