CN101879151A - 大黄素在制备p2x3介导神经病理痛/神经系统疾病药物中的应用 - Google Patents
大黄素在制备p2x3介导神经病理痛/神经系统疾病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及大黄素在制药领域中的新用途，即大黄素在制备P2X3介导疼痛/神经系统疾病药物中的应用。实验观察到大黄素可抑制痛觉行为反应，进而应用免疫组化、原位杂交、RT-PCR及蛋白印迹等技术观察到大黄素可抑制神经病理痛模型大鼠背根神经节及三叉神经痛模型大鼠三叉神经节神经细胞P2X3受体的mRNA和蛋白表达。实验证实大黄素对慢性痛(神经病理痛)和三叉神经节神经细胞传递的疼痛具有抑制作用的机理是阻断初级感觉神经细胞P2X3受体介导的痛觉信息传递。本发明为神经病理性疼痛及/或三叉神经节神经细胞介导疼痛防治探明新方法，同时还表明大黄素具有影响神经细胞P2X3受体的作用，这将有助于P2X3受体所涉及神经系统疾病的药物防治应用。
Description
技术领域
本发明涉及镇痛药物用途发明领域，尤其是涉及可用于防治疼痛的大黄素(单独用)在制备P2X3导神经病理痛/神经系统疾病药物中的应用。
背景技术
疼痛(pain)由痛觉(pain perception)和痛反应(pain response)两部分组成，是临床上大多数疾病共有并最常见的症状之一，主要表现为机体对组织损伤或潜在的损伤所产生的一种不愉快的主观反应。由于疼痛给人们造成极大痛苦，据2001年第二期《国际疼痛学会通迅》报道：美国106次国会通过一项决议，宣布从2001年元月一日起的十年为“疼痛控制和研究的十年”(Decadeof Pain Control and Research)。由此说明各国对疼痛研究的重视。根据疼痛时程可将疼痛分为急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)。其中：慢性痛包括炎症痛、神经病理痛、癌症痛。目前临床上将疼痛作为继体温、脉搏、呼吸、血压等四大生命体征之后的第五大生命体征，是生命体征的重要指标。由于慢性痛机理复杂，其治疗成为临床上的难题。神经病理痛是指由神经系统损伤或疾病所引起的疼痛综合征，常常表现为自发性的疼痛，对机械、冷、热等伤害性刺激产生痛觉过敏；对非伤害性刺激产生触诱发痛、痛觉倒错和烧灼痛等神经病理性痛觉过敏。由于慢性痛持续时间长，对人身心健康危害较大，其研究成为疼痛领域的热点和重点。三叉神经痛是临床上发病率较高，对病人的生活质量影响较大的一种较难完全治愈的疾病。三叉神经痛是一种慢性疼痛综合症，药物治疗是首选，虽然治疗药物较多，但有效而副作用较小的药很少，而且有些药物可能一开始有效但很快会产生耐药性。因此我们有必要探寻新的具有较好疗效在而且副作用较小的三叉神经痛止痛药物，为三叉神经痛治疗探索新的方法。
化学药物镇痛仍是目前最主要的疼痛治疗手段，主要包括阿片类镇痛药、中枢作用的非阿片类镇痛药、作用于外周的抗炎镇痛药和复方抗炎镇痛药。但阿片类等镇痛药物的副作用如呼吸抑制、恶心、呕吐、嗜睡、尿潴留等发生率较高，而且长期应用易产生药物耐受与依赖以及突然停药导致的戒断综合征。奈福泮(Nefopam，平痛新)为一种新型的非麻醉性镇痛药，兼有轻度的解热和肌松作用，化学结构属于环化邻甲基苯海拉明，所以不具有非甾体抗炎药的特性，亦非阿片受体激动剂，对中、重度疼痛有效，主要用于术后止痛、牙痛、癌症痛、急性外伤痛，临床亦用于三叉神经痛治疗。消炎痛(Indometacin，吲哚美辛)为非甾体类抗炎药，具有解热、镇痛及抗炎等作用，其作用机理为通过对环氧酶的抑制而减少前列腺素的合成，制止炎症组织痛觉神经冲动的形成，抑制炎性反应，包括抑制白细胞的趋化性及溶酶体酶的释放等，由于消炎痛有多种严重的副作用，影响其使用范围。因此，寻找以新的分子靶标为基础的镇痛药物成为目前的研究热点和面临的首要任务。
嘌呤类物质三磷酸腺苷(ATP)作为重要的信使物质参与痛觉信息传递。嘌呤(Purine)受体分为嘌呤1和嘌呤2(Purine 1，Purine 2；P1，P2)受体，ATP及其类似物作用于P2受体。P2受体分为配体门控性离子通道型受体(P2X受体)和G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。P2X受体有七种亚型(P2X1-7)。英国“自然”杂志报道ATP作用的P2X3受体(P2X受体的一种亚型)特异性地在与痛觉传入有关的背根神经节小、中神经细胞克隆表达。将ATP用离子透入法导入志愿者前臂皮肤亦可产生剂量依赖性的痛觉反应。疼痛、伤害性刺激使损伤细胞、应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量ATP，ATP及其作用的P2X受体涉及痛觉及伤害性信息在初级感觉神经细胞的传递，其中主要是同聚性P2X3受体参与初级感觉神经细胞的痛觉及伤害性信息传递。基因敲除P2X3受体的小鼠减小了对福尔马林致痛试验的两相反应。P2X3受体介导神经病理痛的痛觉传递。神经病理痛刺激时，P2X3受体和P2X3mRNA表达增加，感觉神经细胞P2X3受体介导ATP激活的门控通道电流明显增强。应用P2X3受体反义寡核苷酸及RNA干扰技术可使炎性痛大鼠模型背根神经节的P2X3受体水平下调，进而明显减轻P2X3受体激动剂α，β-meATP和福尔马林所致的足底伤害性反应。三叉神经传导口腔粘膜的感觉。三叉神经节有P2X3受体的表达，三叉神经节对三叉神经痛的传递有着重要作用，P2X3受体参与三叉神经痛的痛觉传递。疼痛状态下P2X3受体对其激动剂的反应性增加，P2X3受体拮抗剂A-317491明显减小大鼠完全福氏佐剂诱导的慢性炎性热痛觉过敏和福尔马林引起的痛觉行为。这些发现为神经病理痛和三叉神经痛的发病机理提供了新的依据。申请人实验室以前的研究也显示伤害性刺激可导致背根感觉神经细胞和三叉神经节神经细胞P2X3受体表达增加。目前国外已有研究生产P2X3受体拮抗剂(如RO3)用于临床治疗疼痛的报道。
大黄素(emodin)是中药大黄的主要有效成分，并且在正品大黄中的游离蒽醌中占的比例较大，其药理作用与大黄有许多相似之处。大黄味苦性寒，归脾、胃、大肠、肝、心经；大黄有泻火解热、通瘀导滞、止痛止血等作用。大黄素是从豆科植物野葛及甘葛藤根中提取的一种黄酮苷，临床上主要用于心血管疾病和糖尿病的治疗。文献报道[丁艳，黄志华.大黄素药理作用研究进展.中药药理与临床，2007；23(5)：236-238.]大黄素具有抗炎作用，但目前尚无单独用大黄素直接具有镇痛作用的报道，临床上也无大黄素通过镇痛作用机制进行疼痛治疗的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供大黄素的第一个新用途，即大黄素在制备治疗慢性痛(优选神经病理痛)的药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供大黄素的第二个新用途，即大黄素在制备治疗三叉神经节神经细胞介导疼痛药物中的应用。
本发明的第三个目的在于提供大黄素的第三个新用途，即大黄素在制备治疗涉及P2X3受体介导的神经系统疾病的病理生理机制防治药物中的应用。
大黄素可减轻神经病理痛及三叉神经痛模型大鼠的痛行为反应。大黄素治疗疼痛的作用机理为：阻断P2X3受体介导的疼痛信息传递，产生防治疼痛的作用。
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图以实验和结果来证明大黄素的用途。
附图说明
图1为大黄素神经病理痛大鼠热痛敏的影响图；
图2为大黄素神经病理痛大鼠机械痛敏的影响图；
图3为免疫组织化学方法观察大黄素对神经病理痛大鼠背根神经节P2X3受体免疫反应性的影响图，其中A：正常组；B：假手术组；C：坐骨神经慢性压迫性损伤组；D：单独大黄素组；E：坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素处理组；F：坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组；
图4为原位杂交方法观察大黄素对神经病理痛大鼠背根神经节P2X3受体mRNA表达的影响图，其中A：正常组；B：假手术组；C：坐骨神经慢性压迫性损伤组；D：单独大黄素组；E：坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素处理组；F：坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组；
图5为蛋白印迹方法观察大黄素对神经病理痛大鼠三叉神经节P2X3受体蛋白表达的影响图，其中实验分组顺序：正常组(control)；假手术组(sham)；坐骨神经慢性压迫性损伤组(Chronic constriction injury，CCI)；单独大黄素处理组(Emodin)；坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素处理组(CCI+emodin)；坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组(CCI+Indo)；
图6为RT-PCR方法观察大黄素对神经病理痛大鼠三叉神经节P2X3受体mRNA表达的影响图，其中实验分组顺序：正常组(control)；假手术组(sham)；坐骨神经慢性压迫性损伤组(Chronic constriction injury，CCI)；单独大黄素处理组(Emodin)；坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组(CCI+Indo)；坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素处理组(CCI+emodin)；
图7为大黄素三叉神经痛大鼠机械痛敏的影响图；
图8为大黄素对三叉神经痛大鼠三叉神经节P2X3受体免疫反应性的影响图，其中A：假手术组；B：三叉神经损伤模型组；C：三叉神经损伤+大黄素处理组；D：三叉神经损伤+奈福泮处理组；E：单独大黄素处理组；
图9为原位杂交方法观察大黄素对三叉神经痛大鼠三叉神经节P2X3受体mRNA表达的影响图，其中A：假手术组；B：三叉神经损伤模型组；C：三叉神经损伤+大黄素处理组；D：三叉神经损伤+奈福泮处理组；E：单独大黄素处理组；
图10蛋白印迹方法观察大黄素对三叉神经痛大鼠三叉神经节P2X3受体蛋白表达的影响图，其中实验分组顺序：A：假手术组；B：三叉神经损伤模型组；C：三叉神经损伤+大黄素处理组；D：三叉神经损伤+奈福泮处理组；E：单独大黄素处理组；
图11为RT-PCR方法观察大黄素对三叉神经痛大鼠三叉神经节P2X3受体mRNA表达的影响图，其中实验分组顺序：A：假手术组；B：三叉神经损伤模型组；C：三叉神经损伤+大黄素处理组；D：三叉神经损伤+奈福泮处理组；E：单独大黄素处理组。
具体实施方式
本发明以大黄素对神经病理痛作用(作为慢性痛的代表)和三叉神经痛(作为三叉神经介导疼痛的代表)作用两部分。
一、材料和方法
(一)大黄素对P2X3受体介导神经病理痛作用研究
1.1动物和分组：
雄性SD大鼠，220-250g，南昌大学医学院实验动物科学部提供。将大鼠随机分成5组，每组12只。实验分组：Ⅰ组(正常组)(control)；Ⅱ组(假手术组)(sham)；Ⅲ组(坐骨神经慢性压迫性损伤组)(Chronic constriction injury，CCI)；Ⅳ组(单独大黄素处理组)(Emodin)；Ⅴ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素处理组)(CCI+emodin)；Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组)(CCI+Indo)。将大黄素以20mg/ml溶于0.5％的羧甲基纤维素钠，再按1∶2的体积比用生理盐水稀释，50mg/kg的大黄素终浓度给予腹腔注射。Ⅰ组每天腹腔注射生理盐水；Ⅱ组每天腹腔注射大黄素注射液；Ⅲ组(假手术组)切开皮肤暴露坐骨神经，不结扎神经即缝合皮肤。Ⅳ组CCI术后第1天开始每天腹腔注射大黄素注射液。Ⅵ组实验大鼠于术前半小时和术后每天腹腔注射消炎痛(4mg/kg/d)，每天一次至实验结束。
1.2药物与试剂：
大黄素(中国药品生物生物制品检定所中药化学对照品，编号：110756)；硫喷妥钠，上海新亚药业有限公司(生产批号：050101)；消炎痛(广东华南药业，国药准字：H44020701)；SP试剂盒，原位杂交试剂盒及DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；P2X3抗体购自美国CHEMICON INTERNATIONAL公司。
1.3主要仪器：
BME-403 Von Frey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)；BME-410C型全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75％酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊、神经剥离子等。
1.4慢性神经病理痛模型制作：
用硫喷妥钠麻醉大鼠(30mg/kg，腹腔注射)，在无菌条件下于大鼠右大腿后外侧切开皮肤，钝性分离出坐骨神经，以4-0含铬肠线轻度结扎坐骨神经，共结扎4道，每个结之间间隔约1mm。结扎过程中可见坐骨神经被结扎处直径略减小，并伴有右后肢一过性抽动，并注意不要结扎太紧以至于完全阻断神经外周的血流。大鼠术后单笼饲养，分别于术前(0d)及术后1，3，5，7，9，11，14d测量机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期(测定时间恒定于每日10:00-14:00，室温维持在22±0.5℃)。
1.5神经病理痛大鼠机械痛敏检测：
用BME-403 Von Frey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱(22×12×22cm3)中，有机玻璃箱底为1×1cm2的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应15min。折力分别为0.13，0.20，0.33，0.60，1.30，3.60，5.00，7.30，9.90，20.1g，折力≥20.1g时均记为20.1g。从最小折力开始，每根试验10次，直至出现缩足反射次数大于5/10，即50％反应阈值(即引起10次试验中5次反应的值。重复三次，取其平均值)。每次刺激间隔时间至少大于15s，并待刺激引起的反应(如舔足、甩腿等)完全消失。
1.6神经病理痛大鼠热痛敏检测：
将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)照射大鼠足底。热辐射刺激仪照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。切断时间为30秒，以防止组织灼伤。
1.7大鼠背根神经节(DRG)P2X3受体的表达：
五组实验大鼠于术后第14天腹腔注射硫喷妥钠(30mg/kg)深麻醉，经升主动脉灌注4％多聚甲醛(0.1mol/L PB，pH7.4)，分离出大鼠L4、L5段DRG，取出固定，放入4％多聚甲醛/0.1mPBS(含0.1％DEPC)中固定2小时，用20％蔗糖脱水，在恒冷箱切片机上行冰冻切片，厚度为15μm.放入4％的多聚甲醛中保存。每只大鼠的DRG切片隔5张取一张二步法免疫组织化学染色测定DRG神经细胞P2X3受体的表达，DAB显色。与此同时对DRG切片进行原位杂交测定P2X3受体mRNA的表达，杂交前所用液体和器皿都经0.1％的DEPC严格处理。冰冻切片在0.05％的H2O2室温下作用30分钟，以去除内源性过氧化物酶，胃蛋白酶消化1-2分钟，37℃预杂交液中孵育2小时，弃去预杂交液，转入杂交液于水浴中37℃过夜。次日，用梯度枸橼酸盐水(2XSSC，0.5XSSC和0.2XSSC)冲洗切片各15分钟。入37℃封闭液30分钟，转入生物素化的地高辛中37℃孵育30分钟，0.05％的PBS冲洗15分钟，相继在SABC-POD和生物素化的过氧化物酶中各孵育30分钟，DAB显色。结果用图像分析系统软件(武汉天平影像技术有限公司，HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统)对P2X3阳性神经细胞进行平均光密度值分析。蛋白印迹检测大鼠DRG的P2X3蛋白表达变化结果通过AlphaImager 2200图像分析软件读取目的条带在X光胶片上测得的光密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组P2X3的蛋白表达量。
1.8实验数据的统计处理：
各组数据以x±sem表示。多组间比较用单因素方差分析，继以最小显著差法(LSD)行两两比较。用SPSS11.0软件包进行数据处理。p＜0.05为差异有显著性。
(二)大黄素对P2X3受体介导三叉神经痛作用研究
2.1动物和分组：
雄性SD大鼠，220-250g，60只，南昌大学医学院实验动物科学部提供。随机将大鼠分为假手术组、三叉神经痛模型组、三叉神经痛模型大黄素处理组、三叉神经痛模型奈福泮处理组和单独大黄素处理对照组。将大黄素以20mg/ml溶于0.5％的羧甲基纤维素钠，再按1∶2的体积比用生理盐水稀释，50mg/kg的大黄素终浓度给予腹腔注射。奈福泮(56.9mg/kg/d)肌肉注射，每天一次至实验结束。
2.2药物与试剂：
大黄素(中国药品生物生物制品检定所中药化学对照品，编号：110756)；奈福泮(山东方明药业股份有限公司，国药准字：H37021048)；乙醚，天津市大茂化学试剂厂(生产批号：050801)；硫喷妥钠，上海新亚药业有限公司(生产批号：050101)；SP试剂盒，DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；P2X3抗体(CHEMICON INTERNATIONAL，美国)；S100抗体(武汉博士德公司)。
2.3主要仪器：
BME-403 Von Frey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)等。
2.4三叉神经痛模型制作
建立眶下神经慢性压迫性损伤大鼠动物模型。测定各组动物脸部机械性异常痛敏。
2.5三叉神经痛大鼠机械痛敏测定：
用BME-403 Von Frey细丝测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱(22×12×22cm3)中，有机玻璃箱底为1×1cm2的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应15min。折力分别为0.13，0.20，0.33，0.60，1.30，3.60，5.00，7.30，9.90，20.1g。从最小折力开始，每根试验10次，直至出现缩足反射次数大约5/10，即50％反应阈值(即引起10次试验中5次反应的值)。最大折力为20.1g，大于此值时记为20.1g。每次试验至少间隔15s，并待刺激引起的反应(如舔足、甩腿等)完全消失。
2.6各组数据以x±sem表示。多组间比较用单因素方差分析，继以最小显著差法(LSD)行两两比较。用SPSS11.0软件包进行数据处理。p＜0.05为差异有显著性。
二、结果
(一)大黄素对P2X3受体介导的神经病理痛作用的研究结果
各组大鼠术后均未见肢体运动障碍和自残现象。
1.1行为学研究：
1.1.1神经病理痛大鼠热痛敏检测：
坐骨神经被结扎4天后神经病理通模型基本形成，Ⅲ组(坐骨神经慢性压迫性损伤组；Chronic constriction injury，CCI)、Ⅴ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素组；CCI+emodin)和Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)的热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)较Ⅰ组(正常对照组，control)、Ⅱ组(假手术组，sham)和Ⅳ组(单独大黄素组，emodin)显著性下降(p＜0.01)，而Ⅰ组(control)、Ⅱ组(sham)和Ⅳ组(emodin)之间相比较无显著性差异(p＞0.05)。Ⅴ组(CCI+emodin)热缩足反射潜伏期与Ⅰ组(control)、Ⅱ组(sham)和Ⅳ组(emodin)之间相比较仍下降(p＜0.01)，但与Ⅲ组(CCI)之间比较显著性增加(p＜0.01)。14d后，Ⅴ组(CCI+emodin)热缩足反射潜伏期与Ⅰ组(control)之间相比较无显著性意义(p＞0.05)，而Ⅲ组(CCI)仍较低(p＜0.01)。坐骨神经被结扎7d后，Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)与CCI组实验大鼠比较其热缩足反射潜伏期增大，有明显差异(p＜0.01)，与Ⅴ组相比无明显差异性(p＞0.05)。见图1。
1.1.2神经病理痛大鼠机械痛敏检测：
坐骨神经被结扎4d后神经病理通模型基本形成，Ⅲ组(Chronic constrictioninjury，CCI)、Ⅴ组(CCI+emodin)和Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)与Ⅰ组(control)、Ⅱ组(sham)和Ⅳ组(emodin)相比，其机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)显著性下降(p＜0.01)，而Ⅰ组(control)、Ⅱ组(sham)和Ⅳ组(emodin)之间相比较无显著性差异(p＞0.05)。坐骨神经被结扎7d后，虽Ⅴ组(CCI+emodin)与Ⅰ组(control)相比，其机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)仍低(p＜0.01)，但与Ⅲ组(CCI)之间比较，机械缩足反射阈值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)已显著性增加(p＜0.01)。坐骨神经被结扎7d后，Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)与CCI组实验大鼠比较其机械缩足反射阈值增大，有明显差异(p＜0.01)，与Ⅴ组相比无明显差异性(p＞0.05)。见图2。
1.1.3免疫组织化学方法测定大鼠背根神经节(DRG)P2X3受体的表达变化：
术后14d，用免疫组织化学方法测定大鼠L4、L5手术侧背根神经节(DRG)P2X3受体的表达。每只大鼠背根神经节L4、L5段切片中隔5张取一张切片，用图像分析系统软件分析P2X3阳性神经细胞的平均光密度值变化。Ⅰ组(正常组，control)、Ⅱ组(假手术组，sham)、Ⅲ组(坐骨神经慢性压迫性损伤组，CCI)、Ⅳ组(单独大黄素组，Emodin)、Ⅴ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素组，CCI+emodin)和Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)的平均光密度值值分别为：110.84±19.86(Control)、112.40±26.76(Sham)、217.02±33.64(CCI)、108.08±20.87(emodin)、123.72±34.24(CCI+emodin)和135.58±32.32(CCI+Indo)(各组n＝10)。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组之间P2X3受体表达无显著性差异(p＞0.05)；Ⅲ组DRG的P2X3受体的表达较Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组明显增加(p＜0.01)；Ⅴ组DRG的P2X3受体的表达较Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组高(p＜0.05)，但和Ⅲ组相比仍较低(p＜0.05)；Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)与CCI组实验大鼠比较P2X3受体表达明显降低(p＜0.01)，Ⅵ组DRG的P2X3受体表达较Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组明显增高(p＜0.01)，但和Ⅳ组相比稍增高(p＜0.05)。见图3。
1.1.4原位杂交方法测定大鼠背根神经节(DRG)P2X3受体mRNA的表达变化：
术后14d，采用原位杂交方法测定大鼠L4、L5段手术侧背根神经节(DRG)P2X3受体mRNA的表达。每只大鼠L4、L5背根神经节切片中隔5张取一张切片，用图像分析系统软件分析P2X3阳性神经细胞的平均光密度值变化。与免疫组织化学实验结果非常相似，Ⅰ组(正常组，control)、Ⅱ组(假手术组，sham)、Ⅲ组(坐骨神经慢性压迫性损伤组，CCI)、Ⅳ组(单独大黄素组，Emodin)、Ⅴ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素组，CCI+emodin)和Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)的平均光密度值值分别为：94.40±21.24(Control)、95.42±17.25(Sham)、171.89±50.27(CCI)、90.12±19.12(emodin)、98.38±13.66(CCI+emodin)、112.53±15.73(CCI+Indo)(各组n＝10)。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组之间P2X3受体表达无显著性差异(p＞0.05)；Ⅲ组DRG的P2X3受体的表达较Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组明显增加(p＜0.01)；Ⅴ组DRG的P2X3受体的表达较Ⅰ组高(p＜0.05)；Ⅵ组与Ⅲ组比较P2X3受体mRNA表达下降(p＜0.05)，与Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组比较表达升高(p＜0.05)。见图4。
1.1.5蛋白印迹检测大鼠背根神经节(DRG)P2X3蛋白表达变化：
于术后14d，用Western Blot方法进一步证实大黄素对CCI大鼠手术侧L4/L5段背根神经节P2X3受体蛋白表达的影响。结果采用AlphaImager 2200图像分析软件，读取目的条带在X光胶片上测得的光密度扫描值，与其对应的β-actin条带的比值作为P2X3蛋白表达的相对水平量。结果显示Ⅰ组(正常组，control)、Ⅱ组(假手术组，sham)、Ⅲ组(坐骨神经慢性压迫性损伤组，CCI)、Ⅳ组(单独大黄素组，Emodin)、Ⅴ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+大黄素组，CCI+emodin)和Ⅵ组(坐骨神经慢性压迫性损伤+消炎痛处理组，CCI+Indocin)的P2X3的蛋白表达量(经对应的β-actin标化后)分别为0.59±0.05(Control)、0.62±0.05(Sham)、1.43±0.37(CCI)、0.54±0.03(emodin)、0.56±0.03(CCI+emodin)、0.68±0.06(CCI+Indo)(各组n＝5)。统计学分析显示，CCI组P2X3蛋白的表达明显高于Ctrl组、Sham组、Ctrl+Emodin组、CCI+Emodin组、CCI+Indocin组(p＜0.01)，Sham组与Ctrl组以及Ctrl+Emodin组和Ctrl组之间相比，P2X3蛋白的表达无显著性差异(p＞0.05)；而CCI+Emodin组与CCI+Indocin组之间相比，DRG的P2X3蛋白的表达相对量更低，但无显著性差异(p＞0.05)；CCI+Emodin组及CCI+Indocin组与CCI组比较，DRG的P2X3蛋白的表达相对量明显下降(p＜0.01)。见图5。
1.1.6RT-PCR检测大鼠背根神经节(DRG)P2X3mRNA的表达
于术后14d，用RT-PCR法检测结扎侧DRG P2X3mRNA的表达，采用凝胶成像分析系统读取目的电泳条带的斑点密度(平均光密度)扫描值，将P2X3条带与其对应的β-actin条带的比值作为P2X3mRNA表达的相对量。结果显示，Ctrl对照组、Sham组、CCI神经病理痛模型组、Ctrl+Emodin组、CCI+Emodin治疗组和CCI+Indo组的大鼠DRG的P2X3mRNA的P2X3mRNA表达相对量(经对应的β-actin标化后)分别为：0.67±0.44(Control)、0.75±0.10(Sham)、0.84±0.14(CCI)、0.70±0.10(emodin)、0.68±0.03(CCI+emodin)、0.76±0.05(CCI+Indo)(各组n＝10)。CCI神经病理痛模型组实验大鼠的背根神经节的P2X3mRNA表达与Ctrl对照组、Sham组、Ctrl+Emodin组相比明显升高，且有显著性意义(p＜0.01)，CCI+Emodin治疗组与CCI神经病理痛模型组DRGP2X3mRNA的表达量相比，CCI+Emodin治疗组实验大鼠DRG的P2X3mRNA的表达显著性下降(p＜0.01)；CCI+Emodin治疗组与CCI+Indo组相比实验大鼠DRG的P2X3mRNA的表达下降，但无统计学意义(p＜0.05)。见图6。
(二)大黄素对P2X3受体介导的三叉神经痛作用的研究结果
2.1.1三叉神经大鼠机械痛敏测定：
用BME-403 Von Frey细丝测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱(22×12×22cm3)中，有机玻璃箱底为1×1cm2的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应15min。折力分别为0.13，0.20，0.33，0.60，1.30，3.60，5.00，7.30，9.90，20.1g，折力≥20.1g时均记为20.1g。从最小折力开始，每根试验10次，直至出现缩足反射次数大于5/10，即50％反应阈值(即引起10次试验中5次反应的值。重复三次，取其平均值)。每次刺激间隔时间至少大于15s，并待刺激引起的反应(如舔足、甩腿等)完全消失。
术后第7天神经病理通模型基本形成，Ⅱ组(三叉神经痛模型组，TrigeminalNeuralgia，TN)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组；TN+emodin)和Ⅳ组(三叉神经痛模型+奈福泮处理组，TN+Nefopam)的机械刺激阈值较Ⅰ组(假手术组对照组，sham)和Ⅴ组(单独大黄素处理组，emodin)显著性下降(p＜0.01)，而Ⅱ组(TN)、Ⅲ组(TN+emodin)和Ⅳ组(TN+Nefopam)之间相比较无显著性差异(p＞0.05)。9d后，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的机械刺激阈值仍低于Ⅰ组和Ⅴ组(p＜0.01)，但Ⅳ组(TN+Nefopam)高于Ⅱ组(p＜0.01)。眶下神经被结扎11d后，Ⅲ组与TN组实验大鼠比较其机械刺激阈值增大(p＜0.05)，与Ⅳ组相比无明显差异性(p＞0.05)，持续至术后15d，TN组大鼠的机械刺激阈值维持在低水平，而与TN+emodin组和TN+Nefopam组大鼠比较均存在显著统计学差异(p＜0.01)。见图7。
2.1.2免疫组化检测大鼠三叉神经节(TG)P2X3表达变化：
随机将SD大鼠(体重200±20g)分为Ⅰ组(假手术组，Sham)、Ⅱ组(三叉神经痛模型组，Trigeminal Neuralgia，TN)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组，TN+Emodin)、Ⅳ组(三叉神经痛模型+奈福泮处理组，TN+Nefopam)和Ⅴ组(单独大黄素处理对照组，Emodin)。于术后14d，用免疫组织化学方法测定大鼠三叉神经节(TG)P2X3受体的表达。免疫组化结果经Hmias-2000高清晰彩色医学图文分析系统分析，结果显示假手术组、三叉神经痛模型组、大黄素处理三叉神经痛模型组、奈福泮处理三叉神经痛模型组和单独大黄素处理对照组的平均光密度值分别为：183.02±23.30(Sham)、330.31±68.27(TN)、193.01±38.81(TN+Emodin)、316.92±51.43(TN+Nefopam)、191.86±28.13(Emodin)(各组n＝10)。Ⅱ(三叉神经痛模型组)明显高于Ⅰ组(假手术组)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组)、Ⅴ组(单独大黄素处理对照组)(p＜0.01)。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达无显著性差异(p＞0.05)；Ⅳ(三叉神经痛模型+奈福泮处理组)与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达相比增高(p＜0.01)，但其与Ⅱ组(三叉神经痛模型组)比较，DRG的P2X3受体的表达量下降(p＜0.05)。见图8。
2.1.3原位杂交检测大鼠三叉神经节(TG)P2X3的mRNA表达变化：
SD大鼠(体重200±20g)随机分为Ⅰ组(假手术组，Sham)、Ⅱ组(三叉神经痛模型组，Trigeminal Neuralgia，TN)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组，TN+Emodin)、Ⅳ组(三叉神经痛模型+奈福泮处理组，TN+Nefopam)和Ⅴ组(单独大黄素处理对照组，Emodin)。
于术后14d，采用原位杂交方法测定大鼠三叉神经节(DRG)P2X3受体mRNA的表达。原位杂交结果经Hmias-2000高清晰彩色医学图文分析系统测定大鼠三叉神经节(TG)P2X3受体的表达。结果显示各组的平均光密度值分别为：83.02±23.30(Sham)、96.77±9.11(TN)、82.17±9.95(TN+Emodin)、90.98±20.09(TN+Nefopam)、79.71±14.09(Emodin)(各组n＝10)。Ⅱ组(三叉神经痛模型组)明显高于Ⅰ组(假手术组)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组)、Ⅴ组(单独大黄素处理对照组)(p＜0.01)。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达无显著性差异(p＞0.05)；Ⅳ(三叉神经痛模型+奈福泮处理组)与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达相比增高(p＜0.01)，但其与Ⅱ组(三叉神经痛模型组)比较，DRG的P2X3受体的表达量下降(p＜0.05)。见图9。
2.1.4蛋白印迹检测大鼠三叉神经节(TG)P2X3蛋白表达变化：
SD大鼠(体重200±20g)随机分为Ⅰ组(假手术组，Sham)、Ⅱ组(三叉神经痛模型组，Trigeminal Neuralgia，TN)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组，TN+Emodin)、Ⅳ组(三叉神经痛模型+奈福泮处理组，TN+Nefopam)和Ⅴ组(单独大黄素处理对照组，Emodin)。于术后14d，采用蛋白印迹检测大鼠三叉神经节(TG)P2X3蛋白表达变化。
结果通过Alpha Imager 2200图像分析软件读取目的条带在X光胶片上测得的光密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组P2X3的蛋白表达量。结果显示，假手术组(Sham)、三叉神经痛模型组(Trigeminal Neuralgia，TN)、三叉神经痛模型+大黄素处理组(TN+Emodin)、三叉神经痛模型+奈福泮处理组(TN+Nefopam)和单独大黄素处理对照组(Emodin)的P2X3的蛋白表达量(经对应的β-actin标化后)分别为：0.79±0.08(Sham)、0.97±0.02(TN)。0.81±0.06(TN+Emodin)，0.89±0.03(TN+Nefopam)、0.72±0.05(Emodin)。Ⅱ组(三叉神经痛模型组)明显高于Ⅰ组(假手术组)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组)、Ⅴ组(单独大黄素处理对照组)(p＜0.01)。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达无显著性差异(p＞0.05)；Ⅳ(三叉神经痛模型+奈福泮处理组)与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达相比增高(p＜0.05)，但其与Ⅱ组(三叉神经痛模型组)比较，DRG的P2X3受体的表达量下降(p＜0.05)。见图10。
2.1.5RT-PCR检测大鼠三叉神经节(TG)P2X3的mRNA表达变化：
随机将SD大鼠(体重200±20g)分为Ⅰ组(假手术组，Sham)、Ⅱ组(三叉神经痛模型组，Trigeminal Neuralgia，TN)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组，TN+Emodin)、Ⅳ组(三叉神经痛模型+奈福泮处理组，TN+Nefopam)和Ⅴ组(单独大黄素处理对照组，Emodin)。
引物设计：选用β-actin作为内参，引物序列如下：
Primer P2X3(产物长度为519bp)
S 5’-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3’
A 5’-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3’
Primer β-actin(产物长度为240bp)
S 5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’
A 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’
于术后14d，用RT-PCR法检测结扎侧TG P2X3mRNA的表达，采用凝胶成像分析系统读取目的电泳条带的斑点密度(平均光密度)扫描值，将P2X3条带与其对应的β-actin条带的比值作为P2X3mRNA表达的相对量。结果显示，假手术组(Sham)、三叉神经痛模型组(Trigeminal Neuralgia，TN)、三叉神经痛模型+大黄素处理组(TN+Emodin)、三叉神经痛模型+奈福泮处理组(TN+Nefopam)和单独大黄素处理对照组(Emodin)的大鼠TG的P2X3mRNA表达相对量(经对应的β-actin标化后)分别为：0.89±0.08(Sham)、1.03±0.03(TN)、0.86±0.02(TN+Emodin)、0.95±0.01(TN+Nefopam)、0.84±0.07(Emodin)(各组n＝5)。Ⅱ组(三叉神经痛模型组)明显高于Ⅰ组(假手术组)、Ⅲ组(三叉神经痛模型+大黄素处理组)、Ⅴ组(单独大黄素处理对照组)(p＜0.01)。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达无显著性差异(p＞0.05)；Ⅳ(三叉神经痛模型+奈福泮处理组)与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组之间P2X3受体表达相比增高(p＜0.01)，但其与Ⅱ组(三叉神经痛模型组)比较，DRG的P2X3受体的表达量下降(p＜0.05)。见图11。
申请人实验室的研究发现单独用大黄素可减轻神经病理痛大鼠的痛行为反应。根据大黄素减小神经病理痛大鼠背根神经节神经细胞和三叉神经痛大鼠三叉神经节神经细胞P2X3受体mRNA和蛋白的表达，表明大黄素减轻疼痛的作用机理是阻断P2X3受体介导的疼痛信息传递，具有防治疼痛的作用。此外，由于P2X3嘌呤受体涉及神经系统多种疾病的发病，大黄素可能通过影响P2X3受体介导的神经信号传递对神经系统疾病产生防治作用。
实施例1：
用本技术领域公知的方法，制成适用于神经病理痛治疗的口服、注射或局部应用(如局敷)的大黄素制剂。与非甾体类抗炎镇痛药消炎痛处理组大鼠实验结果相比表明：大黄素是作用于P2X3受体产生镇痛效应。相对于阿片类等镇痛药物的副作用大、易产生药物耐受与依赖以及戒断综合征，消炎痛等抗炎镇痛药毒副作用大等不足之处，大黄素作为中药有效成份毒副作用小，更利于其作为镇痛药物的开发应用。
实施例2：
大黄素抑制大鼠三叉神经节神经细胞P2X3受体mRNA和蛋白的表达，影响三叉神经节神经细胞介导的疼痛。用本技术领域公知的方法，可制成适用于三叉神经节神经细胞介导疼痛治疗的口服、注射或局部应用(如局敷)的大黄素制剂。
实施例3：
用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及P2X3受体介导神经系统疾病治疗的口服、注射或局部应用(如局敷)的大黄素制剂。消炎痛及奈福泮可明显减轻大鼠的痛敏反应，但消炎痛及奈福泮对CCI神经病理痛模型大鼠及三叉神经痛大鼠背根初级感觉神经细胞和三叉神经初级感觉神经细胞P2X3受体表达的影响低于大黄素处理组，显示大黄素的镇痛作用机理与消炎痛及奈福泮不同，大黄素可通过降低P2X3受体表达产生作用，进而表明大黄素可能成为P2X3受体介导神经系统疾病防治的药物。
Claims (4)
1.单独用大黄素在制备用于治疗涉及P2X3受体介导的慢性痛的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述慢性痛为神经病理痛。
3.大黄素在制备用于治疗涉及三叉神经节神经细胞P2X3受体介导疼痛的药物中的应用。
4.大黄素在制备治疗涉及P2X3受体介导的神经系统疾病防治药物中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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