CN101886068A - 一种固相化sumo化系统及固相化去sumo化系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种固相化SUMO化系统及一种固相化去SUMO化系统。本发明提供的固相化SUMO化系统固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9的SUMO化系统；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系统；其中，SUMO化系统包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9。固相化去SUMO化系统包括固相化的水解酶Ulp1。使用本发明提供的固相化SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将可SUMO化的蛋白进行SUMO化；使用本发明提供的固相化去SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将SUMO化的蛋白去SUMO化，同时，上述固相化系统还可重复利用。

Description

一种固相化SUMO化系统及固相化去SUMO化系统

技术领域

本发明属于酶学领域，具体地说，涉及一种固相化SUMO化系统及一种固相化去SUMO化系统。

背景技术

在1996年，Blobel发现SUMO(Smt3)能够共价的结合一个小G蛋白的激活蛋白RanGAP1，并能影响此蛋白在细胞核与核质的运输，随后第一次将此类小蛋白命名为SUMO(small ubiquitin-like modifier)。随后，SUMO化修饰在多种生命过程，在多种生物体(酵母，昆虫，线虫甚至高等脊椎动物)中被发现，并得到阐释。SUMO在细胞的多项生理过程，在疾病的发生发展过程中和某些药物的作用过程中，都发挥着重要的调控作用，成为现阶段蛋白质翻译后修饰领域一个重要研究内容和商业化应用的重要领域。因此，如何对目的蛋白方便、快捷地进行SUMO化和去SUMO化就成为了其研究的一个热点。

目前对于SUMO化的研究方法主要为：首先通过位点的预测寻找感兴趣的可能被SUMO化的蛋白，然后通过SUMO激活酶E1(包括异源二聚体SAEI和SAEII)和SUMO转移酶Ubc9进行SUMO化确证，然后集中于研究SUMO化后的蛋白底物的功能。但由于进行SUMO化确证时，没有一个合适的操作平台，导致对目标蛋白的SUMO化及SUMO化后的后续处理均不方便，因此，需要一种能够用于快速高通量鉴定蛋白SUMO化的系统，以简化SUMO化操作。

同时，在后基因组时代的研究中，研究一个基因的重要方面就是对它的翻译产物的体外功能进行分析，因此，要求能够方便快捷经济地获得重组蛋白质。然而随后的实践证明，在最为普遍使用的大肠杆菌表达系统中，人类基因组中只有约25％的基因能够以可溶蛋白的方式表达。

解决上述两个问题的常用方法就是使用促溶表达融合标签，比如葡萄糖亲和标签MBP(maltose-binding protein)，谷胱甘肽转移酶标签GST(glutathione S-transferase)等。当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的产量和溶解性。

但是，在融合标签切除过程中，一个非常值得注意的问题就是许多蛋白质要获得生物活性以及结构稳定性都需要特定的N端氨基酸残基，尤其是很多用于结构研究以及医疗用途的蛋白质。然而所有新生蛋白质在其N端都是甲硫氨酸，然后经过转译后加工修饰才形成其它不同的氨基酸。而常用的GST，NusA或者MBP标签的切除，只能通过引入蛋白酶位点，在融合蛋白完成表达和纯化后，加入蛋白酶切除蛋白质标签。这样在融合标签切除过程中如何避免产生非天然N端氨基酸或者产生特异的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用过程中所面临的挑战。

而SUMO不仅是较好的促溶蛋白质表达标签之一，更重要的是，SUMO融合标签可以在体外被源于酵母的SUMO特异的蛋白质水解酶Ulp1极为高效和特异地切除，从而获得与天然靶蛋白完全相同的重组蛋白质，满足结构生物学研究和医疗用途的蛋白质需要。

但使用水解酶Ulp1进行去SUMO化处理时，现尚没有一个简单合适的操作平台，Ulp1酶的获得需要繁琐的纯化过程，同时Ulp1的加入也会给目标蛋白的纯化及其后续处理带来了不便，因此，需要一种能够十分简便而又能高通量的进行去SUMO化的系统，从而能够很好的解决上述问题，简化去除SUMO融合标签的操作。

ChBD作为一个特殊的结构域，对于胆碱或者胆碱类似物有很强的亲和吸附能力，能够特异性的吸附在二乙氨乙基纤维素(DEAE cellulose)上。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种固相化SUMO化系统。

本发明还有一个目的在于，提供固相化SUMO化系统的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供固相化SUMO化系统的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种固相化去SUMO化系统。

本发明还有一个目的在于，提供固相化去SUMO化系统的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供固相化去SUMO化系统的应用。

本发明提供的固相化SUMO化系统为固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9的SUMO化系统；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系统；其中，SUMO化系统包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9。

根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO激活酶SAEI的序列选自：

(a)SEQ ID NO：1；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO激活酶SAEI活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO激活酶SAEII的序列选自：

(i)SEQ ID NO：2；或

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO激活酶SAEII活性的由(i)衍生的蛋白质或多肽。

根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO转移酶Ubc9的序列选自：

(I)SEQ ID NO：3；或

(II)在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO转移酶Ubc9活性的由(I)衍生的蛋白质或多肽。

根据本发明的一个优选实施例，SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9的固相化为通过ChBD序列的连接将所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9吸附在二乙氨乙基纤维素上。

根据本发明的一个优选实施例，所述ChBD序列选自：

(1)SEQ ID NO：4；或

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。

本发明提供的固相化SUMO化系统的制备方法包括以下步骤：A)分别制备蛋白pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9；B)将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9分别与二乙氨乙基纤维素充分混合，或将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9分别两两混合，再与二乙氨乙基纤维素充分混合，或将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9与二乙氨乙基纤维素共同充分混合，以获得固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9。

本发明提供的固相化SUMO化系统的应用为用于高通量鉴定可SUMO化蛋白，或用于将可SUMO化蛋白SUMO化，以研究该可SUMO化蛋白的功能。

本发明提供的固相化去SUMO化系统包括固相化的SUMO水解酶。

根据本发明的一个优选实施例，所述SUMO水解酶的序列选自：

(1)SEQ ID NO：5；或SEQ ID NO：6；或

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。

根据本发明的一个优选实施例，SUMO水解酶的固相化通过ChBD序列吸附在二乙氨乙基纤维素上而将水解酶固相化。

本发明提供的固相化去SUMO化系统的制备方法包括以下步骤：A)制备蛋白pChBD-Ulp1；B)将步骤A中制备好的pChBD-Ulp1与二乙氨乙基纤维素充分混合，以获得固相化SUMO化系统。

本发明提供的固相化去SUMO化系统的应用为在体外将SUMO化蛋白去SUMO化。

使用本发明提供的固相化SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将可SUMO化的蛋白进行SUMO化；使用本发明提供的固相化去SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将SUMO化的蛋白去SUMO化，同时，上述固相化系统还可重复利用。

附图说明

图1a为改造后的表达载体pET28a的改造部分的结构示意图。

图1b为改造后的表达载体pET28a的多克隆位点MCS序列。

图2为pChBD-Ulp1的固相化酶催化反应的检测结果，其中，泳道1为Marker，泳道2为未加入游离Ulp1酶，只加入催化反应底物的阴性对照，泳道3为加入游离的Ulp1酶的阳性对照，泳道4为固相化pChBD-Ulp1第1次催化反应的检测结果，泳道5为固相化pChBD-Ulp1第2次催化反应的检测结果，泳道6为固相化pChBD-Ulp1第3次催化反应的检测结果。

图3为未优化的固相化SAEI，SAEII，Ubc9的SUMO化反应检测结果，其中，泳道1为三酶全游离的检测结果，泳道2为三酶全固相化的检测结果，泳道3-5为双酶固相化的检测结果，泳道6-8为单酶固相化的检测结果。

图4为优化的固相化双酶及三酶的SUMO化反应检测结果，其中，泳道1为三酶全游离的检测结果，泳道2为三酶全固相化的检测结果，泳道3-5为双酶固相化的检测结果。

图5为优化的固相化SAEI，SAEII双酶的SUMO化反应检测结果，其中，泳道1-3分别为同时固相化SAEI，SAEII双酶，催化SUMO化反应的第一次至第三次的催化反应结果。

具体实施方式

蛋白及其衍生的蛋白

本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明蛋白质或多肽的衍生形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有相应活性。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述衍生的蛋白质或多肽。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗本发明蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含本发明蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有本发明蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

如本文所用，衍生蛋白是指与本发明蛋白序列可高度同源或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述蛋白具有相应活性。

现有技术中已公开了本发明及其同源蛋白的序列，这些本领域已知的蛋白均包括在本发明中。

本发明中SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII，SUMO转移酶Ubc9优选获自人。本发明中SUMO水解酶优选为酵母SUMO水解酶Ulp1。

应理解，获自其它生物(与本发明如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它蛋白也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

亲和标签

本发明所述的亲和标签选自但不仅限于以下标签：Chitin binding domain(ChBD)，amino acid recognition sequence of a biotin ligase(例如AviTag)，Glutathione-S-Transferase(GST，Invitrogen)，His6 hexapeptide，Strep-tag II^TM(Sigma GenoSys)，calmodulin binding peptide(CBP，KRRWKKNFIAVSMNRFKKISSSGAL，Stratagene)，hemagglutinin(HA，YPYDVPDYA，BD Biosciences)，FLAG(DYKDDDD，Sigma Aldrich)，Myc(EQKLISEEDL，Stratagene)。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或产商推荐的条件进行。

在本发明的下述实施例中，按照Invitrogen公司的手册，将Ulp1酶活定义为：1单位Ulp1活性为在20μl体系(50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，5mM β-mercaptoethanol)中，30℃1小时能够切割2ug的SUMOEGFP标准蛋白质底物的酶量。

以下实施例中，使用的材料来源如下：

QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒购自QIAGEN公司。

载体pET28a购自Novagen公司。

Taq酶、溶菌酶购自Tiangen公司，限制性内切酶HindIII和KpnI、NheI和XhoI、XbaI，SalI、DNase I均购自NEB公司。

pEGFP-C1购自Clontech公司。

大肠杆菌BL21购自Invitrogen。

SuperScript^TM III试剂盒购自Invitrogen。

TIANamp酵母基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN。

293T细胞购自ATCC。

Ulp1酶购自Fulengen。

T1Buffe的配方为：Tris-HCl(pH7.5)50mM，NaCl 50mM，EDTA 1mM。

Ulp1酶切反应buffer的配方为：50mM Tris-HClpH 8.0，150mM NaCl，5mMβ-mercaptoethanol。

实施例1、制备ChBD目标序列

1.1、引物设计

设计引物Primer1-10，用于扩增制备ChBD目标序列，其中，Primer1-10的序列分别如下所示：

Primer1：5′-GGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACGGCTCTTATCCAAA-3′；

Primer2：5′-CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTCAAACTTGTCTTTTGGATAAGAGCCGTCT-3′；

Primer3：5′-GCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCTGGAGGAAGCAC-3′；

Primer4：5′-ATTTCGCCTGAGTTGTCGAACCAGTACCAGTTGCCGTCTGTGTGCTTCCTCCAGCGGTC-3′；

Primer5：5′-CGACAACTCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGATAAGTGGTACTATT-3′；

Primer6：5′-GTACTTGACCCAGCCTGTCTTCATGGCACCTTCTTCGTTGAAATAGTACCACTTATCAG-3′；

Primer7：5′-ACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCCAT-3′；

Primer8：5′-AGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAAGGCATTTGATACCATGGCGCCTTCTTTAGCG-3′；

Primer9：5′-CAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACTGGCAGACAGGCCA-3′；

Primer10：5′-TGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGTCTGGTTT-3′。

1.2、PCR扩增

分别以Primer2和3为模板，Primer1和4为引物对；Primer6和7为模板，Primer5和8为引物对；Primer8和9为模板，Primer7和10为引物对，进行PCR扩增。

然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒分别纯化回收扩增产物，并将得到的3个PCR扩增片段作为模板，以Primer1和10为引物进行二次PCR扩增。

在扩增完成后，加入Taq酶1ul，于72℃反应30min，以在目的片段两端加上A，然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒纯化回收，获得在序列两端加A的ChBD序列。

1.3、连接与转化

将步骤1.2中获得的在序列两端加A的ChBD序列通过TA克隆插入T载体，然后将连接产物转化到RbCl感受态细胞中。

使用碱法抽提质粒，并进行酶切鉴定和序列测定，测序结果如SEQ ID NO.：4所示，根据酶切鉴定和序列测定的结果，ChBD目标序列转化成功。

实施例2、ChBD序列转化感受态细胞

2.1、引物设计及PCR扩增

设计引物Primer11和Primer12，其序列分别如下所示：

Primer11：5′-CCCAAGCTTATGGTACATTCAGACGGCTCTTATCC-3′；

Primer12：5′-CGGGGTACCTGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGT-3′。

其中，Primer11中下划线标识的序列为HindIII识别位点；Primer12中下划线标识的序列为KpnI识别位点。

以实施例1.3中获得的质粒为模版，以Primer11和Primer12为引物对，进行PCR扩增，然后进行凝胶电泳检测，获得ChBD扩增序列。

然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150试剂盒纯化回收扩增产物。

2.2、连接与转化

使用酶HindIII和KpnI分别对经改造的表达载体pET28a(改造部分的结构如图1所示)和步骤2.1中获得的扩增产物进行酶切，然后使用T4DNA连接酶连接后，转化E.coli感受态细胞DH5α。

然后使用碱法小量抽提质粒，并对抽提获得的质粒进行酶切鉴定，结果显示，ChBD序列转化感受态细胞DH5α成功，获得pChBD载体。

实施例3、pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD-Ubc9，pChBD-Ulp1载体及SUMO1-pET28a和TopI-pET28a质粒构建

参考产品使用手册，使用SuperScript^TM III试剂盒，用人源的293T细胞构建cDNA文库。

参考产品使用手册，使用TIANamp酵母基因组DNA提取试剂盒提取酿酒酵母基因组。

设计引物SAEI-pF、SAEI-pR、SAEII-pF、SAEII-pR、Ubc9-pF、Ubc9-pR、Ulp1-pF、Ulp1-pR、SUMO1-pF、SUMO1-pR、Topo1-pF和Topo1-pR，序列如下：

SAEI-pF：AATCCGGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGC；

SAEI-pR：AAGAAGAATTCCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCA；

SAEII-pF：CCGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCT；

SAEII-pR：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATCA；

Ubc9-pF：GGGAATTCCATATGTCGGGGATCGCCCT；

Ubc9-pR：AACCCAAGCTTATGAGGGCGCAAACTTCTT；

Ulp1-pF：GGGAATTCCATATGGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATG；

Ulp1-pR：CCGGAATTCACTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA；

SUMO1-pF：ATGGGAATTCGGTACCCATATGTCTGACCAGGAGGCAAAA；

SUMO1-pR：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGCTAACCCCCCGTTTGTTCCTGA；

Topo1-pF：AATAGGGCTAGCGATCGCCATGAGTGGGGACCACCTCC；

Topo1-pR：AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTTCCTCTTCTTTCTTCGGCTT。

以构建好的人cDNA文库为模板，分别以引物SAEI-pF和SAEI-pR、SAEII-pF和SAEII-pR、Ubc9-pF和Ubc9-pR、SUMO1-pF和SUMO1-pR、以及Topo1-pF和Topo1-pR为引物对，进行PCR扩增，PCR扩增产物经QIAEX II Gel Extraction Kit 150胶回收，获得相应的基因片段，其中，SAEI基因片段序列如SEQ ID NO：1所示，SAEII基因片段序列如SEQ ID NO：2所示，Ubc9基因片段序列如SEQ ID NO：3所示。

以提取的酵母基因组为模板，以Ulp1-pF，Ulp1-pR为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物经QIAEX II Gel Extraction Kit 150胶回收，获得Ulp1基因片段，获得Ulp1基因片段如SEQ ID NO：5所示，Ulp1基因片段的全长序列如如SEQ ID NO：6所示。

将SAEI基因片段和SAEII基因片段通过NheI和XhoI双酶切，并将酶切产物连接入同样经过NheI和XhoI双酶切的pChBD载体中，经测序确定，得到了N端为ChBD，C端为SAEI和SAEII的融合克隆pChBD-SAEI和pChBD-SAEII。

采用同样的方法，分别得到了N端为ChBD，C端为Ubc9的融合克隆、N端为ChBD，C端为Ulp1的融合克隆pChBD-Ubc9和pChBD-Ulp1，以及pET28a-SUMO1和pET28a-Topo1。

将上述重组表达质粒转化大肠杆菌BL21后，诱导培养，表达其相应的蛋白并进行检测，具体操作如下：

接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养12～14小时；取上述培养菌液按1∶100比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，22℃培养16-20h。6000rpm离心1分钟收集菌体。

然后将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO₄至终浓度20mM，冰上消化至不粘，18000rpm/min离心15分钟后分别取上清S，沉淀P和全菌W，进行SDS-PAGE电泳，并以未诱导全菌Neg作为对照。

结果显示，分别获得了表达pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD-Ubc9，pChBD-Ulp1，SUMO1和TopoI的菌株。

实施例4、SUMO-EGFP融合蛋白制备

4.1、引物设计

设计引物P1、P2、P3和P4，序列如下所示：

P1：5’-GCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；

P2：5’-CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’；

P3：5’-CACCTACCATGGGTCATCACCATCA-3’；

P4：5’-GGAATTCTTTCATACCTCCAATCTGTTCGCGG-3’。

其中，引物P1和P4的下划线为EcoRI识别位点，引物P2的下划线为XholI识别位点，引物P3的下划线为NcoI识别位点。

4.2、pET28a-6His-EGFP质粒构建

以质粒pEGFP-C1为模板，以引物P1和P2为引物对，进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150回收，获得EGFP序列的扩增产物。

将EGFP序列的扩增产物和表达载体pET28a分别使用EcoRI和XhoI酶切，并连接后，转化E.coli感受态细胞DH5α，经检测获得pET28a-6His-EGFP质粒。

4.3、SUMO-EGFP融合表达载体构建

以酿酒酵母基因组为模板，以引物P3和P4为引物对，PCR扩增获得SUMO基因，然后以NcoI和EcoRI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a-6His-EGFP中，获得SUMO-EGFP融合表达载体。

4.4、SUMO-EGFP融合蛋白获得

将步骤4.3中获得的SUMO-EGFP融合表达载体经IPTG诱导表达后，经Ni柱纯化，获得SUMO-EGFP融合蛋白。

实施例5、pChBD-Ulp1固相化

取步骤3.3中获得的表达pChBD-Ulp1的菌株进行诱导培养，然后，进行如下操作，以实现pChBD-Ulp1固相化：

(1)5ml诱导表达的菌液离心后去除培养液加入600ul T1 Buffer混匀。

(2)加入溶菌酶至终浓度0.5mg/ml，冰上1小时。

(3)超声破菌(400w，40次，每次2s，间隔8s)。

(4)超声后的菌液4度离心13000rpm离心30分钟。

(5)与此同时对DEAE Beads进行处理，每份样品取Beads 100ul，离心以去除保存液，并用T1Buffer洗涤3次。

(6)超声后的菌液离心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗涤后的Beads中。

(7)4度混旋仪上旋转混匀1小时以充分结合。

(8)6000rpm离心1分钟，收集结合后的上清。

(9)T1 Buffer 500ul洗涤Beads。6000rpm离心1分钟。

(10)再用高盐洗脱Buffer 500ul洗涤2次，去除杂蛋白。

经检测，流出液中的Ulp1含量明显少于上清蛋白粗提物中的Ulp1含量，从而可确定pChBD-Ulp1固相化成功。

实施例6、pChBD-Ulp1的固相化酶催化反应

使用实施例5中获得的pChBD-Ulp1进行固相化酶催化反应，其中，向底物中加入Ulp1酶作为阳性对照；底物中不加入Ulp1酶，作为阴性对照；具体步骤和条件如下：

(1)结合pChBD-Ulp 1后的DEAE Beads再用Ulp1酶切反应buffer 500ul洗涤一次。离心，洗尽上清。

(2)加入Ulp1酶切反应Buffer 100ul，SUMO-EGFP融合蛋白2ug，4度混旋仪反应过夜。

(3)设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为SUMO-EGFP融合蛋白2ug，Ulp1酶1U，Buffer补足至20ul；阴性对照为加入SUMO-EGFP融合蛋白2ug，不加Ulp1酶，同样补足Buffer至20ul，4度混旋仪反应过夜。

(4)过夜反应后，6000rpm离心1分钟，取上清样品，加入Loading Buffer于100℃煮样品10分钟，留待SDS-PAGE胶电泳分析。

(5)固相化的Ulp1酶在取尽上清后，再用酶切反应buffer 500ul洗涤1次，再加入酶切反应buffer100ul，SUMO-EGFP融合蛋白2ug，继续4度混旋仪反应8小时。

(6)重复步骤(4)、(5)以进行第三次反应。

样品进行SDS-PAGE胶电泳分析，结果如图2所示。

根据图2结果，固相化之后的Ulp1仍然具有很好的酶活性，通过简单的高盐洗脱过程可以将杂蛋白洗脱，只在beads上留下所需的Ulp1酶。

同时，由于酶的催化反应本身的特性，在反应的过程中并不会被消耗，利用温和的反应条件可以使固相化酶的重复利用成为可能。在4度的反应条件下，进行到第三次酶催化反应，被固相化的Ulp1仍然具有很好的活性。同时，由于Ulp1酶本身不会随着反应液的洗脱而存在与反应之后的底物中，更利于后面相应的检测和反应。因此，固相化Ulp1酶催化反应体系存在的潜在商业价值。

实施例7、pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD-Ubc9的固相化及催化

7.1、单酶固相化

采用实施例5中的方法，将pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD-Ubc9分别进行固相化，获得单独固相化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD-Ubc9。

7.2、固相化单一酶的催化反应

将单独固相化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII或pChBD-Ubc9与纯化好的非固相化的另2种相应的酶混合，进行催化反应，同时，加入均为非固相化的上述3种酶进行催化作为阳性对照，其中，进行催化反应时，各酶浓度分别如下：SAEI为500ng，SAEII为1ug，Ubc9为1.5ug，底物为TopoI 1ug和SUMO 1ug，其中，TopoI和SUMO由表达TopoI和SUMO1的菌株pET28a-Topo1和pET28a-SUMO1分别经诱导表达、纯化获得。

反应结束后，取反应溶液进行Western Blot检测分析，结果如图3所示。

7.3、固相化双酶和固相化三酶的催化反应

将固定化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD-Ubc9全部混合或两两混合，分别获得固定化双酶和固定化三酶，然后参考步骤7.2中的方法，检测其催化反应，结果如图3所示。

图3结果显示，在仅仅只固相化一个酶的情况下，SUMO化反应能够较为正常的进行，但当固相化三者当中的两者或者三者全部固相化的时候，SUMO化的反应已经十分微弱，甚至根本不能被检测。

根据上述结果，实际的酶催化反应远比想象的复杂，可能存在更多的空间结构位点变化，固相化之后的酶难以在空间结构上相互接近来完成反应。因此，需要对其固相化过程进行优化改进，以便于获得能催化SUMO化反应较为正常的进行的固相化系统。

7.4、优化的固相化双酶和固相化三酶体系制备

将酶pChBD-SAEI和pChBD-SAEII同时进行固相化，具体方法与实施例4中的方法基本相同，但进行双酶固相化时，将步骤(6)改为，在Beads内同时加入pChBD-SAEI和pChBD-SAEII的蛋白粗提物，从而获得优化的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII双酶固相化催化体系。

采用上述同样的方法，分别获得其他的优化的固相化双酶和固相化三酶催化体系。

7.5、优化的固相化双酶和固相化三酶的催化反应

将步骤7.4中获得的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII的固相化双酶与纯化好的非固相化的pChBD-Ubc9混合，进行催化反应，其中，加入的SAEI为500ng，SAEII为1ug，Ubc9为1.Sug，底物为带有Flag tag的Topl-11ug，SUMO 1ug。

同时，采用同样的条件，将步骤7.4中获得的其他固定化双酶与对应的纯化好的非固相化的酶混合，并进行催化反应。

采用同样的条件，使用步骤7.4中获得的固相化三酶催化体系进行催化。

上述催化反应结束后，采用步骤7.2中的方法，检测其催化反应，结果如图4所示。

上述结果显示，在同时固相化SAEI和SAEII，并加入流动相的Ubc9的情况下能够完成SUMO化的催化反应，并且在第二次和第三次的反应中仍然能够完成SUMO化的催化反应，结果如图5所示，但是采用其他的固定化双酶或固定化三酶反应体系，则无法完成SUMO化的催化反应。

根据上述结果，同时固相化SAEI和SAEII，并加入流动性的Ubc9，可用于SUMO化固相化酶催化反应，在一定程度上扩展了SUMO化固相化酶催化反应体系的应用。

综上所述，本发明提供了一种SUMO化固相化酶催化反应体系，用于高通量鉴定可SUMO化蛋白，或用于将可SUMO化蛋白SUMO化，以用于研究可SUMO化蛋白的功能；同时，本发明还提供了一种去SUMO化固相化酶催化反应体系，以获得与天然靶蛋白完全相同的重组蛋白质，从而满足结构生物学研究和医疗用途的蛋白质需要。通过一步化的结合和简单的洗脱过程，能够快速的获得大量的固相化蛋白，同时由于固相化酶本身不会随着反应液的洗脱而存在于反应之后的底物中，更利于后面相应的检测和反应。同时由于酶的催化反应本身的特性，在反应的过程中并不会被消耗，利用温和的反应条件可以使固相化酶的重复利用成为可能。因此，上述固相化酶催化反应体系具有很好的应用前景。即使用本发明提供的固相化SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将可SUMO化的蛋白进行SUMO化；使用本发明提供的固相化去SUMO化系统可在温和的反应条件下简便地将SUMO化的蛋白去SUMO化，同时，上述固相化系统还可重复利用。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种固相化SUMO化系统及固相化去SUMO化系统

<130>P5091017

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>346

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Val Glu Lys Glu Glu Ala Gly Gly Gly Ile Ser Glu Glu Glu Ala

1               5                   10                  15

Ala Gln Tyr Asp Arg Gln Ile Arg Leu Trp Gly Leu Glu Ala Gln Lys

            20                  25                  30

Arg Leu Arg Ala Ser Arg Val Leu Leu Val Gly Leu Lys Gly Leu Gly

        35                  40                  45

Ala Glu Ile Ala Lys Asn Leu Ile Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Thr

    50                  55                  60

Met Leu Asp His Glu Gln Val Thr Pro Glu Asp Pro Gly Ala Gln Phe

65                  70                  75                  80

Leu Ile Arg Thr Gly Ser Val Gly Arg Asn Arg Ala Glu Ala Ser Leu

                85                  90                  95

Glu Arg Ala Gln Asn Leu Asn Pro Met Val Asp Val Lys Val Asp Thr

            100                 105                 110

Glu Asp Ile Glu Lys Lys Pro Glu Ser Phe Phe Thr Gln Phe Asp Ala

        115                 120                 125

Val Cys Leu Thr Cys Cys Ser Arg Asp Val Ile Val Lys Val Asp Gln

    130                 135                 140

Ile Cys His Lys Asn Ser Ile Lys Phe Phe Thr Gly Asp Val Phe Gly

145                 150                 155                 160

Tyr His Gly Tyr Thr Phe Ala Asn Leu Gly Glu His Glu Phe Val Glu

                165                 170                 175

Glu Lys Thr Lys Val Ala Lys Val Ser Gln Gly Val Glu Asp Gly Pro

            180                 185                 190

Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu Asp Ser Ser Glu Thr Thr Met Val Lys

        195                 200                 205

Lys Lys Val Val Phe Cys Pro Val Lys Glu Ala Leu Glu Val Asp Trp

    210                 215                 220

Ser Ser Glu Lys Ala Lys Ala Ala Leu Lys Arg Thr Thr Ser Asp Tyr

225                 230                 235                 240

Phe Leu Leu Gln Val Leu Leu Lys Phe Arg Thr Asp Lys Gly Arg Asp

                245                 250                 255

Pro Ser Ser Asp Thr Tyr Glu Glu Asp Ser Glu Leu Leu Leu Gln Ile

            260                 265                 270

Arg Asn Asp Val Leu Asp Ser Leu Gly Ile Ser Pro Asp Leu Leu Pro

        275                 280                 285

Glu Asp Phe Val Arg Tyr Cys Phe Ser Glu Met Ala Pro Val Cys Ala

    290                 295                 300

Val Val Gly Gly Ile Leu Ala Gln Glu Ile Val Lys Ala Leu Ser Gln

305                 310                 315                 320

Arg Asp Pro Pro His Asn Asn Phe Phe Phe Phe Asp Gly Met Lys Gly

                325                 330                 335

Asn Gly Ile Val Glu Cys Leu Gly Pro Lys

            340                 345

<210>2

<211>640

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Leu Ser Arg Gly Leu Pro Arg Glu Leu Ala Glu Ala Val Ala

1               5                   10                  15

Gly Gly Arg Val Leu Val Val Gly Ala Gly Gly Ile Gly Cys Glu Leu

            20                  25                  30

Leu Lys Asn Leu Val Leu Thr Gly Phe Ser His Ile Asp Leu Ile Asp

        35                  40                  45

Leu Asp Thr Ile Asp Val Ser Asn Leu Asn Arg Gln Phe Leu Phe Gln

    50                  55                  60

Lys Lys His Val Gly Arg Ser Lys Ala Gln Val Ala Lys Glu Ser Val

65                  70                  75                  80

Leu Gln Phe Tyr Pro Lys Ala Asn Ile Val Ala Tyr His Asp Ser Ile

                85                  90                  95

Met Asn Pro Asp Tyr Asn Val Glu Phe Phe Arg Gln Phe Ile Leu Val

            100                 105                 110

Met Asn Ala Leu Asp Asn Arg Ala Ala Arg Asn His Val Asn Arg Met

        115                 120                 125

Cys Leu Ala Ala Asp Val Pro Leu Ile Glu Ser Gly Thr Ala Gly Tyr

    130                 135                 140

Leu Gly Gln Val Thr Thr Ile Lys Lys Gly Val Thr Glu Cys Tyr Glu

145                 150                 155                 160

Cys His Pro Lys Pro Thr Gln Arg Thr Phe Pro Gly Cys Thr Ile Arg

                165                 170                 175

Asn Thr Pro Ser Glu Pro Ile His Cys Ile Val Trp Ala Lys Tyr Leu

            180                 185                 190

Phe Asn Gln Leu Phe Gly Glu Glu Asp Ala Asp Gln Glu Val Ser Pro

       195                 200                 205

Asp Arg Ala Asp Pro Glu Ala Ala Trp Glu Pro Thr Glu Ala Glu Ala

    210                 215                 220

Arg Ala Arg Ala Ser Asn Glu Asp Gly Asp Ile Lys Arg Ile Ser Thr

225                 230                 235                 240

Lys Glu Trp Ala Lys Ser Thr Gly Tyr Asp Pro Val Lys Leu Phe Thr

                245                 250                 255

Lys Leu Phe Lys Asp Asp Ile Arg Tyr Leu Leu Thr Met Asp Lys Leu

            260                 265                 270

Trp Arg Lys Arg Lys Pro Pro Val Pro Leu Asp Trp Ala Glu Val Gln

        275                 280                 285

Ser Gln Gly Glu Glu Thr Asn Ala Ser Asp Gln Gln Asn Glu Pro Gln

    290                 295                 300

Leu Gly Leu Lys Asp Gln Gln Val Leu Asp Val Lys Ser Tyr Ala Arg

305                 310                 315                 320

Leu Phe Ser Lys Ser Ile Glu Thr Leu Arg Val His Leu Ala Glu Lys

                325                 330                 335

Gly Asp Gly Ala Glu Leu Ile Trp Asp Lys Asp Asp Pro Ser Ala Met

            340                 345                 350

Asp Phe Val Thr Ser Ala Ala Asn Leu Arg Met His Ile Phe Ser Met

        355                 360                 365

Asn Met Lys Ser Arg Phe Asp Ile Lys Ser Met Ala Gly Asn Ile Ile

    370                 375                 380

Pro Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Ile Ala Gly Leu Ile Val Leu

385                 390                 395                 400

Glu Gly Leu Lys Ile Leu Ser Gly Lys Ile Asp Gln Cys Arg Thr Ile

                405                 410                 415

Phe Leu Asn Lys Gln Pro Asn Pro Arg Lys Lys Leu Leu Val Pro Cys

            420                 425                 430

Ala Leu Asp Pro Pro Asn Pro Asn Cys Tyr Val Cys Ala Ser Lys Pro

        435                 440                 445

Glu Val Thr Val Arg Leu Asn Val His Lys Val Thr Val Leu Thr Leu

    450                 455                 460

Gln Asp Lys Ile Val Lys Glu Lys Phe Ala Met Val Ala Pro Asp Val

465                 470                 475                 480

Gln Ile Glu Asp Gly Lys Gly Thr Ile Leu Ile Ser Ser Glu Glu Gly

                485                 490                 495

Glu Thr Glu Ala Asn Asn His Lys Lys Leu Ser Glu Phe Gly Ile Arg

            500                 505                 510

Asn Gly Ser Arg Leu Gln Ala Asp Asp Phe Leu Gln Asp Tyr Thr Leu

        515                 520                 525

Leu Ile Asn Ile Leu His Ser Glu Asp Leu Gly Lys Asp Val Glu Phe

    530                 535                 540

Glu Val Val Gly Asp Ala Pro Glu Lys Val Gly Pro Lys Gln Ala Glu 

545                 550                 555                 560

Asp Ala Ala Lys Ser Ile Thr Asn Gly Ser Asp Asp Gly Ala Gln Pro

                565                 570                 575

Ser Thr Ser Thr Ala Gln Glu Gln Asp Asp Val Leu Ile Val Asp Ser

            580                 585                 590

Asp Glu Glu Asp Ser Ser Asn Asn Ala Asp Val Ser Glu Glu Glu Arg

        595                 600                 605

Ser Arg Lys Arg Lys Leu Asp Glu Lys Glu Asn Leu Ser Ala Lys Arg

    610                 615                 620

Ser Arg Ile Glu Gln Lys Glu Glu Leu Asp Asp Val Ile Ala Leu Asp

625                 630                 635                 640

<210>3

<211>158

<212>PRT

<213>人

<400>3

Met Ser Gly Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala Gln Glu Arg Lys Ala Trp

1               5                   10                  15

Arg Lys Asp His Pro Phe Gly Phe Val Ala Val Pro Thr Lys Asn Pro

            20                  25                  30

Asp Gly Thr Met Asn Leu Met Asn Trp Glu Cys Ala Ile Pro Gly Lys

        35                  40                  45

Lys Gly Thr Pro Trp Glu Gly Gly Leu Phe Lys Leu Arg Met Leu Phe

    50                  55                  60

Lys Asp Asp Tyr Pro Ser Ser Pro Pro Lys Cys Lys Phe Glu Pro Pro

65                  70                  75                  80

Leu Phe His Pro Asn Val Tyr Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu Ser Ile

                85                  90                  95

Leu Glu Glu Asp Lys Asp Trp Arg Pro Ala Ile Thr Ile Lys Gln Ile

            100                 105                 110

Leu Leu Gly Ile Gln Glu Leu Leu Asn Glu Pro Asn Ile Gln Asp Pro

        115                 120                 125

Ala Gln Ala Glu Ala Tyr Thr Ile Tyr Cys Gln Asn Arg Val Glu Tyr

    130                 135                 140

Glu Lys Arg Val Arg Ala Gln Ala Lys Lys Phe Ala Pro Ser

145                 150                 155

<210>4

<211>129

<212>PRT

<213>标签序列

<400>4

Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly

1               5                   10                  15

Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr

            20                  25                  30

Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr

        35                  40                  45

Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly

    50                  55                  60

Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala

65                  70                  75                  80

Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp

                85                  90                  95

Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp

            100                 105                 110

Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg

        115                 120                 125

Pro

<210>5

<211>219

<212>PRT

<213>酵母

<400>5

Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala

1               5                   10                  15

Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu

            20                  25                  30

Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn

        35                  40                  45

Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro

    50                  55                  60

Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg

65                  70                  75                  80

Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile

                85                  90                  95

Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser His

            100                 105                 110

Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val

        115                 120                 125

Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr

    130                 135                 140

Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly Glu

145                 150                 155                 160

Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr

                165                 170                 175

Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp

            180                 185                 190

Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe

        195                 200                 205

Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys

    210                 215

<210>6

<211>621

<212>PRT

<213>酵母

<400>6

Met Ser Val Glu Val Asp Lys His Arg Asn Thr Leu Gln Tyr His Lys

1               5                   10                  15

Lys Asn Pro Tyr Ser Pro Leu Phe Ser Pro Ile Ser Thr Tyr Arg Cys

            20                  25                  30

Tyr Pro Arg Val Leu Asn Asn Pro Ser Glu Ser Arg Arg Ser Ala Ser

        35                  40                  45

Phe Ser Gly Ile Tyr Lys Lys Arg Thr Asn Thr Ser Arg Phe Asn Tyr

    50                  55                  60

Leu Asn Asp Arg Arg Val Leu Ser Met Glu Glu Ser Met Lys Asp Gly

65                  70                  75                  80

Ser Asp Arg Ala Ser Lys Ala Gly Phe Ile Gly Gly Ile Arg Glu Thr

                85                  90                  95

Leu Trp Asn Ser Gly Lys Tyr Leu Trp His Thr Phe Val Lys Asn Glu

            100                 105                 110

Pro Arg Asn Phe Asp Gly Ser Glu Val Glu Ala Ser Gly Asn Ser Asp

        115                 120                 125

Val Glu Ser Arg Ser Ser Gly Ser Arg Ser Ser Asp Val Pro Tyr Gly

    130                 135                 140

Leu Arg Glu Asn Tyr Ser Ser Asp Thr Arg Lys His Lys Phe Asp Thr

145                 150                 155                 160

Ser Thr Trp Ala Leu Pro Asn Lys Arg Arg Arg Ile Glu Ser Glu Gly

                165                 170                 175

Val Gly Thr Pro Ser Thr Ser Pro Ile Ser Ser Leu Ala Ser Gln Lys

            180                 185                 190

Ser Asn Cys Asp Ser Asp Asn Ser Ile Thr Phe Ser Arg Asp Pro Phe

        195                 200                 205

Gly Trp Asn Lys Trp Lys Thr Ser Ala Ile Gly Ser Asn Ser Glu Asn

    210                 215                 220

Asn Thr Ser Asp Gln Lys Asn Ser Tyr Asp Arg Arg Gln Tyr Gly Thr

225                 230                 235                 240

Ala Phe Ile Arg Lys Lys Lys Val Ala Lys Gln Asn Ile Asn Asn Thr

                245                 250                 255

Lys Leu Val Ser Arg Ala Gln Ser Glu Glu Val Thr Tyr Leu Arg Gln

            260                 265                 270

Ile Phe Asn Gly Glu Tyr Lys Val Pro Lys Ile Leu Lys Glu Glu Arg

        275                 280                 285

Glu Arg Gln Leu Lys Leu Met Asp Met Asp Lys Glu Lys Asp Thr Gly

    290                 295                 300

Leu Lys Lys Ser Ile Ile Asp Leu Thr Glu Lys Ile Lys Thr Ile Leu

305                 310                 315                 320

Ile Glu Asn Asn Lys Asn Arg Leu Gln Thr Arg Asn Glu Asn Asp Asp

                325                 330                 335

Asp Leu Val Phe Val Lys Glu Lys Lys Ile Ser Ser Leu Glu Arg Lys

            340                 345                 350

His Lys Asp Tyr Leu Asn Gln Lys Leu Lys Phe Asp Arg Ser Ile Leu

        355                 360                 365

Glu Phe Glu Lys Asp Phe Lys Arg Tyr Asn Glu Ile Leu Asn Glu Arg

    370                 375                 380

Lys Lys Ile Gln Glu Asp Leu Lys Lys Lys Lys Glu Gln Leu Ala Lys

385                 390                 395                 400

Lys Lys Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln

                405                 410                 415

Lys Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn

            420                 425                 430

Ile Glu Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp

        435                 440                 445

Leu Asn Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser

    450                 455                 460

Thr Pro Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser

465                 470                 475                 480

Glu Arg Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr

                485                 490                 495

Gln Ile Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln

            500                 505                 510

Ser His Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly

        515                 520                 525

Tyr Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile

    530                 535                 540

Leu Thr Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile

545                 550                 555                 560

Gly Glu Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn

                565                 570                 575

Gly Tyr Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser

            580                 585                 590

Ala Asp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg

        595                 600                 605

Arg Phe Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys

    610                 615                 620

Claims (20)

1.一种固相化SUMO化系统，其特征在于，所述固相化SUMO化系统为：

固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9的SUMO化系统；或

固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系统；

其中，所述SUMO化系统包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO转移酶Ubc9。

2.如权利要求1所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEI的序列选自：

(a)SEQ ID NO：1；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO激活酶SAEI活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

3.如权利要求1所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEII的序列选自：

(i)SEQ ID NO：2；或

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO激活酶SAEII活性的由(i)衍生的蛋白质或多肽。

4.如权利要求1所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO转移酶Ubc9的序列选自：

(I)SEQ ID NO：3；或

(II)在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO转移酶Ubc9活性的由(I)衍生的蛋白质或多肽。

5.如权利要求1所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9的固相化为通过亲和标签的连接将所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9吸附在与亲和标签有亲和结合作用的介质上。

6.如权利要求5所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述亲和标签选自但不仅限于以下标签：Chitin binding domain(ChBD)，AviTag，Glutathione-S-Transferase(GST)，His6hexapeptide，calmodulin binding protein(CBP)，protein C tag，hemagglutinin(HA)tag，a FLAG tag和Myc tag。

7.如权利要求5所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9的固相化为通过ChBD序列的连接将所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9吸附在二乙氨乙基纤维素上。

8.如权利要求7所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述ChBD序列选自：

(1)SEQ ID NO：4；或

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。

9.如权利要求7所述的固相化SUMO化系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A)分别制备蛋白pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9；

B)将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9分别与二乙氨乙基纤维素充分混合，或将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9分别两两混合，再与二乙氨乙基纤维素充分混合，或将步骤A中制备好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO转移酶Ubc9与二乙氨乙基纤维素共同充分混合，以获得固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO转移酶Ubc9。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤B后还包括高盐洗脱以去除杂蛋白的步骤。

11.如权利要求1或5所述的固相化SUMO化系统的应用，其特征在于，所述应用为用于高通量鉴定可SUMO化蛋白，或用于将可SUMO化蛋白SUMO化以用于研究所述蛋白的功能。

12.一种固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述固相化去SUMO化系统包括固相化的SUMO水解酶。

13.如权利要求12所述的固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO水解酶的序列选自：

(1)SEQ ID NO：5；或SEQ ID NO：6；或

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。

14.如权利要求12所述的固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化为通过亲和标签的连接将所述SUMO水解酶吸附在与亲和标签有亲和结合作用的介质上。

15.如权利要求14所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述亲和标签选自但不仅限于以下标签：Chitin binding domain(ChBD)，AviTag，Glutathione-S-Transferase (GST)，His6hexapeptide，calmodulin binding protein(CBP)，protein C tag，hemagglutinin(HA)tag，a FLAG tag和Myc tag。

16.如权利要求14所述的固相化去SUMO化系统，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化为通过ChBD序列的连接将所述SUMO水解酶吸附在二乙氨乙基纤维素上。

17.如权利要求16所述的固相化SUMO化系统，其特征在于，所述ChBD序列选自：

(1)SEQ ID NO：4；或

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白质或多肽。

18.如权利要求16所述的固相化去SUMO化系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A)制备蛋白pChBD-SUMO水解酶；

B)将步骤A中制备好的pChBD-SUMO水解酶与二乙氨乙基纤维素充分混合，以获得固相化去SUMO化系统。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在步骤B后还包括高盐洗脱以去除杂蛋白的步骤。

20.如权利要求12或14所述的固相化去SUMO化系统的应用，其特征在于，所述应用为在体外将SUMO化蛋白去SUMO化，以获得与天然靶蛋白序列完全相同的重组蛋白质。

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