CN101879326A - 含镁磷灰石骨水泥及其组合物和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含镁磷灰石骨水泥及其组合物和制备方法。本发明的含镁磷灰石骨水泥组合物含有磷酸钙骨水泥组合物和含镁羟基磷灰石骨水泥组合物；含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含有摩尔比为7∶3的氧化镁和一水磷酸二氢钙。含镁磷灰石骨水泥含有羟基磷灰石和镁替代羟基磷灰石，其中，镁替代羟基磷灰石的含量为15％～50％。含镁磷灰石骨水泥的制备方法为将含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液去离子水均匀混合即可，其中所述含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液的液固比为0.2mL/g～0.65mL/g。本发明的含镁磷灰石骨水泥组合物能够快速固化、机械强度高、生物相容性好且降解性能优良。

Description

含镁磷灰石骨水泥及其组合物和制备方法

技术领域

本发明涉及骨缺损修复领域，具体涉及一种含镁磷灰石骨水泥及其组合物和制备方法。

背景技术

美国的Brown及Chow于上世纪80年代中期在美国牙医学会设于美国国家标准和科技学院的研究室发现了磷酸钙的水化硬化特性，并由此制成了磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement，CPC)。磷酸钙骨水泥是由固相和液相两部分组成的复合体系，将固相粉末与液相溶液按照一定比例调和，所形成的水泥浆体可根据骨缺损部位任意塑型并在人体生理环境下自行固化，其固化产物的化学成份通常为羟基磷灰石(HA)或者缺钙羟基磷灰石(CDHA)，与人体骨组织的无机成份相似，具有良好的生物相容性和骨传导性。作为一种新型的骨缺损修复材料，CPC受到了国内外众多学者的广泛关注，成为全球材料界和医学界瞩目的热点之一。然而，通过多年的临床实验发现，CPC虽然具有良好的生物相容性，可在生理环境条件下自行固化、任意塑形，是一类已经在临床上应用很广泛的骨修复材料，但是目前临床应用的CPC磷酸钙骨水泥固化体的孔径小、孔隙率低，因而在植入体内后过于稳定而很难被人体组织吸收降解，植入的材料长期在人体内存在，阻碍了新骨组织的生长，为此很多科学家都在努力寻求一种与CPC在生物相容性方面相媲美，又具有可控的降解性能的新型骨水泥。

磷酸镁骨水泥(Magnesium Phosphate Cement)是一类无机反应型胶粘剂，磷酸镁水泥最早于1945年用作建筑用水泥，之后Brookhaven实验室开发了磷酸镁铵胶凝材料作为快速修补水泥材料。与CPC材料有类似的性能的是，磷酸镁铵也能在人体的生理环境下自行固化，水化产物为磷酸镁铵类的生物矿石，生物相容性好。目前对于磷酸镁铵的研究，国内外都集中在建筑材料方面，而其作为生物材料的研究，本发明人课题组率先成功地开发出了无机磷酸镁骨粘固剂并其应用于骨修复材料领域，国内除本发明人单位外未见报导，国外仅有的零星报导，主要限于用做牙齿水泥。本发明人课题组的早期研究结果表明，磷酸镁骨水泥(Magnesium Phosphate Cement，MPC)具有快速凝结、胶粘性好及早期强度高等特性，固化时体积微膨胀，使其能与植入部位更牢固的镶嵌结合在一起；体外降解实验表明磷酸镁骨水泥具有良好的细胞相容性和降解性；进一步的动物体内实验结果显示，磷酸镁骨水泥具有良好的生物相容性，可用于骨修复领域。

但是，经过进一步深入研究发现：磷酸镁铵作为骨水泥材料植入体内后会引入铵盐，在生物环境下可能会降解释放出氨气，对细胞具有一定的毒性作用，材料的生物相容性受到了一定的影响。因此，在骨修复材料领域，制备一种生物相容性好、降解性能优良、无细胞毒性的含镁骨水泥材料是本领域技术人员亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了现有的磷酸钙骨水泥植入人体后过于稳定很难被人体组织吸收降解，或者现有的磷酸镁骨水泥在生物环境下可能会降解释放出氨气，对细胞具有一定的毒性作用的缺陷，提供了快速固化、机械强度高、生物相容性好、降解性能优良的含镁磷灰石骨水泥及其组合物和制备方法。

本发明涉及一种含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其含有氧化镁和一水磷酸二氢钙，所述的氧化镁和一水磷酸二氢钙的摩尔比为7∶3。

本发明中，所述的氧化镁较佳的由下述方法制得：将碱式碳酸镁(Mg(OH)₂·4MgCO₃·5H₂O)在1500℃重烧6小时即可。

本发明中，所述的一水磷酸二氢钙可由本领域常规方法制得。其中，所述的一水磷酸二氢钙是指磷酸二氢钙的一水合物(Ca(H₂PO₄)₂·H₂O)。

本发明中，所述的氧化镁和一水磷酸二氢钙的粒径大小较佳的为5～20微米。

本发明的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物可按照本领域常规制备方法，将上述各成分简单均匀混合，即可。

本发明还涉及一种含镁磷灰石骨水泥组合物，其含有磷酸钙骨水泥组合物和本发明的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其中，所述的磷酸钙骨水泥组合物为含有摩尔比为1∶1的磷酸四钙和无水磷酸氢钙。

本发明中，所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含量较佳的为15％～50％，百分比为含镁羟基磷灰石骨水泥组合物占含镁磷灰石骨水泥组合物总量的质量百分比。所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物一般在将含镁羟基磷灰石骨水泥组合物用球磨机共混后，再过200目筛再使用。其中，所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含量较佳的为50％，百分比为含镁羟基磷灰石骨水泥组合物占含镁磷灰石骨水泥组合物总量的质量百分比。

本发明中，所述的磷酸四钙和无水磷酸氢钙的粒径大小较佳的为5～20微米。

本发明中，所述的无水磷酸氢钙较佳的由下述方法制得：将Ca(NO₃)₂溶液和(NH₄)₂HPO₄溶液在酸性条件下通过液相沉淀生成二水磷酸氢钙(DCPD)，DCPD粉末在120℃下处理10小时后得无水磷酸氢钙(DCPA)。

本发明的含镁磷灰石骨水泥组合物可按照本领域常规制备方法，将上述各成分简单均匀混合，即可。

本发明还涉及一种含镁磷灰石骨水泥，其含有羟基磷灰石和镁替代羟基磷灰石，其中，镁替代羟基磷灰石的含量为15％～50％，百分比为镁替代羟基磷灰石占含镁磷灰石骨水泥总量的质量百分比。

本发明还提供了一种本发明的含镁磷灰石骨水泥的制备方法，其将本发明所述的含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液去离子水均匀混合即可，其中所述含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液的液固比为0.2mL/g～0.65mL/g，较佳的为0.45mL/g。

其中，含镁羟基磷灰石骨水泥组合物水化反应生成镁替代羟基磷灰石，其水化可用如下的反应方程式表示：7MgO+3Ca(H₂PO₄)₂-----(Mg₇Ca₃)(PO₄)₆(OH)₂；而磷酸钙骨水泥组合物的水化反应为2Ca₄(PO₄)₂O+2CaHPO₄-----Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂；因此，本发明的含镁磷灰石骨水泥组合物的最终产物是(Mg₇Ca₃)(PO₄)₆(OH)₂和Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂的混合物。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征的优选条件可以任意组合得到较佳实例。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了含镁磷灰石骨水泥及其组合物和制备方法。该含镁磷灰石骨水泥组合物作为骨组织修复材料可快速固化，固化后的组织机械强度高且生物相容性好，具有良好的降解性能。

附图说明

图1为实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物和对比例1骨水泥组合物在固化7天后的粉末XRD衍射图谱。

图2为实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物固化7天后的FT-IR图谱。

图3为实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物固化7天后的断面形貌SEM照片；其中，a、b、c、d四图依次为放大2500倍、5000倍、10000倍和30000倍的照片。

图4为实施例1～3及对比例1骨水泥组合物在Tris-HCl溶液中的失重情况图。

图5为实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物在Tris-HCl溶液浸泡60天后的微观形貌的SEM照片；其中，a图为放大1000倍，b图为放大5000倍。

图6为实施例3和对比例1的骨水泥组合物对细胞增殖影响关系图。

图7为实施例3和对比例1的骨水泥组合物对细胞分化的影响关系图。

图8为细胞在实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物材料表面粘附的SEM照片；其中，(a)是未培养细胞样品，(b)细胞培养1天样品，(c，d)细胞培养3天样品，c图为放大100倍，d图为放大1500倍。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1～3和对比例1

按下表1中的配方制备实施例1～3(简写为M-CPC)和对比例1的骨水泥组合物，其制备方法为：将含镁羟基磷灰石骨水泥组合物和磷酸钙骨水泥组合物按表1中的配方均匀混合，即可。

其中，所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含有摩尔比为7∶3的氧化镁与一水磷酸二氢钙，经球磨机共混后，再过200目筛再使用。其中，所述的氧化镁由下述方法制得：将碱式碳酸镁(Mg(OH)₂·4MgCO₃·5H₂O)在1500℃重烧6小时即可。

其中，所述的磷酸钙骨水泥组合物含有摩尔比为1∶1的磷酸四钙和无水磷酸氢钙。无水磷酸氢钙由下述方法制得：将Ca(NO₃)₂溶液和(NH₄)₂HPO₄溶液在酸性条件下通过液相沉淀生成二水磷酸氢钙(DCPD)，DCPD粉末在120℃下处理10小时后得无水磷酸氢钙(DCPA)。

表1

编号	含镁羟基磷灰石骨水泥组合物(Mg-HA)	磷酸钙骨水泥组合物(CPC)
			实施例1	15wt.％	85wt.％

编号	含镁羟基磷灰石骨水泥组合物(Mg-HA)	磷酸钙骨水泥组合物(CPC)
			实施例2	30wt.％	70wt.％
实施例3	50wt.％	50wt.％
			对比例1	0	100wt.％

实施例4～6

配制含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其制备方法为：将摩尔比为7∶3的氧化镁与磷酸二氢钙均匀混合，即可。

其中，所述的氧化镁由下述方法制得：将碱式碳酸镁(Mg(OH)₂·4MgCO₃·5H₂O)在1500℃重烧6小时即可。

其中，所述的氧化镁和一水磷酸二氢钙的粒径大小按照实施例4～6编号依次为5μm、10μm和20μm。

实施例7～9

含镁磷灰石骨水泥的制备：取实施例1～3所述的含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液去离子水均匀混合固化即可。

其中，所述含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液的液固比按照实施例7～9编号依次为0.2mL/g、0.45mL/g和0.65mL/g。其中，镁替代羟基磷灰石的含量按照实施例7～9编号依次为15％、30％和50％，百分比为镁替代羟基磷灰石占含镁磷灰石骨水泥总量的质量百分比。

效果实施例1凝结时间和抗压强度的测定

1、凝结时间和抗压强度的测定

凝结时间测试方法如下：

采用水泥稠度及凝结时间测定仪(即维卡仪)测试水泥浆体的凝结时间。将实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液去离子水按一定比例均匀混合，把调和好的水泥浆体填入到高10mm，直径6mm的小塑料管中填实，两端抹平，将样品置于37℃，100％湿度环境中固化。

固化一定时间后，将样品取出测定，测定时，在金属圆棒下端装上直径1.1mm的试针，滑动部分总重量为300±2克。测定时，将样品置于底板上，使试针与浆体表面刚好接触，突然松开松紧螺丝，试针自由沉入浆体，观察指针指示数值。从加入固化液时起，到试针沉入浆体不超过1mm所需的时间为凝结时间，每组数据由3个平行实验得到。

抗压强度的测试方法如下：

将实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液去离子水按一定比例混合均匀，把调和好的水泥浆体填入到高10mm，直径6mm的聚四氟乙烯模具中，用2kg的重物压实。

待样条成形后，取出样条，放入37℃，100％湿度环境中固化一定时间，将两端用细砂纸磨至水平，然后用材料力学性能万能实验机测量固化体的抗压强度，施加载荷速度为1mm/min，最大压力2000N，每组数据由3个平行实验得到。

结果如下表2所示：

表2不同液固比与含镁磷灰石骨水泥组合物的抗压强度(48h)和凝结时间的关系

不同液固比	凝结时间(min)	抗压强度(MPa)
			0.2	2.16±0.5	28±4.8
0.3	3.14±0.3	45±2.0
			0.45	6±0.2	72±2.3
0.5	8.53±0.4	49±4.8
			0.65	16±2	27±2.5

由上表数据可知，本发明实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物在使用时的液固比对含镁磷灰石骨水泥组合物的凝结时间和抗压强度有着重要的影响：凝结时间随着液固比的增加而延长，但是抗压强度却随着液固比的增加先增加而后减小。分析原因：在于体系中液体含量增加时，反应物颗粒之间的距离增大，导致了反应速率降低，同时由于反应物颗粒之间有水的存在，会使得固化后的样品存在比较高的孔隙率，这样会导致体系固化后的强度急剧降低；而当液固比太小于时，体系由于太干而无法调和成均匀的浆体，体系中残留有较高的孔隙率，强度比较低。综合考虑含镁磷灰石骨水泥组合物的各个性能参数，在液固比为0.45mL/g时能达到最佳效果。

2、最佳液固比下凝结时间和抗压强度的测定

将实施例1～3和对比例1的骨水泥组合物与固化液去离子水按最佳液固比0.45mL/g混合均匀，把调和好的水泥浆体填入到高10mm，直径6mm的聚四氟乙烯模具中，用2kg标准重量的铁块压平，并尽可能赶走气泡。待样条初凝后，缓慢取出，放入37℃，100％的湿度环境中，测定方法同前述，结果如下表3所示。

表3

编号	凝结时间(min)	抗压强度(MPa)
			实施例1	9±0.3	49±2.6
实施例2	7±0.2	63±1.8
			实施例3	6±0.2	72±2.3
对比例1	12±0.4	38±2.0

由上述数据结果表明，本发明的含镁磷灰石骨水泥组合物随着含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含量的增大，骨水泥组合物体系的凝结时间逐渐减小，均短于现有的磷酸钙骨水泥组合物的凝结时间，特别当含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含量为50％时，骨水泥组合物体系的凝结时间为6分钟。

进一步地，试验还考察了实施例3和对比例1的骨水泥组合物在不同固化时间对抗压强度的影响，测定方法同实施例1，结果如下表4所示。

表4固化时间对实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物抗压强度的影响

抗压强度是衡量骨水泥组合物硬化后的抗负载能力的指标，是骨水泥组合物临床应用的关键性指标，较高的抗压强度能扩大材料的应用范围。上述数据结果显示的实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物体系的早期强度很高，1小时达到51MPa，最后抗压强度平稳上升达，2天后达到72MPa。而对比例1的骨水泥组合物在固化1小时后的抗压强度只有13MPa，2天后其强度达到38MPa，在相同时间内对比例1体系的抗压强度较实施例3低。

分析上述凝结时间与抗压强度效果的原因，本发明人早期研究表明，磷酸镁水泥体系的初凝时间不足10分钟，终凝时间不超过15分钟，与波特兰水泥类似，磷酸镁水泥的凝结时间也随着固液比的增大而缩短；而本发明含镁磷灰石骨水泥组合物中的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物体系，高活性MgO对体系的反应起到了加速作用，在磷酸钙骨水泥组合物与含镁羟基磷灰石骨水泥组合物混合后的体系中的水化反应是一个溶胶-凝胶过程，浆体内的水化产物相互连接生成，形成了结晶粘接网结构，进而形成结晶致密的微区，这些微区能够起到颗粒增强的作用，从而使体系的力学性能要高于单纯的磷酸钙骨水泥组合物固化体，因此，骨水泥组合物体系的凝结时间缩短，强度增加。

效果实施例2X射线衍射和红外分析

1、X射线衍射分析

将实施例3制得的含镁磷灰石骨水泥组合物固化产物采用粉末X射线衍射(XRD)分析和薄膜X射线衍射掠角分析，将骨水泥组合物样品制备成厚度约为2mm的片状材料，然后置于80℃恒温干燥箱内干燥。将样品直接放入样品室中，使用转靶X射线多晶衍射仪进行掠角分析，掠射角1°，分析角度2θ为5-70°。

实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物固化7天固化产物的粉末XRD衍射图谱见图1，可以看出，图中各峰的位置和PDF：03-0690的标准卡片(羟基磷灰石)很相似。这是因为实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物固化产物的成份是镁替代羟基磷灰石和羟基磷灰石的混合物，所以固化反应的最终产物的XRD显示材料是磷灰石结构。

然而，与现有技术中磷酸钙骨水泥组合物固化产物(对比例1)的XRD图谱相比，含镁羟基磷灰石结构的吸收峰不是很尖锐，这说明镁替代了羟基磷灰石中部分的钙，从而使得材料在XRD粉末衍射图谱中表现为较为宽的吸收峰。

由于均为具有磷灰石结构，所以本发明含镁磷灰石骨水泥组合物与现有技术中的磷酸骨水泥组合物的XRD很相似，图上的各个峰是重叠的，其特征峰分别在23°，24°，25.5°，26°，29°，30°，32°，32.5°和34°的位置上，整个XRD显示的是磷灰石物相。

2、红外分析

将实施例3制得的含镁磷灰石骨水泥组合物固化7天后置于80℃干燥箱内干燥，将样品粉末与溴化钾(KBr)粉末混合均匀并研细，用压片机制成薄片，用傅里叶红外光谱仪进行分析。

结果如图2所示；可以看出，在3571cm^-1和在601cm^-1的吸收峰是羟基的吸收峰，3450cm^-1宽吸收峰是水的吸收峰，在5650cm^-1和1037cm^-1的吸收峰是PO₄ ^3-的伸缩振动吸收峰，1645cm^-1是碳酸根的吸收峰，分析认为碳酸根是因为本发明含镁磷灰石骨水泥组合物在固化过程中，少量空气中的二氧化碳进入体系代替部分PO₄ ^3-所至的。IR的分析结果基本上和XRD分析结果一致。

效果实施例3本发明含镁磷灰石骨水泥组合物的微观结构分析

将实施例3制得的含镁磷灰石骨水泥组合物固化7天产物干燥后样品断裂，用导电胶胶布粘在铜质样品台上，在真空条件下，用喷金仪对样品断面喷金，用SEM观察样品断面形貌。结果如图3所示：可以看出，实施例3制得的含镁磷灰石骨水泥组合物固化产物主要由大小不一的磷灰石晶体组成，在放大到三万倍的时结果显示，大颗粒的磷灰石晶体是由小颗粒的磷灰石颗粒团聚而成的，这些小的磷灰石呈现纳米棒状结构，直径在300nm左右。

效果实施例4材料降解性能研究

实验考察本发明含镁磷灰石骨水泥组合物样品在溶液中浸泡后的质量损失率与浸泡时间的关系表征材料的降解性能。按照下面的公式计算试样的失重率：失重率(％)＝(W₀-W_t)/W₀×100％。

降解液的制备和降解实验方法如下：

0.05M的Tris-HCl缓冲溶液是被生物材料一陶瓷类降解实验推荐使用的介质之一(ISO10993-14，医疗器械的生物学评价第十四部分：陶瓷降解产物的识别和量化)。具体的制备方法是：将三羟甲基氨基甲烷配制成浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，然后用1mol/L的HCl溶液将三羟甲基氨基甲烷溶液调节pH值到7.4，并放在4℃冰箱内保存。将降解实验样品(5×5×2mm)与Tris-HCl溶液按照0.15g/20mL的比例放入聚乙烯瓶中，在37℃的恒温振荡箱内以60r/min的速度振荡，并且每周更换一次新鲜降解液。在一定的时间里取出样品，在100℃的真空干燥箱内干燥至恒重，称量并记录最后的重量。

降解性能是通过观察样品在溶液中浸泡后的质量损失率与浸泡时间的关系表征的，按照下面的公式计算试样的失重率：失重率(％)＝(W₀-Wt)/W₀×100％。每组数据由3个平行实验得到。经过一定时间后取出样品，烘干后，用SEM观察样品表面形貌。

将骨水泥组合物固化7天样品浸泡在Tris-HCl缓冲溶液中，置于37℃，转速100r/min的恒温振荡箱中振荡，分别在浸泡不同时间后，用等离子体发射光谱仪测定Tris-HCl浸泡液中的Ca、P、Mg离子浓度，用pH计测量溶液的pH值。

1、在Tris-HCl溶液中的失重分析

如图4所示，实施例1～3(图中依次记为M₁₅-CPC、M₃₀-CPC和M₅₀-CPC)及对比例1(图中记为CPC)骨水泥组合物固化7天样品在Tris-HCl溶液中的失重情况，由图可见，随着浸泡时间的增加，各种材料的失重率逐渐增大，各种材料的降解速度随着Mg-HA在CPC中的含量增高而增大。对比例1的CPC在Tris-HCl溶液中浸泡84天后，材料失重率仅有8.3wt％，而实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物在溶液中浸泡84天后，材料降解失重率达到了58％；结果表明，与现有技术的CPC相比，本发明中不同含量的Mg-HA可以明显地提高骨水泥组合物的降解性。

2、骨水泥组合物材料在溶液中浸泡后表面微观形貌观察

图5为实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物材料在Tris-HCl溶液浸泡60天后的形貌和微观结构。结果表明，骨水泥组合物材料降解明显，表面形成了许多微孔，本发明人分析原因：由于镁替代羟基磷灰石的溶解度大于羟基磷灰石，镁替代羟基磷灰石首先溶解，留下许多微孔，提高了材料与液体接触的表面积，加快了微孔羟基磷灰石的溶解，从而导致了整个材料的溶解性提高。从SEM照片可以看出，经过在降解液中浸泡60天后的样品，材料整体形貌表现为松散，有裂纹和孔隙，这些结果表明，本发明含镁磷灰石骨水泥组合物的降解性能明显比CPC高。

效果实施例5细胞生物相容性实验

将实施例3制得的含镁磷灰石骨水泥组合物粉末与固化液去离子水共混调匀后，把调和好的泥浆体填入到金属模具中，在压片机上加压2MPa，并保压1分钟，脱模获得表面平整的圆盘形(Ф12×2mm)样品；同样的方法制备对比例1的CPC作为对照样品。

将实施例3制得的样品在清水中浸泡24小时后，用无水乙醇超声清洗，后在120℃下高温高压消毒30分钟备用。在无菌条件下，将样品放于24孔板底部，加入MG₆₃细胞悬液(1×10⁴个/孔)，以10％的小牛血清为培基，将样品置于37℃，100％湿度，5％CO₂的恒温箱中培养，每两天换一次培养基；细胞培养实验方法如下：

将MG₆₃(2×10³个/孔)细胞接种在样品(Ф12×2mm)表面，在37℃，100％湿度，5％CO₂的恒温箱中培养。培养一定时间后，用扫描电镜(SEM)观察细胞在材料表面的粘附铺展情况。在每个时间点，样品取出后用PBS冲洗，经2.5％戊二醛固定30分钟，固定后的细胞用(30，50，70，90，95，100(v/v))乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯浸泡，干燥喷金后，用SEM观察细胞在样品表面的形貌及粘附和铺展情况。

把实验样品转移至一个新的组织培养板中，用PBS清洗2～3次，然后每孔加入200μL NP-40；孵育1小时，得细胞裂解液；吸取50μL细胞裂解液至24孔组织培养板中，然后每孔再加入50μLp NPP，继续孵育1小时；测吸光度(即为OD值，405nm)，吸光度值的大小可以准确地反映材料表面的培养细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，实验结果表示为每小时内每μg蛋白催化底物所测得的OD值(光密度)。

1、材料对细胞增殖的影响

MG₆₃细胞在实施例3和对比例1的骨水泥组合物表面的增殖情况见图6，结果显示，培养1天后，MG₆₃细胞在M₅₀-CPC和CPC的OD值没有明显的差异；细胞培养3和7天后，实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物材料的OD值明显高于对比例1，表明实施例3含镁磷灰石骨水泥组合物材料能够促进细胞增殖和生长，这说明材料具有很好的生物相容性。进一步分析其原因在于：实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物材料在SBF溶液能够释放出Mg和Ca离子，而对比例1的骨水泥组合物材料在这个过程中没有Mg离子放出，因而当细胞培养到3天后，实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物材料所释放出来的Mg和Ca离子为细胞提供了更好的化学环境，促进了细胞的增殖和生长。

2、材料对细胞分化的影响

成骨细胞分泌碱性磷酸酶，代表着细胞分化。如图7所示MG₆₃细胞在实施例3骨水泥组合物材料表面培养7天后的ALP活性，结果表明，培养7天后，MG₆₃在材料表面的ALP活性明显比对比例1要高，因此，本发明材料能够明显地促进细胞分化，具有良好的生物相容性。

材料的生物相容性和生物活性与细胞在材料表面的粘附和铺展情况有直接关联。图8显示MG₆₃细胞在实施例3骨水泥组合物材料表面粘附的SEM照片。如图可见，培养1天后，细胞在材料表面均匀粘附，但增殖并不明显；培养3天后，材料表面均被铺展细胞所覆盖，细胞铺展明显，呈典型的骨细胞形态，多触角，突触伸展明显，由此可见，实施例3骨水泥组合物材料对细胞粘附和形态没有负面影响，该材料具有很好的细胞生物相容性。

细胞在生物相容性材料表面的反应包括粘附、增殖和分化过程。这些不但和材料表面的物理性质有关，而且和材料的化学性质密切相关。本发明的骨水泥组合物材料在SBF缓冲溶液里，Ca和Mg离子都能从浸泡材料中释放出来，上述结果表明，和对比例1材料相比，实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物材料能够明显刺激MG₆₃细胞在材料表面的增殖；同时。ALP活性测试也表明，实施例3的含镁磷灰石骨水泥组合物材料更能够刺激细胞分化，因此，本发明的含镁磷灰石骨组织材料对细胞在材料表面的粘附和铺展起着一定促进作用。

Claims (10)

1.一种含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其含有氧化镁和一水磷酸二氢钙，所述的氧化镁和一水磷酸二氢钙的摩尔比为7∶3。

2.如权利要求1所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其特征在于：所述的氧化镁由下述方法制得：将碱式碳酸镁在1500℃重烧6小时即可。

3.如权利要求1所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其特征在于：所述的氧化镁和一水磷酸二氢钙的粒径大小为5～20微米。

4.一种含镁磷灰石骨水泥组合物，其含有磷酸钙骨水泥组合物和如权利要求1～3任一项所述含镁羟基磷灰石骨水泥组合物，其中，所述的磷酸钙骨水泥组合物为含有摩尔比为1∶1的磷酸四钙和无水磷酸氢钙。

5.如权利要求4所述的含镁磷灰石骨水泥组合物，其特征在于：所述的含镁羟基磷灰石骨水泥组合物含量为15％～50％，百分比为含镁羟基磷灰石骨水泥组合物占含镁磷灰石骨水泥组合物总量的质量百分比。

6.如权利要求4所述的含镁磷灰石骨水泥组合物，其特征在于：所述的磷酸四钙和无水磷酸氢钙的粒径大小为5～20微米。

7.如权利要求4～6任一项所述的含镁磷灰石骨水泥组合物，其特征在于：所述的无水磷酸氢钙由下述方法制得：将硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液在酸性条件下通过液相沉淀生成二水磷酸氢钙，二水磷酸氢钙在120℃下处理10小时后即得无水磷酸氢钙。

8.一种含镁磷灰石骨水泥，其含有羟基磷灰石和镁替代羟基磷灰石，其中，镁替代羟基磷灰石的含量为15％～50％，百分比为镁替代羟基磷灰石占含镁磷灰石骨水泥总量的质量百分比。

9.一种如权利要求8所述的含镁磷灰石骨水泥的制备方法，其特征在于：将如权利要求4～7任一项所述的含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液去离子水均匀混合即可，其中所述含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液的液固比为0.2mL/g～0.65mL/g。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述含镁磷灰石骨水泥组合物与固化液的液固比为0.45mL/g。

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