CN101886119A

CN101886119A - 一种检测基因断裂融合的方法

Info

Publication number: CN101886119A
Application number: CN2010101113634A
Authority: CN
Inventors: 王宏伟; 覃艳红; 陈秀花; 齐喜玲; 徐智芳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2010-11-17

Abstract

一种检测基因断裂融合的方法，目的是快速、有效；本发明将基因的恒定断裂位区域设为Breakpiont区，简称B区；恒定表达区设为Control区，简称C区；两区相对表达量之比称为B/C比值；使用引物设计软件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定断裂位点B区与恒定表达区C区设计引物及探针；B区引物分别设计在exon5和exon7内；C区在跨exon3和exon4区域设计；采用荧光定量PCR方法检测AML1基因B区与C区扩增产物量，由B/C比值来判断是否发生融合事件；设B/C比值低于0.60作为筛选标准；采用RACE方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定。

Description

一种检测基因断裂融合的方法

技术领域

本发明涉及一种基因发生断裂融合的检测方法，具体地，是涉及到急性髓系白血病相关基因AML1、RARα、MLL等断裂融合的检测方法。

背景技术

白血病是源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，染色体异常是白血病发生的常见原因。染色体导致的分子事件是两个基因的断裂融合，如t(15；17)形成PML/RARα融合基因，t(8；21)导致AML1/ETO的形成。融合基因的发现有助于研究白血病发生的分子机制并寻找特定的靶向药物。如PML/RARα导致AML-M3分子机制的阐明，使全反式维甲酸(ATRA)成为治疗AML-M3的成功药物。其它一些染色体异常，尽管其致病机制尚未阐明，但临床实践发现其已成为很好的独立预后指标。例如：一些染色体异常如inv(16)，t(16；16)，t(8；21)的白血病患者预后较好，另一些染色体异常，包括t(6；9)，t(9；22)，del(5q)和del(7q)则预后较差，而其它染色体异常(如+8、+6、-Y)和无明显遗传学异常的病例预后中等。可见基因断裂融合是白血病发生的主要原因，特定融合基因异常在白血病的分型诊断、治疗及预后判断方面有重要意义。但是在急性髓系白血病中，常见融合基因断裂位点存在着复杂性及不同基因间断裂融合的多样性，而目前的多种检测手段均存在着明显的不足之处。基因融合事件的发生通常在两个层面进行检测，一是细胞遗传学检测，即以染色体为主体的显带技术及荧光原位杂交技术(Fluorescence In-Situ Hybridization，FISH)，国外常采用FISH方法进行鉴定，但其对于未知染色体异常病例，常需多种探针进行筛选，成本高，周期长，不适合常规检测。另外一个是以mRNA为主体的RT-PCR检测技术，灵敏度较好，是目前融合基因检测的主要方法，但由于融合基因断裂位点的多样性以及“伙伴”基因的复杂性，使得常规RT-PCR方法无法检测到全部的易位类型。如欲覆盖所有融合基因类型，又需设计许多对引物进行多重PCR反应，这样既浪费时间又增加成本，而且难以检测到新的未知基因的断裂融合。

发明内容

本发明旨在克服上述已有技术的不足，提供一种快速、有效的检测基因断裂融合的方法。

鉴于融合基因的多样性和复杂性以及现有检测手段的不足，经分析比较了大量已报道的融合基因断裂位点，发现：虽然AML1、RARα和MLL等基因可以与不同的“伙伴”基因及相同“伙伴”基因的不同断裂位点形成许多种不同的融合基因，但是它们自身的断裂位点却是相对恒定的。例如，与AML1相关的染色体易位AML1基因断裂点恒定地发生在第5、6内含子，与RARα相关的染色体易位RARα基因断裂点恒定地发生在第2内含子，与MLL相关的染色体易位MLL基因断裂点恒定地发生在第5-9内含子之间。本发明即将这一发现作为基础进行基因断裂融合事件的检测。

本发明以AML1基因为例介绍相关的发明内容。本发明方法是：

(1)基因的恒定断裂位区域设为Breakpiont区，简称B区；恒定表达区设为Control区，简称C区。两区相对表达量之比称为B/C比值。

(2)使用引物设计软件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定断裂位点B区与恒定表达区C区设计引物及探针。AML1断裂融合发生在exon5或exon6之后，故B区引物需分别设计在exon5和exon7内。C区应在断裂区5’侧选择，故在跨exon3和exon4区域设计。B区和C区片段大小接近、退火温度一致，使其可在同一条件下扩增，扩增效率尽可能一致。

(3)荧光定量PCR方法检测AML1基因B区与C区扩增产物量，由两区相对表达量之比(即B/C比值)判断是否发生融合事件。理论上，对于二倍体细胞来讲，B/C比值＞0.5且＜1.0，认为AML1基因发生了断裂融合，但实际上由于初发白血病细胞数量、实验操作手法、PCR的敏感性等问题的影响，B/C比值会和理论上有所区别。经大样本统计分析，正常对照组B/C比值位于0.7260-1.51之间，因此我们设B/C比值低于0.60作为筛选标准，即：B/C比值低于0.60视为AML1基因发生了断裂融合。以0.60作为筛选标准，可能会漏选一些可疑病例，但可以优先筛选出最可疑AML1基因发生断裂融合的病例。

(4)采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定。

对于筛选出的可疑的基因发生断裂融合的病例，采用RACE方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定，可寻找到新的“伙伴”基因。

本发明方法适用于以AML1基因为代表的自身断裂位点恒定于某一区域，但可以和不同基因发生融合的这类基因的断裂融合检测。本发明采用新的引物设计思路建立一种更加快速、有效的检测基因断裂融合的方法，克服了现有基因融合事件检测手段的缺陷，可以最大限度地检出与此类基因相关的各种融合事件，更客观准确地服务于急性髓性白血病的诊断、治疗及预后判断。通过本方法有望寻找到新的断裂位点及“伙伴”基因，新的断裂位点的发现有助于阐明基因断裂融合发生的分子机制，新的“伙伴”基因的发现有助于解释白血病发生的异质性，并筛选出新的白血病发生相关基因，进而为寻找靶向药物及实现个体化治疗奠定理论基础。

附图说明

图1为正常二倍体细胞中B区与C区表达量。

图2为发生断裂融合的二倍体细胞中B区与C区表达量。

图3荧光定量PCR标准曲线图。

图4为荧光定量PCR检测正常对照标本的B/C比值的结果图。

图5为荧光定量PCR检测AML1/ETO融合基因阳性标本的B/C比值结果图。

图6为RACE实验电泳结果图。

图7为目的产物克隆测序图。

图1所示：由于B区未发生断裂，两区表达量相同，故B区与C区拷贝数之比为2∶2，B/C比值为1。

图2所示：一条染色体上B区发生了断裂融合，断裂位点处无法形成扩增产物，则故B区与C区拷贝数之比为1∶2，B/C比值为0.5。

图4所示：三次重复B区和C区的CT值均相近，其B/C比值平均值为1.17，说明B区未发生断裂融合事件。

图5所示，三次重复B区明显低于C区约1个CT值，其B/C比值平均值为0.33，比值明显降低，说明B区发生了断裂融合事件。

图6所示：测序结果经Blast分析为1号染色体1p33-p32.1区域的PRP38A基因，为AML1基因的一种新的断裂融合伙伴基因。

具体实施方式

AML1基因断裂融合的检测：

(1)引物和探针的设计与合成

在基因文库中检索AML1基因cDNA序列(序列号为NM_001001890)，AML1基因有AML1a、AML1b、AML1c三种mRNA，又因exon6是否缺失分为6种不同的转录本，但统计发现，缺失exon6所占比例恒定约为20％，所以只针对不缺失exon6的转录本在断裂点即第五内含子两端设计B区引物B1、B2，非断裂位点即跨三、四外显子设计C区引物C1、C2，这样可以满足荧光定量PCR产物片段小于150bp的限制。引物及探针由上海基康生物公司合成，去离子水溶解，浓度10μmol/L，-20℃保存。引物和探针序列及产物大小如下：AML1B区引物，正向B1：5′-ATGGGCCCCGAGAACCT-3′，反向B2：5′-GTGGGCTGACCCTCATGG-3′，探针：5′-FCCTTTTCCGAGCGGCTCAGTGAACTP-3′，AML1C区引物，正向C1：5′-TTGTGAAGACAGTGATGGTCAGAGT-3′，反向C2：5′-GCTACCGCAGCCATGAAGAA-3′，探针5′-FAGCTTTTCCCTCTTCCACTTCGACCGP-3′。

(2)RQ-RT-PCR检测B/C比值

1)总RNA的提取

骨髓标本2ml，EDTA抗凝，按试剂盒Triszol说明书提取白细胞总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度，为符合要求(A260/A280≥1.7)的标本。

2)逆转录反应

反应体系20μl，取样品总RNA1μg，随机引物250ng，加DEPC水至11μl，70℃5min后立即冰浴，然后依次加入5×逆转录反应缓冲液2.5μl，10mmol/LdNTP2.5μl，RNAsin20U，加DEPC水至19μl，25℃5min后立即冰浴，M-Mulv逆转录酶200U，25℃10min，42℃60min，70℃10min，立即将反应管冰浴，反应产物于-20℃冰箱保存，用于PCR扩增。

3)标准品的制备及标准曲线的建立

在AML1基因B区、C区外侧设计一对引物，扩增1例正常对照标本的AML1基因。将其扩增产物克隆入pMD18-T载体，经重组质粒的转化、含重组质粒菌株的筛选和扩增、重组质粒提取、鉴定、纯化、测序鉴定，并将其定量，根据分子量及阿佛加德罗常数(6.023×10²³分子数/mol)换算为分子拷贝数，最后从10¹⁰拷贝/μl开始行10倍稀释建立阳性模板梯度。取稀释为10⁶-10¹⁰拷贝/μl的AML1正常表达阳性模板各3μl进行荧光定量PCR反应。为了纠正mRNA定量、RT以及PCR扩增效率差异对结果的影响，AML1B区和C区的绝对拷贝数之比，作为AML1基因的相对表达量。

4)PCR反应

为提高扩增产物B、C片段的可比性，反应体系除引物、探针外均混匀后对等分配，每个标本做三次重复实验。取模板cDNA9μl，加入9份TaqMan Core Regeants12.5μl，cDNA5μl，去离子水7.5μl充分混匀后，取4份即100μl分至两管中。再在这两个管中分别加入4份B区、C区10μM引物各0.5μl，10μM探针1μl，充分混匀后平分至三个管中。反应条件为95℃10S；95℃15S，60℃20S，扩增45个循环。

5)B/C比值检测结果

由于正常对照组B/C比值位于0.7260-1.51之间，我们设B/C比值低于0.60作为筛选标准，即：B/C比值低于0.60视为B区表达降低。本例B/C比值为0.41，可认为B区发生了新的断裂融合事件。本例临床诊断为AML-M4，AML1-ETO融合基因为阴性，由此结果分析该患者AML1基因可能与ETO基因外的其它伙伴基因发生了断裂融合。

(3)RACE鉴定AML1伙伴基因

1)引物设计和合成

使用Primer5.0软件在AML1基因的mRNA序列上分别设计巢式PCR外侧及内侧引物。RACE鉴定实验引物，外侧引物Exo3-F：5′-CAACAAGACCCTGCCCATCGCTTTC-3′，内侧引物Exo5-F：5′-CTGTCTTCACAAACCCACCGCAAGT-3′。

2)逆转录反应

使用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit合成cDNA。

为保证实验的可靠性，同时设立control对照与RTase-对照对照(即不添加ReverseTranscriptase，用于检测DNA污染)。

反应总体积为10μl，首先取样品总RNA200ng，12μM 3’RACE CDS Primer 1μl，72℃2min，42℃3min反应，然后依次加入5×First-Strand Buffer 2μl，40U/μl RNaseInhibitor 0.25μl，DTT(20mM)1μl，100U/μl SMARTScribe^TM Reverse Transcriptase1μl(RTase-对照用1μl Sterile H₂O替代)，加Sterile H₂O至10μl，于42℃90min，70℃10min条件下反应，向上述RT产物中各加20μl Tricine-EDTA Buffer，稀释后用于PCR扩增。

3)PCR反应

使用Advantage-GC 2PCR Kit，进行巢式PCR扩增。

首轮PCR扩增用外侧引物，二次PCR扩增用外侧引物。两次扩增反应体系及条件均相同。

反应总体积为50μl，包括上述稀释后的RT产物2.5μl，5×GC 2PCR Buffer 10μl，5M GC Melt 5μl，20μM F primer 0.5μl，20μM R primer 0.5μl，50×dNTP Mix 1μl，Advantage-GC 2Polymerase Mix 1μl，加去离子水至50μl。扩增条件为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，68℃退火30秒，共35个循环，最后68℃延伸6分钟。将首轮PCR产物稀释50倍Tricine-EDTA Buffer，稀释后取5μl产物用于第二次PCR扩增。扩增产物分别取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳分析。目的产物纯化并进行克隆测序分析。

4)克隆测序分析

将上述目的基因切胶、回收并纯化后进行克隆测序，测序结果经Blast分析为1号染色体1p33-p32.1区域的PRP38A基因。

本实施方式仅用于举例说明本发明，并不构成对本发明保护内容的限制。

序列表

核苷酸或氨基酸序列表

<110>王宏伟

<120>一种检测基因断裂融合的方法

<160>8

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>智人种(Homo sapiens)

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)...(17)

<400>1

atgggccccg agaacct 17

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>智人种(Homo sapiens)

<220>

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<400>2

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<210>3

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<212>DNA

<213>智人种(Homo sapiens)

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<400>3

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<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>智人种(Homo sapiens)

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<400>4

ttgtgaagac agtgatggtc agagt 25

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>智人种(Homo sapiens)

<220>

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<210>6

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<213>智人种(Homo sapiens)

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<400>6

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<222>(1)...(25)

<400>8

ctgtcttcac aaacccaccg caagt 25

Claims

1.一种检测基因断裂融合的方法，其特征是：

(1)基因的恒定断裂位区域设为Breakpiont区，简称B区；恒定表达区设为Control区，简称C区；两区相对表达量之比称为B/C比值；

(2)使用引物设计软件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定断裂位点B区与恒定表达区C区设计引物及探针；AML1断裂融合发生在exon5或exon6之后，故B区引物需分别设计在exon5和exon7内；C区应在断裂区5’侧选择，故在跨exon3和exon4区域设计；B区和C区片段大小接近、退火温度一致，使其可在同一条件下扩增，扩增效率尽可能一致；

(3)荧光定量PCR方法检测AML1基因B区与C区扩增产物量，由B/C比值来判断是否发生融合事件；经大样本统计分析，正常对照组B/C比值位于0.7260-1.51之间，因此设B/C比值低于0.60作为筛选标准，即：B/C比值低于0.60视为AML1基因发生了断裂融合；

2.如权利要求1所述的检测基因断裂融合的方法，其特征是对于筛选出的可疑的基因发生断裂融合的病例，采用RACE方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定，寻找到新的“伙伴”基因。

3.如权利要求1所述的检测基因断裂融合的方法，其特征是检测对象是以AML1基因为代表的自身断裂位点恒定于某一区域，但可以和不同基因发生融合的这类基因的断裂融合。