CN101869065A - 紫三叶的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及紫三叶的组织培养方法，包括无菌材料的获得，芽的分化和增殖，不定芽壮苗培养，生根培养，炼苗与移栽等步骤。与现有技术相比，本发明大大提高了紫三叶的繁殖速度和苗的整齐度，并提高了其性状的稳定性，可实现育苗的工厂化大批量生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养方法，尤其是涉及紫三叶的组织培养方法。
背景技术
紫三叶为豆科车轴草属植物，原产于温带及亚热带地区，为多年生草本，指状复叶通常有3片小叶，小叶近无柄，常有齿缺，小叶呈紫红色与绿色相间，是一种良好的花镜材料。但是作为国外引进的新品种，紫三叶初期引种数量较少，因此种苗供应受到一定限制。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可提高繁殖速度和苗的整齐度，并提高性状稳定性的紫三叶的组织培养方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
紫三叶的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)无菌材料的获得
取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗1-3h后于超净工作台上，依次利用质量浓度为70-75％的乙醇浸泡10-50s，体积浓度为0.5-2‰的汞浸泡10-30min，再用无菌水冲洗4-6次，利用无菌滤纸吸干芽表面的水分后，将芽切成0.5-2cm长的带腋芽的节段，节段接种于芽诱导培养基上；
(2)芽的分化和增殖
节段接种于芽诱导培养基上1-3周后，小芽部位开始膨大，出现绿色突起，2-3周后可见芽分生组织，再培养1-2个月，小芽可以长到2-3cm，将小芽切下转入芽的增殖培养基中进行增殖培养，小芽的分化较多，但生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；
(3)不定芽壮苗培养
在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有3-4株能够伸长，其余的处于矮化状态，将丛生芽分成小丛后，转至壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长，15-30天后可以长至1.5-3cm；
(4)生根培养
取1.5-3cm的不定芽小植株，转接入生根培养基中诱导生根，5-15天后幼苗基部分化出白色的根原基，15-30天后可以长至2-3cm，根系粗壮，须根众多，生根率为90-100％；
(5)炼苗与移栽
生根培养15-30天，根系长至0.5-1cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶炼苗1-4天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化20-40天，即可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为90-100％。
所述的芽诱导培养基包括MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.1-0.3mg/L。
所述的芽诱导培养基优选MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。
所述的芽的增殖培养基包括MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L。
所述的芽的增殖培养基优选MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。
所述的壮苗培养基包括MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L。
所述的壮苗培养基优选MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。
所述的生根培养基包括MS+NAA0.05-0.2mg/L。
所述的生根培养基优选MS+NAA0.1mg/L。
所述的培养基还包括蔗糖20-40g/L、琼脂粉4-8g/L，培养基pH5.5-6.0，培养温度24-26℃，光照1500-2500lx。
与现有技术相比，本发明通过组培技术，极大提高了紫三叶的繁殖速度和苗的整齐度，并提高了其性状的稳定性，可实现育苗的工厂化大批量生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)无菌材料的获得
取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗1h后于超净工作台上，依次利用质量浓度为70％的乙醇浸泡10s，体积浓度为0.5‰的汞浸泡10min，再用无菌水冲洗4次，利用无菌滤纸吸干芽表面的水分后，将芽切成0.5cm长的带腋芽的节段，节段接种于包括MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的芽诱导培养基上；
(2)芽的分化和增殖
节段接种于芽诱导培养基上1周后，小芽部位开始膨大，出现绿色突起，2周后可见芽分生组织，再培养1个月，小芽可以长到2cm，将小芽切下转入包括MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的芽的增殖培养基中进行增殖培养，小芽的分化较多，但生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；
(3)不定芽壮苗培养
在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有3株能够伸长，其余的处于矮化状态，将丛生芽分成小丛后，转至包括MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长，15天后可以长至1.5cm；
(4)生根培养
取1.5cm的不定芽小植株，转接入包括MS+NAA0.05mg/L的生根培养基中诱导生根，5天后幼苗基部分化出白色的根原基，15天后可以长至2cm，根系粗壮，须根众多，生根率为90％；
(5)炼苗与移栽
生根培养15天，根系长至0.5cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶炼苗1天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化20天，即可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为90％。
上述各种情况的培养基还包括蔗糖20g/L、琼脂粉4g/L，pH＝5.5，培养温度24℃，光照1500lx。
实施例2
(1)无菌材料的获得
取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗2h后于超净工作台上，依次利用质量浓度为75％的乙醇浸泡30s，体积浓度为1‰的汞浸泡15min，再用无菌水冲洗5次，利用无菌滤纸吸干芽表面的水分后，将芽切成1cm长的带腋芽的节段，节段接种于包括MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的芽诱导培养基上；
(2)芽的分化和增殖
节段接种于芽诱导培养基上2周后，小芽部位开始膨大，出现绿色突起，3周后可见芽分生组织，再培养1个半月，小芽可以长到3cm，将小芽切下转入包括MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的芽的增殖培养基中进行增殖培养，小芽的分化较多，但生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；
(3)不定芽壮苗培养
在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有4株能够伸长，其余的处于矮化状态，将丛生芽分成小丛后，转至包括MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L的壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长，20天后可以长至2cm；
(4)生根培养
取1.5cm的不定芽小植株，转接入包括MS+NAA0.05mg/L的生根培养基中诱导生根，5天后幼苗基部分化出白色的根原基，25天后可以长至2cm，根系粗壮，须根众多，生根率为90％；
(5)炼苗与移栽
生根培养20天，根系长至1cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶炼苗3天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化30天，即可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为100％。
上述各种情况的培养基还包括蔗糖30g/L、琼脂粉6g/L，pH＝5.8，培养温度25℃，光照2000lx。
实施例3
(1)无菌材料的获得
取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗3h后于超净工作台上，依次利用质量浓度为75％的乙醇浸泡50s，体积浓度为1‰的汞浸泡30min，再用无菌水冲洗6次，利用无菌滤纸吸干芽表面的水分后，将芽切成2cm长的带腋芽的节段，节段接种于包括MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L的芽诱导培养基上；
(2)芽的分化和增殖
节段接种于芽诱导培养基上3周后，小芽部位开始膨大，出现绿色突起，4周后可见芽分生组织，再培养2个月，小芽可以长到3cm，将小芽切下转入包括MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的芽的增殖培养基中进行增殖培养，小芽的分化较多，但生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；
(3)不定芽壮苗培养
在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有4株能够伸长，其余的处于矮化状态，将丛生芽分成小丛后，转至包括MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L的壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长，30天后可以长至2cm；
(4)生根培养
取2cm的不定芽小植株，转接入包括MS+NAA0.2mg/L的生根培养基中诱导生根，15天后幼苗基部分化出白色的根原基，30天后可以长至2.5cm，根系粗壮，须根众多，生根率为93％；
(5)炼苗与移栽
生根培养30天，根系长至1cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶炼苗4天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化40天，即可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为96％。
上述各种情况的培养基还包括蔗糖40g/L、琼脂粉8g/L，pH＝6.0，培养温度26℃，光照2500lx。
Claims (10)
1.紫三叶的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)无菌材料的获得
取萌发的幼嫩的芽，去除外面包裹的叶片后，用自来水冲洗1-3h后于超净工作台上，依次利用质量浓度为70-75％的乙醇浸泡10-50s，体积浓度为0.5-2‰的汞浸泡10-30min，再用无菌水冲洗4-6次，利用无菌滤纸吸干芽表面的水分后，将芽切成0.5-2cm长的带腋芽的节段，节段接种于芽诱导培养基上；
(2)芽的分化和增殖
节段接种于芽诱导培养基上1-3周后，小芽部位开始膨大，出现绿色突起，2-3周后可见芽分生组织，再培养1-2个月，小芽可以长到2-3cm，将小芽切下转入芽的增殖培养基中进行增殖培养，小芽的分化较多，但生长迅速且无玻璃化等不良现象，在培养基中生长发育良好；
(3)不定芽壮苗培养
在芽的增殖培养基上，诱导出的丛生芽中每丛有3-4株能够伸长，其余的处于矮化状态，将丛生芽分成小丛后，转至壮苗培养基上生长，不定芽迅速伸长，15-30天后可以长至1.5-3cm；
(4)生根培养
取1.5-3cm的不定芽小植株，转接入生根培养基中诱导生根，5-15天后幼苗基部分化出白色的根原基，15-30天后可以长至2-3cm，根系粗壮，须根众多，生根率为90-100％；
(5)炼苗与移栽
生根培养15-30天，根系长至0.5-1cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，于室内开瓶炼苗1-4天，然后将苗取出，洗净根部的琼脂，栽于温室内的苗床中驯化20-40天，即可移栽室外，给予肥水管理，最终的移栽成活率为90-100％。
2.根据权利要求1所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的芽诱导培养基包括MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.1-0.3mg/L。
3.根据权利要求2所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的芽诱导培养基优选MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。
4.根据权利要求1所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的芽的增殖培养基包括MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L。
5.根据权利要求4所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的芽的增殖培养基优选MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。
6.根据权利要求1所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的壮苗培养基包括MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L。
7.根据权利要求6所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的壮苗培养基优选MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。
8.根据权利要求1所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基包括MS+NAA0.05-0.2mg/L。
9.根据权利要求8所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基优选MS+NAA0.1mg/L。
10.根据权利要求2或4或6或8所述的紫三叶的组织培养方法，其特征在于，所述的培养基还包括蔗糖20-40g/L、琼脂粉4-8g/L，培养基pH5.5-6.0，培养温度24-26℃，光照1500-2500lx。
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