CN101892187A - 吸附重金属镉的重组恶臭假单胞菌ch01及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境工程土壤环境治理领域。涉及一种新的微生物修复重金属镉污染土壤的基因工程菌的构建及应用。将猴金属硫蛋白α结构域四聚体融合在野油菜黄单胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端，以此为主要功能单元构建一个广宿主表达质粒，然后在高效耐受多种重金属的恶臭假单胞菌X4中利用镉特异性启动子进行表达，实现了猴金属硫蛋白α结构域四聚体在该细菌中的表面展示，获得高效专一吸附重金属镉的基因工程菌CH01。该工程菌可在多种重金属存在的条件下显著吸附重金属镉，与小麦、豇豆、玉米的共生水培结果显示该工程菌CH01可以在植物根际定殖并快速吸附镉离子。本发明还公开了基因工程菌CH01的构建方法。其保藏号为CCTCC No.M209320。

Description

吸附重金属镉的重组恶臭假单胞菌CH01及应用 

技术领域

本发明属环境工程土壤环境治理领域。具体涉及一种新的微生物修复重金属镉污染土壤的基因工程菌的构建和应用。本发明与微生物基因工程和环境工程领域有关。 

背景技术

镉是一种典型的分散型重金属元素，主要以硫化物的形式存在于铜、铅、锌等有色金属矿藏中。随着人类活动，镉以各种途径进入环境中，造成了严重的镉污染。镉在环境中有稳定积累和不易消除的特点，而镉迁移转化的最大特点是不能或不易被生物体分解转化后排出体外，不易随水移动，只能沿食物链逐级往上传递，通过食物链富集使人体慢性中毒。研究表明，镉同时对人类和动物具有致癌作用，镉污染地区居民的死亡率及癌症罹患率同非污染地区相比均呈现出上升的趋势。目前，镉已被国际癌症研究机构(IARC)归为第一类致癌物(McGregor et al.，2000)。 

在镉污染的土壤环境中的植物也会不同程度地吸收该重金属，使得根、茎、叶等器官及各种细胞器受到不同程度的伤害，使植物生物量下降。植物对镉的吸收取决于植物根系生理功能及根际圈内微生物群落组成、士壤的理化性质、重金属种类和浓度、氧化还原电位以及pH值等因素影响。部分植物对包括镉在内的重金属有较高的耐受和吸收性能而被用于修复重金属污染的土壤，但是目前筛选出的富集重金属的植物往往只对一种重金属元素表现出较强的富集能力，而对复合污染的几种重金属元素同时富集的能力较弱；同时还存在着植物生物量小、生长周期长以及扎根浅等问题。植物根际微生物与植物根系所组成的生态系统对重金属在根土界面的迁移转化有着重要的作用。根际微生物对重金属的吸附转化和固定能有效降低重金属对植物的伤害。而微生物对重金属的耐受和解毒能力也为微生物从功能上治理和修复重金属污染土壤提供了新的途径。 

在所有微生物修复重金属机制中，通过金属硫蛋白吸附重金属，特别是难于转化为低毒或无毒的镉一类的重金属受到我们特别的关注。金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类低分子量，富含半胱氨酸，能够结合Cd、Zn、Cu等多种金属离子的蛋白质。1957年，Margoshes和Vallee首次从马肾中分离得到。在重金属吸附的利用方面，目前主要是将该类蛋白与周质空间或外膜组分融合后在大肠杆菌中表达，或者将MT的表达与金属膜转运蛋白的表达相结合(Jacobs，1989；Romeyer，et al，1990；Sousa et al.，1998；Valls etal.，2000；Valls et al.，1998)。但是大肠杆菌对重金属的耐受能力较弱，而工程菌吸附重金属后降低了工程菌的有效吸附周期，单个MT分子对于吸附效率和容量的提高也没有明显的增强。发明人所分离的一株高度耐受多种重金属的细菌，初步具备修复多种重金属污染的能力，同时也为构建高度重金属污染土壤修复工程菌提供了一个十分有效的宿主。 

微生物表面展示技术是利用基因重组方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基因序列与特定的载体蛋白基因序列(又称定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，从而使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。微生物展示策略能够将参与重金属吸附的蛋白质表达在宿主细胞表面，这既增强了修复工程菌与重金属的接触，又能降低细胞内的重金属浓 度，从而增强工程菌的耐受能力。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选一种新的微生物修复重金属镉污染土壤的基因工程菌。本发明还涉及该基因工程菌的构建和应用。 

本发明的技术方案如下： 

申请人通过基因工程的方法筛选获得一种能够修复重金属镉污染土壤的基因工程菌CH01，该菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CH01，于2009年12月19日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO M209320。 

本发明的基因工程菌的制备方法是，首先将猴金属硫蛋白α结构域四聚体(mMT4α)融合在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913冰晶核蛋白N端(inaX-N)，并以此为主要功能单元构建一个广宿主表达质粒。然后在本发明人所分离的高效耐受多种重金属的恶臭假单胞菌X4(Pseudomonas putidaX4)中利用镉特异性启动子进行表达，实现猴金属硫蛋白α结构域四聚体在该细菌的表面展示，从而获得高效专一吸附重金属镉的基因工程菌菌株，将该基因工程菌命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CH01。 

本发明所提供的基因工程菌CH01可以在多种重金属存在的实验室条件下显著吸附重金属镉，与豇豆、玉米的共生的水培结果显示本发明的基因工程菌CH01可以在植物根际定殖并快速吸附重金属镉。 

本发明提供的基因工程菌CH01可用于镉污染土壤的治理，降低重金属镉污染土壤的生物毒性，促进污染区农作物的稳产高产。 

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明所克隆并使用的野油菜黄单胞菌冰晶核蛋白N端(inaX-N)核苷酸序列。 

序列表SEQ ID NO：2是本发明所克隆并使用的猴金属硫蛋白α结构域(MTα)核苷酸序列。 

序列表SEQ ID NO：3是本发明所克隆并使用的重金属镉响应启动子核苷酸序列。 

序列表SEQ ID NO：4是本发明人工构建的具有吸附重金属镉的功能序列的核苷酸序列。 

表1：本发明用于植物水培的Hoagland’s营养液配方。 

图1：本发明实施例中所获取的inaX-N序列PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳分析； 

图中：M：DNA分子量标准；1：inxN的PCR扩增产物。 

图2：本发明实施例中所获取的镉响应启动子的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳分析； 

图中：1：DNA分子量标准；2：启动子PCR扩增产物。 

图3：本发明实施例中修复重金属镉污染的功能质粒pCIM的构建图及其物理图谱。 

图4：本发明实施例中工程菌CH01的生长态镉吸附量测定结果。 

图中：X4指示本发明所采用的宿主菌；X4/pCIM指示本发明所使用的工程菌CH01。 

图5：本发明实施例中工程菌CH01的静态镉吸附量测定结果。 

图中：X4指示本发明所采用的宿主菌；X4/pCIM指示本发明所使用的工程菌CH01。 

图6：本发明实施例中工程菌CH01在共生水培实验下对不同植物的干重和株高的影响。 

图中：CK指示的实验条件为常规条件，无重金属和工程菌；X4/pCIM+Cd指示添加工程菌和重金属镉；X4+Cd指示添加宿主菌X4和重金属镉；a部分是不同作物的干重比较；b部分是不同作物的株高比较 

图7：本发明实施例中工程菌CH01在共生水培实验下对不同植物植物根际镉含量测定。 

图中：X4/pCIM指示添加工程菌后植物根际镉含量；X4指示添加宿主菌X4后植物根际镉含量；withoutincubation指示未添加任何菌株的植物根际镉含量。 

具体实施方案

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考分子克隆手册(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)所描述的内容。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。 

实施例1  修复镉污染的功能质粒pCIM的构建 

本发明所利用的核苷酸序列来源如下：镉响应启动子来源于恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonasputida)KT2440(见SEQ ID NO：3所示)；猴金属硫蛋白α结构域序列(见SEQ ID NO：2所示)，该序列来源于复旦大学黄仲贤教授实验室提供；inaX-N来源于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913(见SEQ ID NO：1所示)。 

1、野油菜黄单胞菌的Inax-N的获取 

申请人以野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913的总DNA为模板，设计上游引物：5’CCATGGATCGCGAAAAAGTCTTGG3’，下游引物5’GAATTCTGCGTACCCGCGAAAT3’，进行PCR扩增。PCR体系包括10×Buffer 2.5μl，Mg²⁺1μl，dNTP 2.5μl，模板DNA 2μl，引物各1μl，KOD-Plus 0.5μl，ddH₂O补足25μl。PCR条件为94℃5min，94℃30ec，58℃30sec，68℃3sec，30个循环。PCR产物进行凝胶检测如图1，然后将纯化的PCR产物与T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，获得pMD18-inax克隆，并对其中的inax进行测序。该片段的核苷酸序列序列如SEQ ID NO：1所示，表明申请人获得具有细菌表面展示功能的inax-N片段。 

2、猴金属硫蛋白α结构域(MTα)序列的获取和四聚体片段MTα4的构建 

PCR模极为复旦大学黄仲贤教授所馈赠的含有猴金属硫蛋白的序列的质粒，申请人通过克隆获得猴金属硫蛋白的α结构域序列(见SEQ ID NO：2所示)。具体方法如下：以含有猴金属硫蛋白的序列的质粒DNA为模板，设计PCR引物进行猴金属硫蛋白α结构域片段的扩增。为了进行猴金属硫蛋白α结构域多聚体的构建，利用引物(如后所述)在该片段两侧引入BglII和BamHI酶切位点。引物序列和PCR反应条件如下：以上游引物5’-cggaAGATCTaagaaaagctgctgctc，下游引物5’-attcGGATCCggcacaacagttgcac进行PCR反应，PCR体系包括10×Buffer 2.5μl，Mg²⁺1μl，dNTP 2.5μl，模板DNA 2μl，引物各1μl，KOD-Plus 0.5μl，ddH₂O补足25μl。PCR条件：94℃2min，94℃15sec，58℃30sec，68℃20sec，循环25次。PCR产物进行凝胶电泳分析，并按照常规方法纯化检测。然后将MTα基因片段连入T载体，蓝白斑筛选获得pTA-MTα阳性克隆，并进行测序和分析。所克隆的猴金属硫蛋白α结构域核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，表明获得 的猴金属硫蛋白α结构域序列正确。 

接下来用BglII和BamHI酶切pTA-MTα，琼脂糖凝胶回收小片段MTα(110bp)，MTα与经BamHI酶切并去磷酸化的载体pGEX-2T连接。酶连操作按照以下方法进行：取pGEX-2T 1μl稀释到10μl。取回收的MTα基因片断，室温下溶解。建立酶连体系如下：体系1(物质的量比为1∶40)：稀释后的线状pGEX-2T 0.2μl，MTα8.5μl，T4DNA Ligase Buffer 1μl，T4DNA Ligase 0.3μl，ddH₂O补足10μl。体系2(对照)：稀释后的线状pGEX-2T 0.2μl，T4DNA Ligase Buffer 1μl，T4DNA Ligase 0.3μl，ddH₂O补足10μl。16℃过夜反应。 

按照申请人的经验，一步酶连反应一般可以获得三聚串连体(pGMTα3)，然后以三聚串连体为基础进一步获得更高数目串连体。pGMTα3经BamHI酶切，并进行去磷酸化处理，获得线状pGMTα3，溶解冻存的MTα片段，建立线状pGMTα3与MTα片段的酶连体系(pGMTα3∶MTα的物质的量比为1∶40)。酶连转化获得的克隆子经过验证得到四聚体串联体MTα4，并被命名为pGEX-4T-mMT4α。 

3、镉特异性启动子的克隆和X4表达载体的构建 

以恶臭假单胞菌KT2440(Anu Leedja¨rv et al.，2008)基因组DNA为模板，PCR扩增镉响应启动子片段。恶臭假单胞菌KT2440总DNA的抽提： 

(1)用1.5ml离心管将LB液体培养基过夜培养的菌液离心收集菌体，6,000rpm离心5min，弃上清液； 

(2)加入300μlTE，吹吸充分混匀，8,000rpm离心5min，弃上清液，重复2次； 

(3)用300μlTE混匀，再加入15μl 10mg/ml的溶菌酶37℃水浴30min； 

(4)加入30μl 10％的十二烷基硫酸钠(SDS)混合均匀水浴37℃至50℃； 

(5)再加入5μl蛋白酶K，50℃水浴1h； 

(6)加入80μl 5M的NaCl； 

(7)加等体积的酚-仿，振荡5min，12,000rpm离心5min，使溶液分层，取上层水相； 

(8)重复上述操作，至无蛋白析出，取上层水相； 

(9)加入2倍体积的无水乙醇在-20℃保温30min沉淀DNA，12,000rpm离心5min，弃上清液； 

(10)加入70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，弃上清，置于室温自然风干，加入50μl ddH₂O使DNA完全溶解； 

(11)将抽提的总DNA取2μl，用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA质量。 

然后以上述抽提的总DNA为模板，以正向引物：5’--GGGTCGACCTTAAATTGAGCCTGTTG--3’；反向引物：5’--GCGAAGCTTAGATCTCAATGCCCGTGA--3’进行PCR扩增，50μLPCR反应体系中包含：10μL5×PCRBuffer，28.75μL dH₂O，0.25μLKOD酶，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1μL模板。PCR反应参数和程序为：94℃，2min，1个循环；94℃，15sec，64℃，30sec，68℃，3min，30个循环；4℃，5min，1个循环。PCR产物进行凝胶检测如图2，然后将启动子连接入广宿主表达质粒pTR102，形成pTR102-PcadR，并进行测序。序列如SEQ ID NO：3 

4镉修复功能质粒pCIM的构建和基因工程菌CH01的获取 

为了进行高效专一的重金属镉污染土壤的修复，申请人在本身能耐受镉并具有一定镉修复能力的宿主菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X4(该菌株于2009年12月19日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO M209319)的基础上，以镉特异性启 动子驱动金属结合蛋白猴金属硫蛋白α结构域四串联体在宿主菌表面展示表达。功能质粒包括镉特异性启动子，细菌表面展示元件inx-N和金属硫蛋白α结构域四串联体。具体构建流程见图3。构建过程如下所述。 

以pGEX-4T-mMT4α为模板，以5’GAATTCTGCGTACCCGCGAAAT3’和’GGATCCT TATTATCT AGAGATTCGAATTCCCG3’为引物进行PCR扩增，PCR体系包括引物各2.5μL，模板DNA1μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.8μL，10×Ex-TaqDNA聚合酶缓冲液5μL，dNTP mixture 4μL，ddH₂O 34.2μL，PCR条件为94℃2min，94℃15sec，58℃30sec，68℃20sec，循环25次。PCR产物经过凝胶电泳分析检测；然后连接到pMD18-T得到pMD18-mMT4α质粒，然后进行测序以确定。 

将pMD18-mMT4α和pMD18-inaX分别用限制性内切酶EcoRI处理，使两者产生互补的粘性末端，连接得到pMD18-inaX-N-mMT4α，经过测序证实inaX-N-mMT4α为同一开放阅读框(ORF)下的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(即本发明需要的功能序列)。然后用NcoI和BamHI分别处理pTR102-PcadR和pMD18-inaX-N-mMT4α，回收pTR102-PcadR和inaX-N-mMT4α融合基因，酶连后得到载体pCIM(pTR102-PcadR-inaX-N-mMT4α)，电转化X4得到重组菌X4/pCIM，该重组菌被命名为CH01。 

4、重组恶臭假单胞菌CH01的生物学及遗传学特性 

①生物学特性：革兰阴性杆菌，单端丛毛菌，专性需氧，最适生长温度25℃～30℃，生长迅速，但是在42℃不生长，饱和培养物有腥臭味。有荚膜。对镉(Cd²⁺)7mM、铜(Cu²⁺)4.5mM、钴(Co²⁺)7.5mM、银(Ag⁺)0.05mM、锌(Zn²⁺)7.5mM等重金属有较好的耐受性。 

②遗传学特性：本发明是以对重金属具有高度耐受性的恶臭假单胞菌X4为出发菌株得到的重组恶臭假单胞菌CH01，该重组菌株CH01含有本发明构建的镉吸附功能质粒pCIM，该质粒能在该重组菌中稳定存在，表达正常，对受体菌的生长无重大影响。 

③培养条件：本重组菌CH01所使用的培养基为MJS培养基：HEPES 12.5mM(pH7.1)；NaCl 50mmol/L；NH₄Cl 20mmol/L；KCl 1mmol/L；MgCl₂1mmol/L；MnCl₂0.05mmol/L；酪氨酸0.8％；甘油4％；硫胺素0.005％，121℃高压蒸汽灭菌30min。培养本发明的重组菌CH01时应加入氨苄青霉素Amp 100μg/mL；盐酸四环素Tet 20μg/mL，然后进行28℃，200r/min摇瓶培养。培养恶臭假单胞菌X4时基本条件同上，但该菌使用的抗生素为氨苄青霉素Amp，其终浓度为100μg/mL。 

实施例2  本发明的基因工程菌CH01对镉吸附能力实验 

1、生长态镉的吸附 

将本发明构建的基因工程菌CH01和出发菌株恶臭假单胞菌X4在含有相应抗生素的MJS培养基中过夜培养，然后按照1∶100的比例接种到50毫升的新鲜培养基中培养到OD₆₀₀为0.6，然后加入终浓度为100μmol/L的CdC1₂，于11h、21h、31h分别取样2mL，测量镉的吸附量。具体测量方法是将菌液样品于13000r/min离心5min，沉淀用5mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.1)混合0.8％NaCl溶液洗涤3次，65℃干燥24h，再加入100μL浓硝酸硝化48h，硝化产物用ddH₂O稀释，然后用石墨炉原子吸收分光光度计测定菌体中镉的含量。图4表明，随着培养时间的增加，菌体对镉的单位吸附量逐渐增大。基因工程菌CH01对镉的吸附量达到2.17±0.4nmol/mg(干重)，是对照菌吸附量的2倍左右，显著提高了细菌对镉的吸附能力。本实验证 实本发明中的基因工程菌CH01能显著增强对重金属镉的吸附而具备修复镉污染土壤或水体的能力。 

2、静态镉吸附 

为了模拟工程菌投入土壤后，在土壤中的缓慢生长状态对镉吸附的影响，发明人进行了静态细胞镉吸附实验。将基因工程菌CH01和出发菌株恶臭假单胞菌X4进行过夜培养，然后按照体积比为1∶100的比例接种到50毫升的新鲜培养基中培养到OD₆₀₀为0.6，然后加入终浓度为50μmol/L的CdCl₂，28℃静置培养17h，冰上冷却20min，4℃离心收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液洗涤3次，重悬，再加入终浓度为50μmol/L的CdCl₂，分别于0、5、30、60和150min取样2mL，按照前述方法测定镉的吸附量。从图5可以看出，细胞与镉的结合在很短时间内完成，最大吸附量的90％都在5min时间内完成。工程菌的最大吸附量达到2.96±0.5nmol/mg(干重)，是对照的0.5±0.02nmol/mg(干重)吸附量6倍左右。在5min取样测得的吸附量与最高浓度吸附量相比较，占91％以上，这说明工程菌能在5分钟内快速、高效且专一的吸附重金属镉。本实验证实在模拟土壤环境中本发明中的基因工程菌CH01能高效专一的吸附重金属镉。 

实施例3 

本发明的基因工程菌CH01与植物共生水培实验 

本发明的制备的用于水培培养的植物营养液见表1所示。 

表1  用于水培实验的植物营养液配方 

本实施例的具体步骤如下： 

(1)将玉米和豇豆种子用95％的乙醇浸泡5min，再用100％NaClO洗5min，然后用无菌水漂洗5-10次。将玉米和豇豆种子置于装有无菌水的培养皿中，置于28℃恒温光照培养箱中催芽，玉米和豇豆种子的培养皿中水变浑浊后换水，约3天生根。将生根的种子置于石英砂上继续培养，每天浇一次Hoagland’s营养液，28℃恒温光照培养10天。 

(2)将培养至稳定期的恶臭假单胞菌X4和基因工程菌CH01在4℃，4000r/min条件下离心10min收集菌体，并用PBS(pH 7.2)洗涤两次，最终重悬于Hoagland’s营养液中，使终浓度达到10⁷CFU/mL。 

本发明中用于植物水培的Hoagland’s营养液是由去离子水配好的大量元素和微量元素的的1000倍浓缩液，避光保存备用。换培养液时用去离子水稀释后根据需求用氢氧化钠和盐酸溶液调节pH值。具体的 元素组成如表1所示。 

(3)将植物小苗移栽到装有Hoagland’s营养液的三角瓶中，瓶口用锡纸将基部固定。每个瓶子装入一个通气管，管口置于瓶底部，用空气泵向瓶内通气。三角瓶外面套上一层不透光的黑布，置于光照培养室培养，每7天换一次Hoagland’s营养液，培养20天后接入处理过的工程菌。待菌体在根部定殖4天后，换成含有100μmol/L镉的营养液。继续培养7天后收获植株，将收获的植株根分离，108℃烘干48h后称重，取0.05g于1mL浓硝酸中硝解48h后，稀释过滤后测定镉含量。 

实验结果表明，加入镉的植株都表现出生长迟缓、植株矮小、茎倒伏、叶片黄化等现象。但接入基因工程菌CH01后能显著提高植物在镉环境下的干重和株高，增强对镉胁迫的耐受(图6)。接种工程菌CH01的植株和接种恶臭假单胞菌X4的相比较，玉米和豇豆组中的基因工程菌CH01处理比恶臭假单胞菌X4处理的干重和株高都要高，说明本发明的基因工程菌工程菌CH01能有效缓解重金属镉对植物的生物毒性。 

植物根际镉含量原子吸收结果(图7)表明，接入基因工程菌CH01和原宿主菌恶臭假单胞菌X4的植株其根际与对照组根际相比都有较高的镉吸附量，且主要集中在植物的根部。吸附量最高均为接入基因工程菌CH01的植株根际，其中豇豆根际最高达到16.13±3.80nmol/mg(干重)，与对照比较，吸附量差异最大的为玉米组，接入基因工程菌CH01的植株根际镉吸附量是对照组到1.75倍。本实验证明本发明中的基因工程菌CH01在部分农作物的实际生产中能通过在植物根际吸附固定重金属镉而避免重金属向植物体内的转移，从而保护农作物免受镉的毒害。 

参考文献 

1.McGregor D B，Baan R A，Partensky C，Rice J M，Wilbourn J D.Evaluation of thecarcinogenic risks to humans associated with surgical implants and other foreign bodies-areport of an IARC Monodraphs Programme Meeting，International Agency for Research onCancer.Eur J Cancer，2000，36：307-313 

2.Jacobs F A，Beauchemin F M，Brousseau M R.Human metallothionein-II is synthesized as astable membrane-localized fusion protein in Escherichia coli..Gene，1989，83：95-103 

3.Romeyer F M，Jacobs F A，Brousseau R.Expression of a Neurospora crassa metallothioneinand its variants in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol，1990，56：2748-2754 

4.Sousa C，Kotrba P，Ruml T，Cebolla A，De Lorenzo V.Metalloadsorption by Escherichia colicells displaying yeast and mammalian metallothioneins anchored to the outer membraneprotein LamB.J Bacteriol，1998，180：2280-2284 

5.Valls M，de Lorenzo V，Gonzalez-Duarte R，Atrian S.Engineering outer-membrane proteins inPseudomonas putida for enhanced heavy-metal bioadsorption.J Inorg Biochem，2000，79：219-223 

6.Valls M，Gonzalez-Duarte R，Atrian S，De Lorenzo V.Bioaccumulation of heavy metals withprotein fusions of metallothionein to bacterial OMPs.Biochimie，1998，80：855-861 

7.Anu Leedja¨rv，Angela Ivask，and Marko Virta.Interplay of Different Transporters in theMediation of Divalent Heavy Metal Resistance in Pseudomonas putida KT2440.J Bacteriol，2008，190(8)：2680-2689 

序列表 

<110>华中农业大学 

<120>吸附重金属镉的基因工程菌CH01及应用 

<130> 

<141>2009-12-29 

<160>4 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>540 

<212>DNA 

<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris) 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(540) 

<223> 

<400>1 

atggtccata tgaatcgcga aaaagtcttg gcattacgca cttgcacgaa caacatgtcc     60 

gatcattgcg ggctgatctg gccactgtcc ggcatcgtcg aatgtcggca ttggcaaccc    120 

agcatcaaac aggaaaacgg cttgaccggc ctgttgtggg gacagggcac caatgcgcat    180 

ctgaacatgc atgccgacgc gcattgggtc gtctgcatgg tggacaccgc cgacatcatc    240 

tggctgggcg aagagggaat gatcaagttc cccagggcgg aggtggtcta cgccggcaac    300 

cgtgcgggcg cgatgagctg catcgccgcc ggcatcgagc agcattcgcc acccaagccc    360 

gagccccctg cagacagcgt gattgctgcg gagttcactc ccaaggcggc gcatgcgcaa    420 

ttcactgcgc ccgtcgttga aagcggtgcg cattccaccg cgccactgcc atcgccgcct    480 

aatggcatcg gcccacaagc cgcgcagccg tcaaatgcga tcctgcgtac ccgcgaaatc    540 

<210>2 

<211>96 

<212>DNA 

<213>猴子(Macaca) 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(96) 

<223> 

<400>2 

aagaaaagct gctgctcctg ctgccccgtg ggctgtgcca agtgtgccca gggctgtgtc    60 

tgcaaagggg cgtcggagaa gtgcaactgt tgtgcc                              96 

<210>3 

<211>541 

<212>DNA 

<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) 

<220> 

<221>promoter 

<222>(1)..(541) 

<223> 

<400>3 

gcgaagcttt tggctcaatg cccgtgactc cgccccacat gggaatgttc ggtatccggt     60 

accgataccg ccccgtttgt ctccagttgc tgcaagatcg cgcattcact cccctgcgcg    120 

ttgcagcgcc gccgcagctc caccagctgc tcctgcaatg ccaccaagcc atcgatccgc    180 

gcctgaacat gctcgatatg ctcgtcgatc agcgcattga cgctgccgca cgcgtcgtcg    240 

gggctgtcgc gcaggcgtag caggctgcga atttcgtcca gggtcatgtc cagcgtgcgg    300 

cagttgcgga tgaaggtcag ccgctccaca tgggcctggg tgtacaaccg gtagttgccc    360 

tcgctgcgcg ccggctctgg cagcaggttt tcacgctcgt agtagcggat ggtttccacc    420 

gcgcagtcgg tggctttggc cagttctccg atcttcatca cgaaatctcc agcaagtggc    480 

ttgaccctat agtggctaca gggtgttcac ttggcaacag gctcaattta aggatgaccc    540 

c                                                                    541 

<210>4 

<211>966 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(966) 

<223> 

<400>4 

atggtccata tgaatcgcga aaaagtcttg gcattacgca cttgcacgaa caacatgtcc     60 

gatcattgcg ggctgatctg gccactgtcc ggcatcgtcg aatgtcggca ttggcaaccc    120 

agcatcaaac aggaaaacgg cttgaccggc ctgttgtggg gacagggcac caatgcgcat    180 

ctgaacatgc atgccgacgc gcattgggtc gtctgcatgg tggacaccgc cgacatcatc    240 

tggctgggcg aagagggaat gatcaagttc cccagggcgg aggtggtcta cgccggcaac    300 

cgtgcgggcg cgatgagctg catcgccgcc ggcatcgagc agcattcgcc acccaagccc    360 

gagccccctg cagacagcgt gattgctgcg gagttcactc ccaaggcggc gcatgcgcaa    420 

ttcactgcgc ccgtcgttga aagcggtgcg cattccaccg cgccactgcc atcgccgcct    480 

aatggcatcg gcccacaagc cgcgcagccg tcaaatgcga tcctgcgtac ccgcgaaatc    540 

gaattcaaga aaagctgctg ctcctgctgc cccgtgggct gtgccaagtg tgcccagggc    600 

tgtgtctgca aaggggcgtc ggagaagtgc aactgttgtg ccggatctaa gaaaagctgc    660 

tgctcctgct gccccgtggg ctgtgccaag tgtgcccagg gctgtgtctg caaaggggcg    720 

tcggagaagt gcaactgttg tgctggatct aagaaaagct gctgctcctg ctgccccgtg    780 

ggctgtgcca agtgtgccca gggctgtgtc tgcaaagggg cgtcggagaa gtgcaactgt    840 

tgtgccggat ctaagaaaag ctgctgctcc tgctgccccg tgggctgtgc caagtgtgcc    900 

cagggctgtg tctgcaaagg ggcgtcggag aagtgcaact gttgtgccaa gcttccggga    960 

atttaa                                                               966 

Claims (3)

1.一株能够修复重金属镉污染的重组恶臭假单胞菌CH01，其特征在于，该菌株是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CH01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO M209320。

2.一个具有重金属修复功能的广宿主质粒的构建方法，其步骤包括：将SEQ ID NO：2所示的猴金属硫蛋白α结构域序列，组装成四聚体mMT4α，然后将其与如SEQ ID NO：1所示的野油菜黄单胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端序列结合，得到人工构建的具有吸附重金属镉的如序列表SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；再将SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示的恶臭假单胞菌KT2440的镉特异性启动子序列进行拼接，最后将所述的SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列与广宿主表达载体pTR102拼接，获得质粒pCIM。

3.权利要求1所述的重组恶臭假单胞菌CH01重金属镉污染治理中的应用。

Images