CN101862452A - 一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法 - Google Patents

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本发明涉及一种抗血清制剂的制备方法，为了提高猪多联抗血清制品的预防效果，本发明提供一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法，是将黄芪多糖在121℃、100KPa条件下灭菌60分钟，灭菌后的黄芪多糖溶液加入到含有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的抗血清中形成猪多联抗血清复合溶液，并使黄芪多糖在该复合溶液中的质量浓度为1%，再使用60Co-γ射线辐照该猪多联抗血清复合溶液制得猪多联抗血清复合制剂，辐照温度为15～25℃，辐照剂量率为5～20Gy/min，辐照吸收剂量为9～19kGy。本发明所述的方法操作简便、成本低廉、既能保护抗体活性、还能增强机体自身免疫反应，使其达到良好的紧急预防免疫效果。

Description

一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗血清制剂的制备方法，具体是一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法。
背景技术
猪多联抗血清是一种针对某些特定病毒的综合性抗体，注射后可以快速提高机体特定病毒抗体水平，使机体短时期内获得针对这些特定病毒的被动性免疫，是这些特定病毒性疾病的紧急免疫手段。但是由于猪多联抗血清中可能存在有包括细菌、病毒和支原体等外源微生物，使用后可能给猪群带来其他细菌和病毒性疾病，所以需要一种抗血清中病毒、细菌及支原体等的灭活技术来保证猪多联抗血清的安全性。
目前抗血清制品主要采用超速离心、膜过滤、亲和吸附柱过滤去除外源微生物。超速离心法可以将抗血清与外源微生物分离，但是存在成本大、血清得率低、安全性偏低并且不易生产扩大化的缺点，很难运用于实际生产中；授权公告号为CN1325061C的发明专利所述的血浆制剂或血清制剂及其制造方法采用膜过滤技术可以将大于膜孔直径的病毒完全分离，达到去除血清中外源病毒的作用，但是存在技术设备要求高、成本大、操作繁琐且周期长的缺点；公开号为CN101628135A的发明专利公开的特异性清除血液中病毒粒子的亲和吸附柱及其制备方法中采用亲和吸附柱过滤技术能够完全去除某一个特定血清外源病毒，效果好、操作简便、成本低、可重复性好，但是其具有特异性强，只能去除某特定外源病毒，猪多联抗血清制品的外源微生物具有不可知性，所以该项技术难以应用于猪多联抗血清制品外源微生物的去除。
黄芪多糖是从中草药黄芪中提取的一种有效成分，具有抗菌抗病毒功效，其可以显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，能激活机体B细胞转化为浆细胞，分泌抗体，还可以刺激机体T细胞的分化和成熟，参与免疫应答反应，并且可以诱导机体产生干扰素、白介素等细胞因子，增强机体抗病能力，是一种很好的免疫调节剂，临床上已得到广泛的应用。
许多研究表明，多糖对免疫球蛋白有良好的保护作用，其作用机制是多糖能够包裹在免疫球蛋白周围并且填充在免疫球蛋白功能结构内，特别是活性部位，有效防止免疫球蛋白分子发生三维结构的变化，从而避免了免疫球蛋白分子活性的丢失。
发明内容
为了提高猪多联抗血清制品的预防效果，并且为了克服现有猪多联抗血清制品中外源微生物分离技术成本大、技术设备要求高以及病毒、细菌及支原体灭活效果差等缺点，本发明提供一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法。
解决上述技术问题，本发明所述的一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法，是将黄芪多糖在121℃、100kPa条件下灭菌60分钟，灭菌后的黄芪多糖溶液加入到含有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的抗血清中形成猪多联抗血清复合溶液，并使黄芪多糖在该复合溶液中的质量浓度为1%，再使用60Co-γ射线辐照该猪多联抗血清复合溶液制得猪多联抗血清复合制剂，辐照温度为15～25℃，辐照剂量率为5～20Gy/min，辐照吸收剂量为9～19kGy。
为取得更好的效果，优选的辐照条件是：辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
该猪多联抗血清复合制剂选用黄芪多糖作为抗体保护剂及免疫增强剂，其与猪多联抗血清配合，首先其可以包裹在抗体周围形成保护层，在60Co-γ射线辐照该复合制剂时保护抗体活性，其次黄芪多糖能够激活机体免疫系统，增强B细胞、T细胞的活化，增强其他吞噬细胞的杀伤作用，并且促进细胞分泌各种免疫因子（干扰素等），抑制病毒繁殖。
通过抽取高免猪的血液，再取血清就可以得到猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的抗血清。本发明用60Co-γ射线辐照猪多联抗血清复合制剂灭活病毒、细菌及支原体的原理是：在辐照过程中，60Co释放出的γ射线穿透西林瓶，作用于外源病毒、细菌及支原体，直接或间接破坏其DNA、RNA、蛋白质和酶等生命至关重要的物质，从而杀死病毒、细菌及支原体。直接作用是指γ射线辐照病毒、细菌及支原体内的核糖核酸、蛋白质和酶分子，使其激发或电离，激发态分子的共价键断裂或与其它分子反应经电子传递产生自由基，导致它们分子结构破坏而死亡。间接作用是指γ射线能量被病毒、细菌及支原体内生命重要分子的周围物质如水吸收而激发或电离，产生激发的水分子、电子或水离子，或裂解为氢自由基、羟自由基，由此产生一系列与核糖核酸、蛋白质、酶进行氧化还原等反应，致病毒、细菌及支原体死亡。各种微生物之间，对辐照敏感性差异很大，革兰氏阴性菌对辐照敏感，有一些革兰氏阳性菌对辐照异常顽固。芽孢比生长的细胞更能抗辐照。病毒比细菌芽孢对辐照更具有抵抗力，其抗辐照性能随着微生物个体的减少而增大，芽孢的抗辐照性能按次序比细菌、酵母、霉菌更强些。
辐照吸收剂量对病毒、细菌及支原体的灭活效果具有至关重要的影响，超出条件范围或者达不到灭活效果，或者会破坏抗血清本身的有效成分。药典中已将60Co-γ射线辐照作为一种辐照灭菌方法，常用的灭菌辐照吸收剂量为25kGy，该项灭菌技术已广泛应用于中药材、中成药、抗生素、维生素等的灭菌，但在抗血清制品灭菌中还未见报道，就是由于辐照吸收剂量影响抗体效价和灭菌效果，辐照吸收剂量过大时虽然能达到灭菌效果，但抗体效价衰减过多，辐照吸收剂量过小时抗体效价衰减不明显，但灭菌效果不佳，所以既要保证灭菌效果，又要保证抗体效价不衰减，辐照灭菌吸收剂量难以确定。本发明组成员通过长期努力，经过大量实验确定了一种猪多联抗血清复合制剂的辐照条件，辐照过程在普通的室温条件下进行，可以有效地杀灭猪多联抗血清复合制剂中的病毒、细菌及支原体。
本发明对辐照吸收剂量分组进行了筛选，分别选取了三个辐照吸收剂量组：2～8kGy，9～19kGy，20～25kGy。短小芽孢杆菌孢子是60Co-γ射线辐照灭菌法的生物指示剂，所以选用短小芽孢杆菌作为辐照吸收剂量筛选指示剂。将短小芽孢杆菌孢子片（107个）与猪多联抗血清复合制剂共同装于10ml西林瓶中，每瓶一片短小芽孢杆菌孢子片及10ml猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217），并设不辐照阳性对照组，分别进行三组辐照吸收剂量组的辐照灭菌，辐照温度为15～25℃，辐照剂量率为5～20Gy/min，辐照后分别用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪多联抗血清复合制剂中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒抗体效价水平，并且将短小芽孢杆菌孢子片取出放入胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中35℃培养，每日观察情况，共培养7日。结果为下表：
表1：不同辐照区间三种病毒抗体OD值 
 抗体OD值  抗体OD值  抗体OD值
辐照吸收剂量 2～8kGy 9～19kGy 20～25kGy
猪瘟病毒 2.858～2.821 2.791～2.482 1.599～0.392
猪繁殖与呼吸综合征病毒 3.029～2.988 2.900～2.547 1.665～0.443
猪伪狂犬病病毒 2.193～2.111 2.101～1.672 0.759～0.301
辐照吸收剂量为2～8kGy的猪多联抗血清复合制剂三种病毒抗体OD值变化不明显，培养短小芽孢杆菌孢子片的培养基48小时时浑浊；辐照吸收剂量为9～19kGy的猪多联抗血清复合制剂三种病毒抗体OD值下降幅度不大，培养短小芽孢杆菌孢子片的培养基7日后仍澄清透明；辐照吸收剂量为20～25kGy的猪多联抗血清复合制剂三种病毒抗体OD值急剧下降，抗体效价损失严重，培养短小芽孢杆菌孢子片培养基7日后仍澄清透明；不辐照阳性对照组三种病毒抗体OD值仍为原先值，不变，培养短小芽孢杆菌孢子片培养基24小时时浑浊。通过实验结果可以看出当辐照吸收剂量为20～25kGy时，虽然能够达到猪多联抗血清复合制剂杀灭短小芽孢杆菌孢子的要求但是猪多联抗血清复合制剂抗体效价急剧下降，故不能作为猪多联抗血清复合制剂杀灭病毒、细菌及支原体的辐照吸收剂量；当辐照吸收剂量为2～8kGy时，虽然猪多联抗血清复合制剂抗体效价变化不明显，但是未能达到猪多联抗血清复合制剂杀灭短小芽孢杆菌孢子的要求，故也不能作为猪多联抗血清复合制剂杀灭病毒、细菌和支原体的辐照吸收剂量；只有在辐照吸收剂量为9～19kGy时，既能达到猪多联抗血清复合制剂杀灭病毒、细菌和支原体的要求，又能使猪多联抗血清复合制剂抗体效价下降幅度不大，故该辐照吸收剂量为最佳剂量。
以下是60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中抗体效价的影响所做的实验，取猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）分别分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，将分装后的猪多联抗血清复合制剂用60Co-γ射线辐照，辐照吸收剂量分别为9kGy，10kGy，11kGy，12kGy，13kGy，14kGy，15kGy，16kGy，17kGy，18kGy，19kGy，辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min。辐照后分别用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪多联抗血清复合制剂中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒抗体效价水平，结果如下表2、3、4所示。
表2：猪瘟病毒抗体OD值
辐照吸收剂量 9kGy 10kGy 11kGy 12kGy 13kGy 14kGy
抗体OD值 2.791 2.775 2.751 2.720 2.697 2.655
辐照吸收剂量 15kGy 16kGy 17kGy 18kGy 19kGy
抗体OD值 2.607 2.579 2.534 2.501 2.482
表3：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值
辐照吸收剂量 9kGy 10kGy 11kGy 12kGy 13kGy 14kGy
抗体OD值 2.900 2.871 2.846 2.805 2.771 2.734
辐照吸收剂量 15kGy 16kGy 17kGy 18kGy 19kGy
抗体OD值 2.702 2.664 2.621 2.586 2.547
表4：猪伪狂犬病病毒抗体OD值
辐照吸收剂量 9kGy 10kGy 11kGy 12kGy 13kGy 14kGy
抗体OD值 2.101 1.987 1.959 1.941 1.918 1.892
辐照吸收剂量 15kGy 16kGy 17kGy 18kGy 19kGy
抗体OD值 1.867 1.842 1.817 1.785 1.672
从表2、3、4可见9～19kGy中的任意一个辐照吸收剂量都可以作为猪多联抗血清复合制剂病毒、细菌和支原体的灭菌剂量，其对血清抗体效价影响不明显。在以上条件范围之内，从大量实验中优选的辐照条件是：辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
本发明所述的猪多联抗血清复合制剂注射猪体能够使猪体迅速具有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体及猪伪狂犬病病毒抗体，使猪体达到被动免疫的效果；该猪多联抗血清复合制剂并同时具有增强机体免疫机能的作用，使猪能够更好的抵抗病毒性疾病的发生，而且通过60Co-γ射线辐技术不会有外源病毒和细菌感染的危险，该方法可以杀灭猪多联抗血清复合制剂中的病毒、细菌及支原体，辐照后的西林瓶呈棕褐色，此灭活病毒、细菌和支原体的技术较膜过滤、亲和吸附柱过滤技术成本降低约70%，操作极其简便，并且对猪多联抗血清复合制剂的抗体效价影响小，同时，在原有猪多联抗血清的基础上加入抗体保护剂及免疫调节剂——黄芪多糖。本发明所述的方法操作简便、成本低廉、既能保护抗体活性、还能增强机体自身免疫反应，使其达到良好的紧急预防免疫效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，实施例1为本发明的制备方法，实施例2-7是猪多联抗血清复合制剂的病毒、细菌和支原体的灭活实验。
实施例1
制备1L猪多联抗血清复合制剂
黄芪多糖10g加热溶于50ml注射用水中，调pH值为6～7之间,过滤除杂，然后在121℃、100kPa条件下进行高温高压灭菌60分钟，取出灭菌后的黄芪多糖与950ml猪多联抗血清混合，搅匀，分装于10ml西林瓶中，压盖，用60Co-γ射线辐照，辐照条件是：辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy）。
实施例2
60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中猪瘟病毒的灭活
取猪瘟石门系血毒与猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）1:1混合，混合后猪瘟病毒抗体OD值为1.896，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为2.214，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为1.548，其最小致死量为105/ml，分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，同时设接毒对照组即接毒不辐照猪多联抗血清复合制剂组。辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy），辐照完后，三组用猪瘟抗原胶体金快速检测试剂检测猪多联抗血清复合制剂中的猪瘟病毒，实验组显示为阴性，接毒对照组显示为阳性，表明60Co-γ射线能够将猪多联抗血清复合制剂中的猪瘟病毒灭活。
实施例3
60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中口蹄疫病毒的灭活
取口蹄疫病毒OS/99株毒液与猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）1:1混合，混合后猪瘟病毒抗体OD值为1.896，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为2.214，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为1.548，其半数感染量为104ID50/0.2ml，分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，同时设接毒对照组即接毒不辐照猪多联抗血清复合制剂组。辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy），辐照完后，用反向间接血凝试验(RIHA)检测猪多联抗血清复合制剂中的口蹄疫病毒，实验组无血球凝集现象，接毒对照组出现血球凝集现象。表明60Co-γ射线能够将猪多联抗血清复合制剂中的口蹄疫病毒灭活。
实施例4
60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活
取猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株毒液与猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）1:1混合，混合后猪瘟病毒抗体OD值为1.896，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为2.214，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为1.548，其半数感染量为105.18TCID50/0.1ml，分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，同时设接毒对照组即接毒不辐照猪多联抗血清复合制剂组。辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy），辐照完后，将实验组、接毒对照组的猪多联抗血清复合制剂分别接种生长良好的Marc-145细胞单层的96孔细胞培养板上（接种前弃去生长液），每孔200μl，同时设正常细胞对照组，置37℃、5％CO2培养箱中培养5日，可见实验组、正常细胞对照组均没有出现CPE（细胞病变），而接毒对照组出现了CPE（细胞病变），表明60Co-γ射线能够将猪多联抗血清复合制剂中的猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活。
实施例5
60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中猪伪狂犬病病毒的灭活
取猪伪狂犬病病毒BarthaK61株毒液与猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）1:1混合，混合后猪瘟病毒抗体OD值为1.896，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为2.214，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为1.548，其半数感染量为50ID50/0.2ml，分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，同时设接毒对照组即接毒不辐照猪多联抗血清复合制剂组。辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy），辐照完后，将实验组、接毒对照组的猪多联抗血清复合制剂通过绒毛尿囊膜接种鸡胚，在37℃恒温培养箱中培养4天，观察结果，可见接毒对照组鸡胚死亡且膜表面有隆起的痘斑样病变，实验组鸡胚发育正常，表明60Co-γ射线能够将猪多联抗血清复合制剂中的猪伪狂犬病病毒灭活。
实施例6
60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中猪肺炎支原体的灭活
取猪肺炎支原体168弱毒菌株（菌数为106CCU）与猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）1:1混合，混合后猪瘟病毒抗体OD值为1.896，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为2.214，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为1.548，分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，同时设接菌对照组即接菌不辐照猪多联抗血清复合制剂组。辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy），辐照完后，将实验组、接菌对照组的猪多联抗血清复合制剂分别接种于含有酚红的KM2培养基(pH值为7.2～7.6)，37℃恒温培养箱中培养，观察15日，可见实验组培养基颜色无变化，仍为红色，而接菌对照组培养基在24小时后变为黄色。表明60Co-γ射线能够将猪多联抗血清复合制剂中的猪肺炎支原体灭活。
实施例7
60Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中大肠杆菌的灭活
取大肠杆菌ASI.90菌种（菌数为1×108）与猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）1:1混合，混合后猪瘟病毒抗体OD值为1.896，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为2.214，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为1.548，分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，同时设接菌对照组即接菌不辐照猪多联抗血清复合制剂组。辐照温度20℃（或15℃或25℃或17℃），辐照剂量率为13.8Gy/min（或5Gy/min或20Gy/min或15Gy/min），辐照吸收剂量为12kGy（或9kGy或19kGy或15kGy），辐照完后，用平板倾注稀释分离法，将各组样品接种于麦康凯琼脂平皿上测定大肠杆菌数。每种剂量三个适宜稀释度，每个稀释度三个重复，37℃恒温培养24～36h，观察计数，取平均数。实验组大肠杆菌活菌数为0个/ml，接菌对照组大肠杆菌活菌数为1.86×108个/ml，表明60Co-γ射线能够将猪多联抗血清复合制剂中的大肠杆菌灭活。

Claims (2)

1.一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法，其特征在于：是将黄芪多糖在121℃、100kPa条件下灭菌60分钟，灭菌后的黄芪多糖溶液加入到含有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的抗血清中形成猪多联抗血清复合溶液，并使黄芪多糖在该复合溶液中的质量浓度为1%，再使用60Co-γ射线辐照该猪多联抗血清复合溶液制得猪多联血清复合制剂，辐照温度为15～25℃，辐照剂量率为5～20Gy/min，辐照吸收剂量为9～19kGy。
2.根据权利要求1所述的一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法，其特征在于：辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
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