CN101879160A - 3-取代芳基氧化吲哚在多药耐药肿瘤细胞方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及3-取代芳基氧化吲哚在多药耐药肿瘤细胞方面的应用，具体地是化合物PH II-7对于K562/A02、HL60/ADR、MCF-7/ADR、KBV200，A549DDP多药耐药肿瘤细胞的抗肿瘤细胞活性应用的同时还对所述多药耐药肿瘤细胞阻抑药物外排、逆转耐药活性的应用。化合物PH II-7在调节K562/A02细胞多药耐药表型的应用；化合物PH II-7在调节K562细胞和K562/A02细胞药物外排和胞内药物蓄积的应用。
Description
技术领域
本发明涉及新型抗肿瘤化合物3-取代芳基氧化吲哚，尤其是3-取代芳基氧化吲哚在多药耐药肿瘤细胞方面的应用。
背景技术
化疗是肿瘤综合治疗的主要方法之一，对于非实体瘤(如白血病)则是最重要的治疗手段。临床常用化疗方案往往是多药联合使用，且剂量较大，在抑制、杀灭肿瘤细胞的同时，不可避免的导致部分肿瘤细胞对化疗药物的耐受，称为获得性耐药。其最大特点是多药耐药(multi-drug resistance，MDR)，即肿瘤细胞在接受某些特定的化疗药物作用后，不仅对该类药物产生耐受，同时对未接触过的即与该药化学结构、药理作用完全不同的其他化疗药物也产生耐受性。这种交叉性药物耐受，是化疗失败的主要原因。明确多药耐药产生的机制和逆转多药耐药是临床上迫切需要解决的问题，也是目前肿瘤药物治疗研究的一个热点。
研究表明，肿瘤细胞多药耐药的产生是多种复杂的机制介导的，主要包括：(1)细胞膜糖蛋白增加药物的逆向转运和外排。这类蛋白包括：膜糖蛋白Pgp(由mdr1基因编码)，多药耐药相关蛋白MRP，肺耐药相关蛋白LRP以及乳腺癌耐药相关蛋白BCRP等。此类蛋白大多属于ATP结合盒蛋白家族(ATPbinding cassette，ABC)，通过结合、水解ATP将细胞内特定的药物底物泵出，从而降低胞浆药物浓度，导致耐药。(2)凋亡相关基因或蛋白表达失控，包括bcl-2凋亡抑制基因的异常激活、ras蛋白的异常活化、凋亡促进基因bax表达受抑以及Fas途径凋亡信号通路的改变等。最终使程序性细胞死亡失效或受抑，导致肿瘤细胞对以促进细胞凋亡为主要药理机制的一类化疗药物产生耐药。(3)细胞氧化和解毒酶系作用增强：如细胞色素酶P450、谷胱甘肽-S转移酶(glutathione S-transferase，GST)等表达增高或活性增强，加速细胞内各种药物的代谢，导致耐药。(4)DNA修复能力增强：如O6-甲基鸟苷DNA转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)，使肿瘤细胞对干扰DNA复制的一类化疗药物产生耐药。(5)某些药物的靶酶、靶蛋白表达下调导致耐药：如DNA拓扑异构酶II(TOPO II)下调导致肿瘤细胞对阿霉素、米托蒽醌、依托泊甙(VP 16)等的耐受、二氢叶酸还原酶(DHFR)表达下调导致对甲氨蝶呤(MTX)的耐药等。
研究还表明，细胞膜表面糖蛋白介导的药物外排被认为是大多数MDR肿瘤细胞发生耐药的主要机制。
1976年Juliano与Ling首先观察到具有MDR表型中国仓鼠卵巢细胞内药物积聚发生障碍，并且细胞膜上有一种分子量为170000的糖蛋白的过度表达，该MDR细胞对药物的摄入与亲代细胞无差异，而药物外排能力却明显增加。耐药性的产生是由于细胞膜Pgp的作用，并克隆了Pgp编码基因，即多药耐药基因(MDR1)。人MDR基因家族包括MDR1及MDR2。MDR1位于第七号染色体q21.1，是有功能耐药基因，MDR2为无功能耐药基因，但它常与MDR1一起扩增，与MDR1有同源性，其染色体位置与MDR1相邻。MDR1cDNA长4669bp，第179-3840bp之间为可读区，起始密码为ATG，共编码1280个氨基酸残基。人与鼠MDR1基因序列有高度同源性，二者区别集中在氨基端和羧基端的第一个跨膜区。此外，人MDR1基因与细菌转运蛋白基因也非常相似，由此推测MDR1基因是一个高度保守的基因家族。
基于对MDR1基因的上述推测，使得目前常用逆转耐药的构建方法也多针对MDR1基因及其产物Pgp，但是由于效果有限或毒副作用强，难以应用于临床。由于多药耐药表型的出现涉及多种机制、多个耐药相关基因及蛋白的改变，并且多种机制相互联系，各个耐药相关的基因、蛋白功能也不是单一一种，如Pgp可能还与凋亡的抑制、肿瘤干细胞的发生等有关等等，所以单纯针对某一种耐药机制研制的逆转剂效果必然是有限的。
目前的药物开发已经进入由靶点找药物的阶段，因此，发现在多药耐药中起关键作用的新基因，明确其调控机制，并且全面了解其介导耐药的机理，从而据此研制、设计靶向的干预方法，对于最终克服肿瘤的多药耐药表型的产生或逆转其耐药性有着至关重要的意义。
新型抗肿瘤化合物3-取代芳基氧化吲哚(以下简称PH II-7)，是本申请人合成并首先发现其具有抗肿瘤活性的作用。
发明内容
本发明的目的在于公开化合物PH II-7在多药耐药肿瘤细胞方面的应用，具体地是化合物PH II-7对于K562/A02、HL60/ADR、MCF-7/ADR、KBV200，A549DDP多药耐药肿瘤细胞的抗肿瘤细胞活性应用的同时还对所述多药耐药肿瘤细胞阻抑药物外排、逆转耐药活性的应用。化合物PH II-7在调节K562/A02细胞多药耐药表型的应用；化合物PH II-7在调节K562细胞和K562/A02细胞药物外排和胞内药物蓄积的应用。
本发明的有益效果和优点在于：PH II-7本身既有内在的直接杀伤肿瘤细胞活性，又可通过下调MDR1的表达，逆转药物外排介导的多药耐药表型。传统的克服肿瘤耐药的耐药方法是将专门的耐药逆转剂与传统化疗药联用，逆转剂本身的种种毒副作用与化疗药既有宿主毒性叠加而导致治疗方案的可行性降低。而本发明证明了化合物PH II-7同时具备内在的抗肿瘤细胞活性和阻抑药物外排逆转耐药的活性的作用，还证明了化合物PH II-7在具备高效广谱抗肿瘤细胞特性的同时，还具备对多药耐药肿瘤细胞的有效杀伤作用。本发明首次实现了PH II-7可以通过PKCA-FOS-MDR1信号通路下调MDR1基因的表达，并首次将PH II-7应用于肿瘤细胞逆转耐药表型。
附图说明
图1是PH II-7分子的化学结构图。
图2是PH II-7对K562异体移植瘤的抑制效果图(相对肿瘤体积)和阿霉素为阳性对照图(n＝6，±sd)。
图3是PH II-7对K562/A02异体移植瘤的抑制效果图(相对肿瘤体积)和阿霉素为阳性对照图(n＝6，±sd)。
图4是PH II-7对荷瘤鼠相对体重的影响图。
图5是PH II-7对PKCA表达水平的影响图。
图中以K562/A02的表达水平为相对值1，计算K562，以及K562/A02被不同PH II-7作用48小时后PKCA的表达水平变化。
图6是PH II-7对MDR1表达水平的影响图。
图中以K562/A02的表达水平为相对值1，计算K562，以及K562/A02被不同PH II-7作用48小时后MDR1的表达水平变化。
图7是K562/A02细胞中RNA干扰PKCA对MDR1及c-FOS，c-JUN基因表达水平的影响图。
图中1，2，3电泳道分别代表24小时，48小时，72小时。
图8是PH II-7和阿霉素对K562细胞的诱导凋亡效果图(作用24小时，药物浓度如图中标注)。
图9是PH II-7和阿霉素对K562/A02细胞的诱导凋亡效果图(作用24小时，药物浓度如图中标注)。
图10是激光共聚焦成像图。
图中荧光点代表阿霉素，显示K562/A02胞内阿霉素呈PH II-7作用时间依赖性增加。
图11是流式细胞术检测PH II-7对K562/A02胞内阿霉素蓄积的影响图。
图中X轴代表阿霉素浓度，Y轴代表细胞计数。
具体实施方式
本发明涉及的PH II-7新型抗肿瘤化合物化学结构如图1所示，通过高通量的人类基因表达谱芯片技术检测其作用于多药耐药系K562/A02后导致的基因表达谱变化，从基因水平评价PH II-7的作用模式，证明其可以影响一系列耐药相关基因的表达，并证明其可以通过PKCA-FOS-MDR1信号通路下调MDR1基因的表达，并可以将PH II-7应用于肿瘤细胞逆转耐药表型。
具体实验如下：
实验材料：
1、细胞株人白血病细胞系K562及其多药耐药细胞系K562/A02为本申请人常规培养传代的细胞。K562/A02是本室用阿霉素逐步诱导K562细胞建立的多药耐药细胞株，具有典型的MDR表型。细胞培养于RPMI1640培养基中，加入10％的胎牛血清(FBS)，10mmol/L的Hepes和68.4mmol/L的谷胺酰胺，于37℃5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。K562/A02在培养过程中加入阿霉素1mg/L以维持耐药性，实验前三天停止加药。
2、药物及试剂
(1)阿霉素(Doxorubicin)购自法码西亚普强公司，用生理盐水配制成1mg/ml的母液待用。
(2)PRMI1640购于美国GIBCO公司，胎牛血清购于中国医学科学院血液学研究所科技公司。
(3)RNA干扰试剂盒(SilenceTM siRNA Constructing Kit)购于Ambion公司。
(4)Trizol RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒以及脂质体lipofectamin2000为Invotrogen公司产品。
(5)DEPC、随机引物、dNTP购于上海生物工程有限公司。
(6)Realtime试剂盒。
3、基因芯片
GeneChip
GenomeU133 Plus 2.0 Array，为美国Affymetrix公司生产的人类基因表达谱芯片，可提供47,000多个转录本和38,500多个基因的表达信息。
4主要仪器
C02孵箱Napco5410型(美国Napco公司)；
倒置显微镜CK40型(日本Olympus公司)；
无菌操作台(苏静集团安泰公司)；
Realtine PCR仪7500型(美国Apllied Biosystems公司)；
紫外分光光度剂DU-70型(美国Beckman公司)；
Biofuge fresco台式低温离心机(德国Heraeus公司)；
低温冰箱-86℃ULT-freezer(Thermo forma公司)；
Gene Amp PCR system 2400型扩增仪(美国Pekin Elmer公司)；
DYY8B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；
凝胶成像系统Alpha Ease FC(美国Alpha Innotech公司)；
HZQ-Q振荡器(哈尔滨东联电子开发有限公司)；
基因芯片检测平台，包括基因芯片滚动杂交仪、全自动芯片洗涤工作站、高分辨率芯片扫描仪及相关分析软件等(美国Affymetrix公司)。
5、实验动物
Balb/c裸鼠(nu/nu)，雌性，5-7周龄，体重16～22g，购自中国生物制品检定所动物中心，在SPF级动物合格环境下饲养。
药理实验一：
将PH II-7作用于多种实体瘤和血液肿瘤细胞系，及敏感和耐药成对细胞系，评价化合物体外抗肿瘤活性，尤其是抗耐药肿瘤活性。试验方法：本实验共包括18个肿瘤细胞系，测试每种细胞系对阿霉素的IC50。另有5个多药耐药细胞系及其对应的亲代细胞系，测试每种细胞系对PH II-7和阳性对照药阿霉素的IC50，A549DDP和A549的阳性对照药是CDDP。
1.细胞培养
a、培养液的配制：RPMI1640培养液(RPMI粉剂一袋，NaHCO32g，Hepes 3g，丙酮酸钠0.11g溶于1000ml去离子水中，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌)；胎牛血清56℃、30min灭活，按10％、20％比例加入，RPMI1640培养液中，4℃保存。
b、灭菌及无菌操作：操作前应紫外灯照射灭菌台面30min，进入超净台前75％酒精擦手和台面，所有操作应在酒精灯旁进行，所用器物须经火焰烧灼灭菌，注意无菌原则。
c、细胞计数：用96％酒精清洗计数板及盖玻片后，用镜头纸擦干，将盖玻片覆盖在计数板上，用吸管充分吹打培养瓶中的细胞悬液，均匀后立即吸取少量悬液，从边缘轻滴1-2滴使刚好充满计数板与盖玻片之间的空隙。显微镜下观察并计数四角大方格内细胞数，如有压边仅计算压其中固定两边的细胞，计算公式如下：
细胞数/ml＝(4大格细胞总数/4)×10000×稀释倍数
2.MTT实验
即取1×105/ml的细胞，接种于96孔培养板中，每孔180μl，培养24小时后加入20μl不同浓度的PH II-7，对照组加20μl生理盐水，继续培养72小时，再向每孔加入20μl MTT，避光孵育4小时后，1,000g离心10分钟，弃上清，每孔加入100μl DMSO，震荡混匀后于酶标仪上测定570nm的光吸收值，计算IC50。
实验结果：
PH II-7在测试的各个细胞系均显示明显的杀伤效果(见表一)，尤其是在阿霉素基本无效的5个多药耐药细胞系，其杀伤效果尤其显著(见表二)。
多药耐药细胞系K562/A02，HL60/ADR，MCF7/ADR的IC50对比其亲代细胞系，阿霉素差异倍数高达18倍至377倍，而对PH II-7，差异倍数仅为0.7倍至5.3倍。
表一：PH II-7对18种不同来源人肿瘤细胞系的杀伤效果
| Cell lines | IC50 |
| K562 | 1.37±0.37 |
| HL60 | 0.34±0.08 |
| Daudi | 1.35±0.26 |
| Jurkat | 1.18±0.23 |
| Raji | 2.56±1.20 |
| KB | 1.20±0.16 |
| QGY7703 | 8.01±2.63 |
| SMMG7721 | 5.30±1.05 |
| BGC-823 | 4.99±1.05 |
| Lovo | 18.61±3.16 |
| A549 | 7.05±2.53 |
| MCF-7 | 3.49±1.55 |
| SKOV3 | 2.11±0.45 |
| HeLa | 10.68±3.44 |
| SHG-44 | 5.60±0.16 |
| Cell lines | IC50 |
| HOS-8603 | 11.17±0.24 |
表二：PH II-7对多药耐药肿瘤细胞系的杀伤效果。
药理实验二：
将PH II-7应用于K562，K562/A02裸鼠移植瘤的杀伤，以阿霉素为对照，评价其体内杀伤耐药肿瘤的效果及毒性。
试验方法：
1.血病细胞K562和K562/A02裸鼠移植瘤模型的建立
选取雌性Balb/c nu/nu裸鼠，周龄5-7周，体重16-20g。接种前1-3天Cs137照射400rad。取对数生长期的K562/A02细胞接种于右前肢根部背侧皮下，每只裸鼠接种细胞数为1×107个/0.2ml，三天后于左侧相同部位接种相同数量的K562细胞，4-6天后待肿瘤长至40mm3后开始分组治疗。
2.药物与剂量
将PHII-7溶于自制溶剂(蓖麻油∶无水乙醇∶Tween80为490∶490∶20)中，配成7.5mg/ml的储存液，治疗时用无菌生理盐水稀释成所需浓度。实验分阴性对照组、阳性对照组和治疗组，阴性对照组给予溶剂，阳性对照给予阿霉素4mg/kg，治疗组设高、低两个剂量组，高剂量组为50mg/kg，低剂量组为25mg/kg。
3.给药方法
随机分组当日开始给药，间隔3天用药一次，连续5次，0.2ml/10g腹腔注射(i.p.)。
4.计算方法
4.1肿瘤体积
裸小鼠移植瘤模型使用游标卡尺测量肿瘤直径，动态观察药物的抗肿瘤效应，肿瘤直径的测量每两天一次，肿瘤体积的计算公式为：
V＝1/2×a×b2
(式中：a和b分别为肿瘤的长径和短径)
抗肿瘤活性评价指标为肿瘤抑制率(IR％)，采用下面公式计算：
IR％＝(1-VT/V0)×100％
(式中：VT为治疗组肿瘤体积，V0为对照组肿瘤体积)
4.2相对体积比
每次测量的相对肿瘤体积比(RTV)计算公式为：
RTV＝Vt/V0
(式中：V0为分组治疗开始时测量的体积，Vt为每一次测量时的体积)抗肿瘤活性评价指标为肿瘤抑制率(IR％)，采用下面公式计算：
IR％＝(1-TRTV/CRTV)×100％
(式中：TRTV为治疗组RTV，CRTV为对照组RTV)
实验结果：如图2，3所示，25mg/kg剂量PH II-7显著抑制移植瘤的体积，K562组RTV(相对肿瘤体积)减少51.94％(P＜0.05)，K562/A02组RTV减少65.27％(P＜0.05)，同时呈现良好的宿主耐受性，RBW(相对体重)相对对照组，无明显差异。而阳性对照药阿霉素对K562/A02移植瘤仅达成8.8％的抑制率，同时却造成如图4所示的RBW的显著降低。
药理实验三：
PH II-7处理前后的基因表达谱变化比较，评价PH II-7抗耐药肿瘤细胞的作用机制。
试验方法：
实验分三组：K562，K562/A02，K562/A02的200nM浓度PH II-7处理48小时组，提取各组的总RNA，处理后杂交Affymetrix人类基因表达谱芯片，扫描，信号转化，生物信息学分析，发现PH II-7抗耐药肿瘤的基因机制。
1.总RNA提取和探针制备
采用Trizol试剂分别提取细胞的总RNA，利用T7-(dT)24做为引物，在反转录酶的作用下，由RNA反转录成单链cDNA，使用Affymetrix公司的EnzoRNA Transcript Labeling Kit体外反转录合成生物素标记的cRNA探针。cRNA探针经片段化处理后用于基因芯片杂交。
2.杂交和扫描
实验室使用Affymetrix公司的
Human Genome U133Plus 2.0Array芯片，包含47000个转录本，U133系列高密度寡核苷酸芯片利用原位光刻技术生产，检测时用一种荧光标记，杂交在Hybridization Oven 640中完成，在洗涤工作站FS450上按照芯片类型，运行洗脱程序，对芯片进行清洗、染色和信号放大过程。用Scanner 30007G 4C扫描仪上对芯片进行扫描和信号值转换。杂交前芯片质控由“test chip”完成。
3.数据分析
芯片扫描获得的数据使用
Operating Software(GCOS)分析处理，在比较两张芯片的结果之前，先对每张芯片的数据进行标准化(normalization)处理。以荧光强度比值的对数，作为筛选差异表达基因的标准。
实验结果：
表达谱差异分析结果表明，本试验采用的Human Genome U133 Plus 2.0Array包括大约54000个探针。根据芯片杂交后荧光信号的对数值，筛选K562/A02及K562细胞的差异表达基因，共发现差异倍数大于2倍的基因3203个，其中K562/A02相对K562上调的基因3522个，下调的基因1478个。K562/A02的PH II-7处理组对比K562/A02的对照组，发现差异基因1126个，其中上调639个，下调487个。
实验重点分析与耐药相关的基因，发现PKCA和MDR1基因在K562/A02组相对K562组显著上调，而在PH II-7处理后的K562/A02细胞又显著下调。证明了MDR1是PH II-7对耐药肿瘤细胞杀伤的重要机制。
药理实验四：
Realtime PCR相对定量分析验证PKCA和MDR1基因表达变化
1.引物设计：
以β-actin为内参，比较K562与K562/A02及PH II-7处理后的K562/A02中MDR1基因的相对表达水平。根据GeneBank中sorcin基因与β-actin基因编码区序列，参照Realtime PCR实验引物设计的基本原则，设计用于RealtimePCR相对定量分析的检测引物，并将候选的引物序列输入GeneBank中用Blast软件进行序列同源性搜索，排除那些和其他基因的编码序列或EST同源的候选序列。最终采用的引物及其扩增片段全长如表3所示：
表3用于Realtime PCR实验的MDR1、PKCA、β-actin引物核苷酸序列
2.准备反应板：向反应板的每个反应孔中依次加入如下试剂：
SYBR Premix Ex TaqTM 10μl
上游引物(10μM) 0.4μl
下游引物(10μM) 0.4μl
ROX Reference DyeII(50×) 0.4μl
cDNA模板 6.8μl
Nuclease-Free Water 补至20μl
3.Real-time PCR反应：反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃复性、延伸1min，共40个循环；
4.熔解分析：反应条件为：95℃变性15s，60℃复性1min，95℃再变性15s；
应用7500System Software进行数据分析。
实验结果：
Real-time PCR验证结果与表达谱芯片一致：K562/A02的PKCA和MDR1基因表达水平相对于K562显著升高。而在PH II-7处理48小时候，K562/A02的PKCA和MDR1基因表达水平如图5、图6所示的呈PH II-7剂量依赖性降低。
药理实验五：
1、siRNA的设计
根据GeneBank中PKCA基因的序列和siRNA设计原则，应用Ambion公司(http://www.ambion.com)的设计软件(siRNA Target Finder and DesignTools)，自sorcin mRNA的起始密码子开始寻找“AA”二连序列，记下其3’端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选的靶序列输入GeneBank中用Blast软件进行序列同源性搜索，排除那些和其他基因的编码序列或EST同源的候选序列。结果结合文献，靶向PKCA的siRNA的目标序列选择为：AAGGCTTCCAGTGCCAAGTTTCCTGTCTC，另外根据碱基构成相同的原则设置乱序对照：AATTCTCCGAACGTGTCACGTCCTGTCTC。用Blast验证得知两个序列与GeneBank中人类已知基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的正、反义链的siRNA模板作为阳性对照，设计的正、反义寡聚核苷酸模板的3’端都加上T7启动子引物5’-CCTGTCTC-3’，组成的29碱基的寡聚核苷酸模板有上海生物工程公司合成。
体外转录法合成siRNA
基本的实验原理和流程
合成转录模板：
将寡聚核苷酸模板离心，重悬于无核酶的灭菌去离子水中，使终浓度大约为200μM；
将溶解后的寡聚核苷酸用TE以1∶250稀释，测定在260nm的OD值，计算寡聚核苷酸浓度，计算方法：浓度(μM)＝(OD260×5000)/9.7；
用无菌水活着TE将每个寡聚核苷酸模板的浓度调整为100μM；
室温解冻转录模板合成试剂T7 promoter primer、10×Klenow ReactionBuffer、DNA Hyb buffer、10×dNTP mix、Nuclease-free water；
将siRNA的正、反义寡聚核苷酸模板与T7启动子引物杂交，GAPDH的正、反义寡聚核苷酸模板作为阳性对照；
T7promoter primer 1μl
DNA Hyb buffer 3μl
寡聚核苷酸模板链 1μl
70℃水浴5min，然后室温放置5min
向上述杂交体系中加入如下试剂，轻轻混匀后离心。
10×Klenow Reaction Buffer 1μl
10×dNTP mix 1μl
Nuclease-free water 2μl
Exo-Klenow 1μl
37℃水浴30min合成转录模板
(1)双链RNA的合成
室温解冻2×NTP Mix和10×T7Reaction Buffer，轻轻混匀；
a每个siRNA都在室温下进行两个转录体系，合成正义和反义的siRNA。每个反应体系按下列顺序混合：
sense or antisense siRNA 2μl
template
Nuclease-free water 4μl
2×NTP Mix 10μl
10×T7Reaction Buffer 2μl
T7enzyme mix 2μl
37℃水浴2h
b将正义和反义反应转录体系混合于一管内37℃水浴反应过夜，合成双链siRNA。
(2)siRNA的纯化
a向上述合成的双链siRNA中顺序加入下列试剂：
Digestion Buffer 6μl
Nuclease-Free Water 48.5μl
RNAse 3μl
DNAse 2.5μl
混合均匀，37℃孵浴2h
b向上述体系中加入400μl Binding Buffer，室温孵浴2-5min；
c用100μl的siRNA Washing Buffer将过滤柱预湿；
d加入含有siRNA的siRNA Binding Buffer，10,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；
e向过滤柱中加入500μl的siRNA Washing Buffer，10,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；
f向过滤柱中加入500μl的siRNA Washing Buffer，10,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体，然后更换一个新的收集管；
g向过滤柱中加入100μl 75℃预热的Nuclease-Free Water，室温放置2min；
h 12,000rpm离心2min，将收集管中得到的纯化的siRNA置于-80℃保存待用.。
(3)siRNA的定量：将10μl纯化得到的siRNA稀释到1ml TE中，测定样品在260nm的吸光度值，计算样品浓度，方法：浓度(μM)＝(OD260×4000)/14
2.siRNA的转染取对数生长期的细胞，用无血清、无抗生素的RPMI 1640培养液洗涤两次，调整细胞浓度为3.2×105/ml，每孔400μl加入24孔板；
将不同浓度的siRNA稀释于Opti-MEM1中(50μl/孔)，轻轻混匀，另外将合适浓度的脂质体Lipofectamine 2000稀释于Opti-MEM1中(50μl/孔)，混合后室温放置5min。5min后将脂质体和siRNA两两混合，轻轻混匀后室温放置20min；
将100μl脂质体-siRNA复合物加入细胞中，摇动培养板轻轻混匀；
37℃培养4-6h后，每孔加入500μl含20％FBS的RPMI 1640培养液；
在转染后的不同时间点收集细胞，进行下一步的检测。
实验结果：
siRNA显著抑制了PKCA的表达，同时诱导c-FOS，c-JUN，及MDR1基因的表达水平如图7所示的显著性降低。由于表达谱芯片中同时发现了PKCA和MDR1基因的表达水平显著下调，通过本实验证明了PHII-7通过PKCA-FOS/JUN-MDR1途径影响MDR1基因的表达水平。
药理实验六：
以阿霉素为对照，测试PH II-7对K562和K562/A02细胞凋亡的影响，评价PH II-7对耐药肿瘤细胞的诱导凋亡效果。
凋亡细胞对用于细胞活性鉴定的染料PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的坏死细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的凋亡细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)
实验分组，除两细胞系各自的一个双阴，两个单阳，一个双阳性对照外，每个细胞系各设PH II-70.3μM，0.6μM，0.75μM浓度处理组，和一个阿霉素0.1μM，浓度处理组。
试验方法：
1.取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×105/ml铺入6孔细胞培养板，分别加入不同PH II-7，37℃5％CO2条件下孵育24小时。
2.24小时后，收集细胞，1000rpm 4℃离心5分钟，弃上清。
3.用无菌水按1∶4的比例稀释结合缓冲液(binding buffer)
4.用binding buffer调整待测细胞的浓度为5×105～1×106/ml.，取1ml细胞，1000rpm 4℃离心5分钟，弃上清。
5.用1ml PBS洗涤1次，1000rpm离心5分钟。
6.用0.5ml binding buffer重悬细胞，取195μl细胞悬液，加入5μlAnnexinV和10μl PI，室温下避光孵育10～15min
7.加入300μl Binding Buffer，立即上机(流式细胞仪)检测：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
实验结果：
详细结果见图8、图9所测各个浓度PH II-7在各个细胞系均能显著诱导凋亡，早期凋亡细胞的比例随PH II-7的浓度增加而增加，对比两细胞系，PH II-7诱导凋亡的量/效关系无显著差异。0.1μM的阿霉素在敏感细胞K562可产生与0.6μM的PH II-7相当的诱导凋亡效果，在K562/A02细胞却无明显诱导凋亡作用。
药理实验七：
激光共聚焦成像测定外排泵功能
试验方法：
取1×105/mlK562和K562/A02细胞，接种于24孔板中，1ml，经0.3μM，浓度PH II-7，处理24h、48h、72h。收集细胞，1XPBS洗2次。加入1ug/ml阿霉素500ul，37℃震荡水浴孵育1h。1XPBS洗2次，用500ul生理盐水重悬后取50ul移至平皿，激光共聚焦显微镜下观察细胞内阿霉素红色荧光。
实验结果：
K562/A02胞内阿霉素荧光强度呈PH II-7作用剂量和时间依赖性增加(见图10)。
本茶果醋选用优质茶叶为原料，采用常温浓缩的方法得到的茶汁浓缩液，更多地保留了茶叶的有益成分与茶香，具有茶叶的独特风味，又有醋的醇香，而且柔顺爽口，能够实现与果醋的完美结合。本茶果醋采用成品果醋，果醋口味任意，因此可以极大地缩短加工周期和简化工艺，并有利于茶果醋的质量均一控制。本发明具有可以兼顾茶和果醋风味、其澄清和浓缩工艺具有对茶饮料主要化学成分和品质影响较小的突出优点。
药理实验八：
流式细胞术测定外排泵功能
取1×105/mlK562和K562/A02细胞，接种于24孔板中，1ml，经不同浓度PH II-7，处理24h、48h、72h。收集细胞，1XPBS洗2次。加入1ug/ml阿霉素500ul，37℃震荡水浴孵育1h。1XPBS洗2次，用500ul生理盐水重悬转入流式管，经流式细胞仪检测胞内阿霉素荧光强度。
实验结果：
流式细胞术检测到K562/A02胞内阿霉素荧光强度呈PH II-7作用剂量和时间依赖性增加(见图11)，结合实验五的结果，提示PH II-7通过下调MDR1的表达，降低了MDR1编码蛋白产物P-gp介导的药物外排，增加了阿霉素的胞内蓄积，从而在一定程度上逆转里多药耐药表型。
Claims (5)
1.3-取代芳基氧化吲哚对于K562/A02、HL60/ADR、MCF-7/ADR、KBV200，A549DDP多药耐药肿瘤细胞的抗肿瘤细胞活性应用的同时还对所述多药耐药肿瘤细胞阻抑药物外排、逆转耐药活性的应用。
2.3-取代芳基氧化吲哚对于调节K562/A02细胞多药耐药表型的应用。
3.3-取代芳基氧化吲哚对于调节K562细胞和K562/A02细胞药物外排和胞内药物蓄积的应用。
4.3-取代芳基氧化吲哚对于诱导K562细胞，K562/A02等人肿瘤细胞凋亡的应用。
5.3-取代芳基氧化吲哚对于参于调控K562/A02中MDR1基因表达的应用。
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| CN (1) | CN101879160A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104276994A (zh) * | 2014-07-23 | 2015-01-14 | 贵州大学 | 3,3′-双取代氧化吲哚与3-烯键氧化吲哚拼接衍生物及其制备方法及应用 |
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2009
- 2009-05-07 CN CN2009100687662A patent/CN101879160A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101110 |