CN101835899A

CN101835899A - 调节端粒酶活性的化合物的鉴定方法

Info

Publication number: CN101835899A
Application number: CN200880112672A
Authority: CN
Inventors: 埃曼努埃尔·斯科达拉克斯
Original assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 2007-10-22
Filing date: 2008-10-21
Publication date: 2010-09-15
Also published as: CA2703060A1; WO2009055364A1; US20100158798A1; US20100216150A1; US20100248280A1; EP2205759A1; US8518940B2; JP2011500087A; US8234080B2; US8374838B2; EP2205759A4; AU2008317002A1

Abstract

本发明涉及用于鉴定调节端粒酶活性的化合物的方法。本发明的化合物，通过设计或筛选与端粒酶的TRBD、“拇指”、“手指”和/或“手掌”结构域的至少一个氨基酸残基结合的化合物，并测试化合物调节端粒酶活性的能力，来进行鉴定。

Description

调节端粒酶活性的化合物的鉴定方法

发明简介

本申请要求2008年8月21日提交的美国临时专利申请系列号No.61/090,726，以及2007年10月22日提交的系列号No.60/981,548的优先权，它们的内容在此以其全文引为参考。

发明背景

任何具有线性染色体的生物体，在维持其DNA的末端序列中都面临一个严重的障碍，通常被称为“末端复制问题”(Blackburn(1984)Annu.Rev.Biochew.53：163-194；Cavalier-Smith(1974)Nature250：467-470；Cech & Lingner(1997)Ciba Found.Symp.211：20-34；Lingner等，(1995)Science 269：1533-1534；Lundblad(1997)Nat.Med.3：1198-1199；Ohki等，(2001)Mol.Cell.Biol.21：5753-5766)。真核细胞通过使用被称为端粒酶的特化的DNA聚合酶解决这个问题。端粒酶向线性染色体的3’-末端添加串联的、富含G的DNA重复序列(端粒)，用于保护染色体免于遗传信息的丧失、染色体端对端融合、遗传不稳定性和衰老(Autexier & Lue(2006)Annu.Rev.Biochem.75：493-517；Blackburn & Gall(1978)J.Mol.Biol.120：33-53；Chatziantoniou(2001)Pathol.Oncol.Res.7：161-170；Collins(1996)Curr.Opin.Cell Biol.8：374-380；Dong等，(2005)Crit.Rev.Oncol.Hematol.54：85-93)。

核心端粒酶全酶是RNA依赖性的DNA聚合酶(TERT)，与用作模板添加端粒序列的RNA分子(TER)配对(Blackburn(2000)Nat.Struct.Biol.7：847-850；Lamond(1989)Trends Biochem.Sci.14：202-204；Miller& Collins(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6585-6590；Miller等，(2000)EMBO J.19：4412-4422；Shippen-Lentz & Blackburn(1990)Science 247：546-552)。TERT由4个功能性结构域构成，其中一个与HIV反转录酶(RT)具有相似性，因为它包含该蛋白家族标志性的重要标志基序(Autexier & Lue(2006)，同上；Bryan等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8479-8484；Lee等，(2003)J.Biol.Chem.278：52531-52536；Peng等，(2001)Mol.Cell 7：1201-1211)。含有端粒酶活性位点的RT结构域被认为参与了与RNA模板的松散结合(Collins & Gandhi(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8485-8490；Jacobs等，(2005)Protein Sci.14：2051-2058)。但是，与其他反转录酶相比，TERT是独特的，因为它在RT结构域的N-末端方向含有两个对于功能来说必需的结构域。它们包括远N-末端结构域(TEN)，它至少在系统发育组之间是保守的，但是对适合的人类、酵母和具纤毛原生动物的体外端粒酶活性和端粒的体内维持来说是必需的(Friedman & Cech(1999)Genes Dev.13：2863-2874；Friedman等，(2003)Mol.Biol.Cell 14：1-13)。TEN结构域具有DNA和RNA两种结合性质。DNA结合便于端粒酶装载到染色体上，而RNA结合是非特异性的，这种相互作用的功能还不清楚(Hammond等，(1997)Mol.Cell.Biol.17：296-308；Jacobs等，(2006)Nat.Struct.Mol.Biol.13：218-225；Wyatt等，(2007)Mol.Cell.Biol.27：3226-3240)。第三个结构域，端粒酶RNA结合结构域(TRBD)，位于TEN和RT结构域之间，与TEN结构域不同，它在系统发育组之间是高度保守的，对于体外和体内端粒酶的功能来说都是必需的(Lai等，(2001)Mol.Cell.Biol.21：990-1000)。TRBD包含参与RNA识别和结合的关键标志基序(CP-和T-基序)，造成与TER的茎I和TBE的广范围接触，TER的茎I和TBE二者都位于模板的上游(Bryan等，(2000)Mol.Cell6：493-499；Cunningham & Collins(2005)Mol.Cell.Biol.25：4442-4454；Lai等，(2002)Genes Dev.16：415-420；Lai等，(2001)同上；Miller等，(2000)同上；O′Connor等，(2005)J.Biol.Chem.280：17533-17539)。TRBD-TER相互作用对于全酶在体外和体内的适当组装和酶活性来说是必需的，被认为在染色体末端处忠实地添加多个一致的端粒重复序列中发挥重要作用(尽管是间接的)(Lai等，(2002)同上；Lai等，(2003)Mol.Cell 11：1673-1683；Lai等，(2001)同上)。

与TERT不同，TER的尺寸在种之间变化相当大。例如，在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中TER只有159个核苷酸长(Greider&Blackburn(1989)Nature 337：331-337)，而酵母具有异常长的1167个核苷酸的TER(Zappulla & Cech(2004)Proc.Natl.A cad.Sci.USA101：0024-10029)。尽管存在尺寸和结构上的巨大差异，但TER的核心结构元件在系统发育组之间是保守的，表明了生物体之间端粒复制的共同机制(Chen等，(2000)Cell 100：503-514；Chen & Greider(2003)Genes Dev.17：2747-2752；Chen & Greider(2004)Trends Biochem.Sci.29：183-192；Ly等，(2003)Mol.Cell.Biol.23：6849-6856；Theimer &Feigon(2006)Curr.Opin.Struct.Biol.16：307-318)。它们包括与RT结构域松散结合，并为端粒合成提供编码的模板，以及部分调控端粒酶的重复序列添加的持续合成能力的TBE。在嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)中，TBE由茎II和侧翼的单链区域形成，位于模板的上游并紧邻模板(Lai等，(2002)同上；Lai等，(2003)同上；Licht & Collins(1999)Genes Dev.13：1116-1125)。在螺旋IV和嗜热四膜虫TER的模板识别元件(TRE)中也发现了低亲和性的TERT结合位点。

TERT的功能受到多种蛋白的调控，其中某些通过与TERT/TER复合物直接结合起作用，而其他的通过它们与端粒DNA的结合调控端粒酶与染色体末端的接近来起作用(Aisner等，(2002)Curr.Opin.Genet.Dev.12：80-85；Cong等，(2002)Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：407-425；Dong等，(2005)同上；Loayza & de Lange(2004)Cell 117：279-280；Smogorzewska & de Lange(2004)Annu.Rev.Biochem.73：177-208；Smogorzewska等，(2000)Mol.Cell.Biol.20：1659-1668；Witkin & Collins(2004)Genes Dev.18：1107-1118；Witkin等，(2007)Mol.Cell.Biol.27：2074-2083)。例如，具纤毛原生动物嗜热四膜虫中的p65或其在小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)中的类似物p43，是端粒酶全酶的不可缺少的成分(Aigner & Cech(2004)RNA 10：1108-1118；Aigner等，(2003)Biochemistry 42：5736-5747；O′Connor & Collins(2006)Mol.Cell.Biol.26：2029-2036；Prathapam等，(2005)Nat.Struct.Mol.Biol.12：252-257；Witkin & Collins(2004)同上；Witkin等，(2007)同上)。p65和p43都被认为结合和折叠TER，这是全酶的适当装配和完全活性所必需的过程。在酵母中，端粒酶活性的募集和随后的上调需要端粒酶结合蛋白Est1(Evans & Lundblad(2002)Genetics 162：1101-1115；Hughes等，(1997)Ciba Found.Symp.211：41-52；Lundblad(2003)Curr.Biol.13：R439-441；Lundblad & Blackburn(1990)Cell 60：529-530；Reichenbach等，(2003)Curr.Biol.13：568-574；Snow等，(2003)Curr.Biol.13：698-704)。Est1与端粒酶的RNA成分结合，这种相互作用通过与端粒结合蛋白Cdc13的相互作用，促进了全酶向真核染色体末端的募集(Chandra等，(2001)Genes Dev.15：404-414；Evans & Lundblad(1999)Science 286：117-120；Lustig(2001)Nat.Struct.Biol.8：297-299；Pennock等，(2001)Cell104：387-396)。

端粒酶和相关的调控因子如何彼此物理相互作用并发挥功能以维持适合的端粒长度，还在研究之中。这些因子在隔离和彼此复合状态下的结构和生物化学性质，可用于确定TRBD结构域与TER的茎I和TBE的相互作用如何促进全酶的适当装配，并促进全酶的重复序列添加的持续合成能力。

尽管已经发展了体外和体内筛选方法来鉴定调节端粒酶活性或端粒结合的药剂，但焦点还没有放在鉴定对特定结构域或底物口袋具有一定程度特异性的药剂上。参见美国专利Nos.7,067,283；6,906,237；6,787,133；6,623,930；6,517,834；6,368,789；6,358,687；6,342,358；5,856,096；5,804,380和5,645,986。

发明简述

本发明的特征在于调节端粒酶活性的化合物的鉴定方法。本发明的方法包括：(a)设计或筛选与端粒酶的TRBD结构域的至少一个氨基酸残基，“拇指”结构域的至少一个氨基酸残基，“手掌”结构域的至少一个氨基酸残基和/或“手指”结构域的至少一个氨基酸残基结合的化合物；以及(b)测试在(a)中设计或筛选的化合物调节端粒酶活性的能力，从而鉴定调节端粒酶活性的化合物。在一个实施方案中，端粒酶的TRBD结构域包含在表1中显示的氨基酸残基。在另一个实施方案中，“拇指(thumb)”、“手掌”和“手指(finger)”结构域包含表2中显示的氨基酸残基。在其他实施方案中，步骤(a)在计算机上或在体外进行。通过本方法鉴定的化合物也被本发明所涵盖。

附图简述

图1显示了端粒酶(TERT)的结构。图1A显示了人类、酵母和嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)TERT的一级结构，显示了功能性结构域和保守基序。图1B是赤拟谷盗(Tribolium castaneum)TERT的一级结构和保守基序。图1C显示了TERT的结构域组织，具有描绘的RNA结合结构域(TRBD)，由“手指”和“手掌”亚结构域构成的反转录酶结构域，以及“拇指”结构域。

图2A和2B显示了嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的TRBDs(TETTH；SEQ ID NO：1)，与来自具纤毛原生动物例如小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)(EUPAE；SEQ ID NO：2)和Oxytricha trifallax(OXYTR；SEQ ID NO：3)，哺乳动物例如人类(SEQ ID NO：4)和小鼠(SEQ ID NO：5)，真菌例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(SCHPO；SEQ ID NO：6)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(YEAST；SEQ ID NO：7)，以及植物例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)(ARATH；SEQ ID NO：8)的TRBDs的序列比对和二级结构示意图，通过ALSCRIPT Barton(1993)Protein Eng.6：37-40)产生。标出了关键标志基序的保守残基，也标出了影响RNA结合和端粒酶功能的突变残基。实心三角形定义了在本文的研究中使用的TRBD构建物的边界。

图3A-3C显示了赤拟谷盗(Tribolium castaneum)TERT(TRICA；SEQ ID NO：9)与来自各种不同的系统发育组，包括哺乳动物例如小鼠(SEQ ID NO：10)和人类(SEQ ID NO：11)，植物例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)(ARATH；SEQ ID NO：12)，真菌例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(YEAST；SEQ ID NO：13)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(SCHPO；SEQ ID NO：14)，以及原生动物例如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)(TETTH；SEQ ID NO：15)和小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)(EUPAE；SEQID NO：16)的TERTs相比的序列比对和表面保守性，通过ClustalW2(Larkin等，(2007)Bioinformatics 23：2947-2948)产生。标出了关键标识基序的保守残基。也显示了参与与DNA底物的骨架直接接触的螺旋α10的K210和“拇指”结构域的极性残基(K406，K416，K418，N423)。

图4是来自嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的端粒酶的RNA成分(TER)的一级结构。标出了茎I、TBE和模板。

发明详述

端粒酶，一种核糖核蛋白复合物，复制真核染色体的线性末端，从而处理“复制末端问题”。TERT包含必需和总的来说保守的结构域(TRBD；图1A)，造成与全酶的RNA(TER)成分广泛接触，这种相互作用促进TERT/TER的组装和重复序列添加的持续合成能力。TRBD结构域在系统发育组之间高度保守，对于端粒酶的功能是必需的。广泛的生物化学和诱变研究已经定位到TRBD与茎I和TEB结合，这种相互作用据认为对于TERT/TER复合物的适当组装和稳定作用，以及全酶重复序列添加的持续合成能力是重要的。目前，已经鉴定了TRBD结构域的原子结构，由此提供了关于TERT/TER结合的信息。TRBD的RNA结合位点是蛋白表面上延伸的沟，它在性质上部分亲水、部分疏水，由以前鉴定到的显示出对端粒酶功能重要的T-和CP-基序形成。该沟的尺寸、组织和化学性质表明，TRBD结构域与双链和单链核酸都发生相互作用，可能是茎I或II以及连接它们的ssRNA。

除了TRBD结构域结构之外，现在已经显示，三个高度保守的结构域——TRBD，反转录酶(RT)结构域和据认为代表了TERT的假设的“拇指”结构域的C-末端延伸区，组织成了环状结构，与反转录病毒的反转录酶、病毒RNA聚合酶和B-家族DNA聚合酶共有相同的特征。结构域的组织将参与底物结合和催化的基序放置在环的内部，所述环的内部可以容纳7到8个碱基的双链核酸。RNA/DNA异源双链体在该环内部中的模拟，显示出蛋白与核酸底物之间的完美契合，并将DNA引物的3’-末端定位于酶的活性位点处，为活性端粒酶延伸复合物的形成提供了证据。

TRBD结构域，以及RT和“拇指”结构域，是在系统发育组之间高度保守的结构域。因此，这些结构域可以作为理想的候选者用于端粒酶抑制剂。就此而言，端粒酶是用于治疗与细胞增殖和衰老相关的人类疾病、例如癌症的理想靶。

因此，本发明涉及使用嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)端粒酶的高分辨率结构，来鉴定调节端粒酶活性的效应物分子。术语“效应物”是指任何影响端粒酶活性的激动物、拮抗物、配体或其他因子。效应物可以是但不限于肽类、糖类、核酸、脂类、脂肪酸、激素、有机化合物和无机化合物。从本发明的晶体结构获得的信息，显示了可用于设计、分离、筛选和确定调节端粒酶活性的可能化合物的详细信息。与TRBD结构域结合并例如空间阻断TER结合或阻断RNP组装的化合物，用作有效的端粒酶特异性抑制剂，而模拟或促进TER结合或RNP组装的化合物，用作有效的端粒酶特异性激活剂。结合并阻断活性位点或核苷酸结合位点的化合物也可以调节端粒酶的活性。类似地，与端粒酶直接接触DNA的一个或多个氨基酸残基相互作用的化合物，可以阻断DNA结合，并用作有效的端粒酶特异性抑制剂，而模拟DNA的化合物用作有效的端粒酶特异性活性剂。本发明的效应物分子具有广泛的各种用途。例如，已经考虑到端粒酶调节剂将是治疗人类疾病的有效治疗药剂。筛选激动剂提供了在细胞中增加端粒酶活性(包括端粒依赖性复制能力，或部分端粒酶活性)的组合物。这样的刺激剂组合物提供了使正常的未转化细胞、包括能够表达有用蛋白的细胞永生化的方法。这样的激动物也可以提供控制细胞衰老的方法。相反，筛选拮抗剂活性提供了降低端粒依赖性复制能力，从而使本来永生的细胞例如癌细胞死亡的组合物。筛选拮抗剂活性提供了降低端粒酶活性，从而阻止表现出不受调控的细胞生长的细胞、例如癌细胞的不受限制的细胞分裂的组合物。总的来说，无论需要增加还是降低细胞或生物体中的端粒酶活性，都可以使用本发明的效应物分子。

广义来说，本发明的方法包括设计或筛选与本文公开的必需端粒酶结构域的至少一个氨基酸残基结合的测试化合物；以及测试设计或筛选的化合物调节端粒酶活性的能力。在某些实施方案中，本发明的方法使用各种基于检测端粒酶的一个或多个结构域或结构域残基与测试化合物之间的相互作用的在计算机上、体外和/或体内分析方法来进行。

在本发明的上下文中，端粒酶是指通过添加端粒重复序列TTAGGG维持端粒末端的酶家族。端粒酶描述在例如Nakamura等，(1997)Science 277(5328)：955-9和O′Reilly等，(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(1)：56-65中。在本发明中使用的示例性端粒酶在本文中显示在SEQ ID NOs：1-16中(图2A-2B和图3A-3C)，本技术领域中已知的端粒酶的全长序列在GENBANK登记号Nos.AAC39140(嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila))，NP_197187(拟南芥(Arabidopsisthaliana)，NP_937983(智人(Homo sapiens))，CAA18391(粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))，NP_033380(小鼠(Musmusculus))，NP_013422(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，AAC39163(Oxytricha trifallax)，CAE75641(小腔游仆虫(Euplotesaediculatus))和NP_001035796(赤拟谷盗(Tribolium castaneum))下。出于本发明的目的，指称端粒酶是指端粒酶的等位基因和合成变体，以及端粒酶的片段。合成变体包括与本文公开的端粒酶具有至少80％、优选至少90％同源性的变体。更具体来说，这样的变体对应于本文提供的端粒酶序列，但是具有一个或多个，例如从1到10个，例如1到5个氨基酸取代、缺失或插入。端粒酶及其变体的片段大小优选为至少20个，更优选至少50个，最优选至少200个氨基酸。示例性的片段包括包含了端粒酶的TRBD结构域的大约250个氨基酸残基。其他片段包括“拇指”结构域和反转录酶结构域及其亚结构域，即“手指”和“手掌”亚结构域。正如在图1A和图2A和2B中描述的，TRBD结构域包含嗜热四膜虫(T.thermophila)端粒酶的254-519位处或附近的氨基酸残基。如图1B和图3A-3C所示，反转录酶结构域包含赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的160-403位处或附近的氨基酸残基，“拇指”结构域包含赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的404-596位处或附近的氨基酸残基。基于图2A、2B、3A和3B中描述的氨基酸序列比较，可以根据其他物种的端粒酶中对等氨基酸残基的位置，容易地获得来自其他物种端粒酶的适合的结构域和片段。

TRBD的近乎全螺旋的结构提供了适合于TER结合的核酸结合折叠。蛋白表面上由两个保守基序(CP-和T-基序)形成的延长的口袋，提供了TRBD的RNA结合口袋。该口袋的宽度和化学本性表明，它结合单链和双链RNA二者，可能是茎I和模板边界元件(TBE)。参与嗜热四膜虫(T.thermophila)端粒酶的RNP组装和嗜热四膜虫(T.thermophila)端粒酶TRBD与TER之间的相互作用的必需氨基酸残基，列于表1中。这些残基在来自于其他生物体的端粒酶中的位置，也列于表1中。在具体实施方案中，本发明的化合物与表1中列出的一个或多个氨基酸残基结合，由此调节端粒酶活性。

表1

Tt，嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)；At，拟南芥(Arabidopsisthaliana)；Hs，智人(Homo sapiens)；Sp，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；Mm，小鼠(Mus musculus)；Sc，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；Tc，赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)；Ot，Oxytricha trifallax以及Ea，小腔游仆虫(Euplotesaediculatus)。

^*位置参照于全长嗜热四膜虫(T.thermophila)端粒酶。

^#位置参照于在图2A和2B中描述的端粒酶序列，即SEQ ID NOs：1-8。

位置参照于在图3A-3C中描述的端粒酶序列。

正如本文公开的，赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的结构鉴定了反转录酶和“拇指”结构域的关键氨基酸残基。具体来说，鉴定了核苷酸结合口袋的关键氨基酸残基，以及表现出与DNA底物的骨架直接接触的氨基酸残基。因此，本发明还包含了与端粒酶的核苷酸结合口袋的至少一个氨基酸残基或与DNA直接接触的残基结合的化合物。这些残基发现在赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的反转录酶结构域的“手掌”和“手指”亚结构域和“拇指”结构域中，并列于表2中。这些氨基酸残基在其他物种中的位置也列于表2中。

表2

N185I186I187P188K189F193R194A195I196V197″Thumb″K406K416K418N423

R534I535I536P537K538F542R543P544I545M546Q888T898N900K906

R613F614L615P616K617V621R622M623V624L625T937T947S949K955

R503L504L505P506K507F511R512L513I514T515P815T825S826H832

R622F623I624P625K626L630R631P632I633V634S943S953T955K961

R612F613I614P615K616L620R621P622I623V624S936S946T948K954

R439I440I441P442K443N447E448F449R450I451S729K739S741R746

R515L516I517P518K519F523R524P525I526M527N860T869N871K877

Tt，嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)；At，拟南芥(Arabidopsisthaliana)；Hs，智人(Homo sapiens)；Sp，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；Mm，小鼠(Mus musculus)；Sc，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；Tc，赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)；以及Ea，小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)。

^*位置参照于在图3A-3C中描述的端粒酶序列。

在一个实施方案中，本发明的化合物与表2中列出的一个或多个氨基酸残基结合，由此调节端粒酶活性。在另一个实施方案中，化合物与端粒酶的核苷酸结合口袋的一个或多个氨基酸残基(即赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的K189、R194、Y256、Q308、V342和K372，或它们在来自其他物种的端粒酶中的等价氨基酸残基)结合，以调节核苷酸结合。在另一个实施方案中，化合物结合端粒酶与DNA直接接触的一个或多个氨基酸残基(即赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的K210、K406、K416、K418或N423，或它们在来自其他物种的端粒酶中的等价氨基酸残基)，以调节DNA结合。

根据本发明设计或筛选的化合物可以通过各种不同的异源相互作用，包括但不限于范德华接触(van der Waals contacts)、氢键、离子相互作用、极性接触或其组合，与本文公开的一个或多个结构域的至少一个氨基酸残基相互作用。一般来说，希望化合物与本文公开的结构域的2、3、4、5、6个或以上氨基酸残基相互作用，以增加化合物对一种或多种端粒酶蛋白的特异性。在一个实施方案中，化合物与QFP-基序、T-基序或CP-基序的一个或多个必需氨基酸相互作用。在另一个实施方案中，化合物与T-基序和CP-基序的一个或多个必需氨基酸相互作用。在另一个实施方案中，化合物与表1中显示的一个或多个必需氨基酸相互作用。在具体实施方案中，化合物与表1中显示的、以前没有通过突变被鉴定为影响RNA结合和端粒酶活性的一个或多个必需氨基酸残基相互作用。在另一个实施方案中，化合物与核苷酸结合口袋的一个或多个必需氨基酸相互作用。在另一个实施方案中，化合物与端粒酶直接接触DNA的一个或多个必需氨基酸相互作用。在另一个实施方案中，化合物与表2中显示的一个或多个必需氨基酸相互作用。在具体实施方案中，化合物与表2中显示的、以前没有通过突变被鉴定为影响核苷酸结合、DNA结合或端粒酶活性的一个或多个必需氨基酸残基相互作用。

根据本发明，可以使用分子设计技术来设计、鉴定和合成能够与端粒酶的一个或多个氨基酸结合的化学实体和化合物，包括抑制性和刺激性化合物。端粒酶结构域的结构可以与使用对接程序(dockingprogram)例如GRAM、DOCK、HOOK或AUTODOCK(Dunbrack等，(1997)Folding & Design2：27-42)的计算机模拟技术一起使用，来鉴定端粒酶蛋白的潜在的调节物。该步骤可以包括将化合物对本文公开的结构域进行计算机拟合，以例如确定化合物的形状和化学结构与TRBD结构域互补得有多好；或用于比较化合物与TER在TRBD中的结合；或比较化合物与DNA分子在“拇指”结构域上的结合，或比较化合物与核苷酸底物在核苷酸结合口袋上的结合。计算机程序也可用于估算端粒酶蛋白与效应物化合物的吸引、排斥和空间位阻。一般来说，拟合越紧密，空间位阻越低，吸引力越大，特异性越高，这是更可能与端粒酶蛋白而不是其他类型蛋白相互作用的特异性效应物化合物的重要特点。由于本发明已经鉴定了特异性参与底物结合的氨基酸残基，因此本发明提供了迄今为止使用常规筛选分析方法不可能获得的特异性。

或者，在端粒酶调节物或效应物的设计中可以使用化学探针方法。例如，Goodford((1985)J.Med.Chem.28：849)描述了几种商业化软件包，例如GRID(Molecular Discovery Ltd.，Oxford，UK)，可用于使用不同化学探针，例如水、甲基、胺的氮、羧基氧和羟基来探测端粒酶结构域。由此确定了端粒酶结构域的这些区域或位点与每种探针之间相互作用的优选位点，并从获得的这些区域或位点的三维图样，可以产生推断的互补分子。

本发明的化合物也可以通过目测检查端粒酶结构域的三维结构，以确定更有效的抑制剂或激活剂来进行设计。这种类型的模拟一般被称为“手动”药物设计。手动药物设计可以利用目测检查和使用图形可视化程序进行分析，这样的程序例如“O”(Jones等，(1991)ActaCrystallographica SectionA A47：110-119)。

一开始，效应物化合物可以通过手动药物设计来选择。然后可以将由此设计的结构类似物通过计算机模拟进行修改，以更好地确定最可能的有效候选物。减少潜在候选物的数量是有用的，因为大概不可能合成和筛选与已知抑制性分子可能具有某些相似性的无数数量的化合物变化。这种分析在开发HIV蛋白酶抑制剂中已显示出有效(Lam等，(1994)Science 263：380-384；Wlodawer等，(1993)Ann.Rev.Biochem.62：543-585；Appelt(1993)Perspectives in Drug Discovery and Design1：23-48；Erickson(1993)Perspectives in Drug Discovery and Design1：109-128)。或者，小分子文库的随机筛选可以产生调节物，然后可以通过上述的计算机模拟方法分析它们的活性，以更好地确定它们作为抑制剂或激活剂的有效性。

适合于搜索三维数据库的程序包括MACCS-3D和ISIS/3D(Molecular Design Ltd，San Leandro，CA)，ChemDBS-3D(ChemicalDesign Ltd.，Oxford，UK)和Sybyl/3 DB Unity(Tripos Associates，StLouis，MO)。适合于化合物选择和设计的程序包括例如DISCO(AbbottLaboratories，Abbott Park，IL)，Catalyst(Bio-CAD Corp.，Mountain View，CA)和ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd.，Oxford，UK)。

使用本发明的信息设计的化合物可以结合所有端粒酶的TRBD结构域、核苷酸结合结构域和/或“拇指”结构域，或其中的一部分，它们与已知的端粒酶抑制剂相比，可能更有力、更特异、毒性更低或更有效。设计的化合物也可以效力较低，但是在体内和/或体外具有更长的半衰期，因此对于长时期在体内和/或体外调节端粒酶活性来说更有效。这样设计的调节物可用于抑制或活化端粒酶活性，以例如改变细胞的寿命或增殖能力。

本发明还提供了使用分子设计技术，从小分子数据库计算筛选能够以与其天然底物类似的方式结合端粒酶的化学实体或化合物。这样的计算筛选可以鉴定与本文公开的结构域的一个或多个氨基酸残基相互作用的各种不同基团，可用于合成本发明的调节物。

本发明也包括了体外(即溶液中)筛选分析方法。例如，这样的分析方法包括将端粒酶、端粒酶的TRBD结构域(例如本文公开的)或带有或不带有TER的端粒酶TRBD结构域的部分在溶液中混合，然后确定测试化合物是可以阻断还是可以增加端粒酶活性。类似地，可以进行体外分析方法以监测在存在或不存在测试化合物的情况下核苷酸或DNA的结合。

可以按照本发明的方法筛选的化合物一般源自于药剂或化合物的文库。这样的文库可以包含纯药剂的集合或药剂混合物的集合。纯药剂的例子包括但不限于蛋白、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、糖类、脂类、合成或半合成的化学物质，以及纯的天然产物。药剂混合物的例子包括但不限于原核或真核细胞和组织的提取物，以及发酵培养基和细胞或组织培养上清液。化学结构数据库也可以从许多来源获得，包括剑桥晶体学数据中心(Cambridge Crystallographic Data Centre)(Cambridge，UK)和化学摘要服务部(Chemical Abstracts Service)(Columbus，OH)。从头设计程序包括Ludi(Biosym Technologies Inc.，San Diego，CA)，Sybyl(Tripos Associates)和Aladdin(Daylight ChemicalInformation Systems，Irvine，CA)。

文库筛选可以使用任何常规方法来进行，可以任何允许快速制备和处理多个反应的格式执行。对于体外筛选分析来说，可以手动制备测试化合物以及分析测试成分的储液，所有随后的吸取、稀释、混合、洗涤、温育、样品读取和数据收集，使用可商购的机器人吸取设备、自动化工作站和用于检测分析产生的信号的分析仪器来进行。这样的检测器的例子包括但不限于照度计、分光光度计和荧光计，以及测量发生性同位素衰变的装置。

在设计或筛选了与本文公开的结构域的至少一个氨基酸残基结合的化合物后，然后测试化合物调节端粒酶活性的能力。端粒酶的这种活性包括端粒酶催化活性(可以是持续或不持续性的活性)，端粒酶的持续合成能力，常规的反转录酶活性，核溶解活性，引物或底物(端粒或合成的端粒酶底物或引物)结合活性，dNTP结合活性，RNA(即TER)结合活性，以及蛋白结合活性(例如与端粒酶结合蛋白、端粒结合蛋白或蛋白-端粒DNA复合物结合)。参见例如在美国专利No.7,262,288中公开的分析方法。

端粒酶催化活性打算包含端粒酶通过添加部分、一个或一个以上由模板核酸(例如TER)编码的序列(例如TTAGGG)的重复序列，来延伸用作端粒酶底物的DNA引物的能力。该活性可以是持续或不持续性的。当端粒酶RNP在DNA被酶复合物释放之前向引物或端粒酶添加了多个重复序列时，发生持续性活性。当端粒酶向引物添加一部分或仅仅一个重复序列然后就被释放时，发生了不持续性活性。但是，在体内，不持续性反应可以通过结合、延伸和解离的连续循环，添加多个重复序列。这在体外也可以发生，但是在标准的分析方法中一般不能观察到，这是因为在标准的分析条件中，引物与端粒酶相比摩尔数极大过量。常规的用于测定端粒酶催化活性的分析方法公开在例如Morin(1989)Cell 59：521；Morin(1997)Eur.J.Cancer 33：750；美国专利No.5,629，154；WO 97/15687；WO 95/13381；Krupp等，(1997)NucleicAcids Res.25：919；Wright等，(1995)Nuc.Acids Res.23：3794；Tatematsu等，(1996)Oncogene 13：2265中。

端粒酶的常规反转录酶活性描述在例如Morin(1997)同上，和Spence等，(1995)Science 267：988中。因为端粒酶含有反转录酶催化活性所需的保守氨基酸基序，因此端粒酶具有转录某些外源(例如非TER)RNAs的能力。常规的RT分析方法测量酶通过延伸退火的DNA引物转录RNA模板的能力。反转录酶活性可以以本技术领域已知的大量方式进行测量，例如通过监测标记的核酸引物(例如RNA或DNA)的尺寸的增加，或标记的dNTP的掺入。参见例如Ausubel等，(1989)《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnWiley & Sons，New York，NY。

因为端粒酶与TER特异性结合，可以认识到用于常规RT分析的DNA引物/RNA模板可以被修饰，以具有与TER和/或端粒DNA引物相关的特征。例如，RNA可以具有序列(CCCTAA)_n，其中n是至少1，或至少3，或至少10或以上。在一个实施方案中，(CCCTAA)_n区域位于RNA的5’末端处或附近(类似于端粒酶RNAs中模板区的5’位置)。类似地，DNA引物可以具有含有一部分TTAGGG端粒序列的3’末端，例如X_nTTAG，X_nAGGG等，其中X是非端粒序列，n是6-30。在另一个实施方案中，DNA引物具有不与RNA模板互补的5’末端，使得当引物与RNA退火时，引物的5’末端保持未结合。可用于本发明的标准反转录分析方法的其他修改，在本技术领域中是已知的。

端粒酶的核溶解活性描述在例如Morin(1997)，同上，和Collins &Grieder(1993)Genes Dev.7：1364中。当DNA的3’末端位于DNA模板序列的5’边界处时，端粒酶倾向于从寡核苷酸的3’末端移除核苷酸，通常只有1个，在人类和四膜虫中，该核苷酸是端粒重复序列(在人类中是TTAGG)的第一个G。端粒酶倾向于移除G残基，但是具有针对其他核苷酸的核溶解活性。这种活性可以使用本技术领域已知的常规方法来监测。

端粒酶引物(端粒)结合活性描述在例如Morin(1997)，同上；Collins等，(1995)Cell 81：677；Harrington等，(1995)J.Biol.Chem.270：8893中。有几种方式可以分析引物结合活性；但是，大多数方法共同的步骤是将标记的DNA引物与端粒酶或端粒酶/TER在适合的结合条件下温育。此外，大多数方法使用了将未结合的DNA与结合蛋白的DNA分离开的手段。这样的方法可以包括例如凝胶迁移分析或基质结合分析。DNA引物可以是任何对端粒酶具有亲和性的DNA，例如端粒DNA引物例如(TTAGGG)_n，其中n可以是1-10，典型为3-5。3’和5’末端可以在重复序列的任何位置结束。引物也可以具有非端粒DNA的5’或3’延伸，可以便于标记或检测。引物也可以被衍生，例如以便于检测或分离。

端粒酶的dNTP结合活性描述在例如Morin(1997)，同上，和Spence等，(1995)，同上，中。端粒酶需要dNTPs来合成DNA。端粒酶蛋白具有核苷酸结合活性，可以以与其他核苷酸结合蛋白相似的方式来分析dNTP结合(Kantrowitz等，(1980)Trends Biochem.Sci.5：124)。典型情况下，可以按照本技术领域已知的用于非端粒酶RT蛋白的方法，监测标记的dNTP或dNTP类似物的结合。

端粒酶RNA(即TER)结合活性描述在例如Morin(1997)，同上；Harrington等，(1997)Science 275：973；Collins等，(1995)Cell 81：677中。本发明的端粒酶蛋白的RNA结合活性，可以以与同上描述的DNA引物结合分析相似的方式，使用标记的RNA探针来进行分析。用于分离结合和未结合的RNA以及用于检测RNA的方法，在本技术领域中是已知的，可以以与对于DNA引物结合分析所描述的相似的方式应用于本发明的活性分析。RNA可以是全长TER、TER片段，或其他被证实对端粒酶或TRBD具有亲和性的RNAs。参见美国专利No.5,583,016和WO 96/40868。

为了进一步评估使用本发明的方法鉴定的化合物的效能，本领域技术人员人员将会认识到，任何涉及端粒酶的特定疾病或病症的模型系统，都可用于评估化合物的吸收、分布、代谢和排泄，以及它在急性、亚慢性和慢性研究中的潜在毒性。例如，效应物或调节物化合物可以在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中用于复制型寿命的分析方法中进行测试(Jarolim等，(2004)FEMS Yeast Res.5(2)：169-77)。也参见McChesney等，(2005)Zebrafish 1(4)：349-355和Nasir等，(2001)Neoplasia 3(4)：351-359，其中描述了用于分析端粒酶活性的海洋哺乳动物和狗组织的模型系统。

与本文公开的一个或多个端粒酶结构域的至少一个氨基酸残基结合的化合物，可用于调节(即阻断或抑制，或增强或活化)端粒酶的方法中。这样的方法包括将端粒酶在体外或体内与有效量的与本发明的结构域的至少一个氨基酸残基相互作用的化合物相接触，以便调节端粒酶活性。效应物或调节性化合物的有效量，是与未接触化合物的端粒酶相比，将端粒酶的活性降低或增加至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的量。这种活性可以通过检测端粒酶活性的酶法分析，或通过监测已知与端粒酶相关或受端粒酶调控的蛋白的表达或活性，来进行监测。

本领域技术人员可以认识到，调节端粒酶活性可用于在模型系统中选择性分析端粒酶信号传导事件，以及用于预防或治疗涉及端粒酶的疾病和病症。用于预防或治疗特定疾病或病症的化合物的选择，将依赖于具体的疾病或病症。例如人类端粒酶参与癌症，因此抑制端粒酶的化合物可用于预防或治疗癌症，包括实体肿瘤(例如乳腺、前列腺和结肠的腺癌；黑素瘤；非小细胞肺癌；神经胶质瘤；以及骨骼、乳腺、消化系统、结肠直肠、肝脏、胰腺、垂体、睾丸、眼眶、头颈部、中枢神经系统、听觉、骨盆、呼吸道和泌尿生殖肿瘤)，以及白血病(例如B细胞、混合细胞、裸细胞、T细胞、T细胞慢性、淋巴细胞性急性、淋巴细胞性慢性、肥大细胞和髓细胞性白血病)。表达端粒酶活性的癌细胞(例如恶性肿瘤细胞)(端粒酶阳性细胞)，可以通过降低或抑制内源性端粒酶活性使其死亡。此外，因为端粒酶水平与疾病特征例如转移潜力相关(例如美国专利Nos.5,639,613；5,648,215；5,489,508；Pandita等，(1996)Proc.Am.Ass.Cancer Res.37：559)，因此端粒酶活性的任何降低可能将癌症的攻击性本性降低到更可控制的疾病状态(增加传统干预的效能)。

作为说明，实施例3描述了基于细胞的分析方法，以及可用于评估肿瘤细胞生长被一种或多种本发明的化合物抑制的动物模型系统。另一种可用于评估本发明的化合物的抗癌症活性的方法，包括由国立癌症研究所(National Cancer Institute)进行的多种人类癌细胞株筛选分析方法(参见例如Boyd(1989)在《癌症：肿瘤学原理与实践最新进展》中(in Cancer：Principles and Practice of Oncology Updates)，DeVita等主编，pp.1-12)。这种含有大约60种不同人类癌细胞株的筛选组，是广泛不同肿瘤类型的体内抗肿瘤活性的有用指标(Grever等，(1992)Seminars Oncol.19：622；Monks等，(1991)Natl.Cancer Inst.83：757-766)，例如白血病、非小细胞肺、结肠、黑素瘤、卵巢、肾脏、前列腺和乳腺癌。抗肿瘤活性可以用ED₅₀(或GI₅₀)表示，其中ED₅₀是有效将细胞生长降低50％的化合物的摩尔浓度。具有较低ED₅₀值的化合物与具有较高ED₅₀值的化合物相比，倾向于具有较高的抗癌活性。

在一种或多种体外分析中证实了化合物的潜在活性后，进一步的评估一般在实验室动物中体内进行，例如在患有B16黑素瘤的小鼠中测量肺部小结转移的减少(例如Schuchter等，(1991)Cancer Res.51：682-687)。也可以使用例如人类B-CLL在小鼠中的异体移植模型，来评估本发明的化合物单独或作为药物组合化学疗法的效能(例如Mohammad等，(1996)Leukemia 10：130-137)。这样的分析方法典型地包含将原发肿瘤细胞或肿瘤细胞株注射到免疫受损的小鼠中(例如SCID小鼠或其他适合的动物)，并允许肿瘤生长。然后用本发明的化合物处理携带肿瘤的小鼠，并测量肿瘤尺寸以跟踪治疗的效果。或者，可以在注射肿瘤细胞之前给药本发明的化合物，以评估肿瘤的预防。最后，在人类临床试验中评估本发明的化合物的安全性和效能。

活化或刺激端粒酶活性的化合物可用于由对象中细胞衰老所诱导或恶化的疾病或病症的治疗或预防方法；用于在例如衰老发生后降低对象衰老速度的方法；用于延长对象的寿命的方法；用于治疗或预防与寿命相关的疾病或病症的方法；用于治疗或预防与细胞的增殖能力相关的疾病或病症的方法；以及用于治疗或预防由细胞损伤或死亡所引起的疾病或病症的方法。某些衰老疾病的特征为由于细胞中端粒酶活性的缺乏(或低得多的水平)引起的端粒长度减小(与较年轻的细胞相比)所导致的与细胞衰老相关的变化。端粒酶活性和端粒的长度可以通过例如增加细胞中端粒酶的活性来增加。与细胞衰老相关的、可以用增加的端粒酶活性治疗的病症的部分名单包括阿茨海默氏病，帕金森氏症，亨廷顿舞蹈症以及中风；体被与衰老相关的疾病例如皮肤萎缩、弹性组织分解和皮肤起皱，头发发白和脱发，慢性皮肤溃疡，以及与衰老相关的伤口愈合变弱；变性性关节病；骨质疏松症；与衰老相关的免疫系统缺损(例如涉及例如B和T淋巴细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，NK细胞以及它们相应的祖细胞)；与衰老相关的血管系统疾病；糖尿病；以及与衰老相关的黄斑变性。此外，端粒酶活化剂可用于增加细胞的增殖能力或细胞永生化，以产生例如新的细胞株(例如大多数人类体细胞)。

预防或治疗典型地包含向需要治疗的对象给药含有有效的、本发明的筛选方法中鉴定到的化合物的药物组合物。在大多数情况下，对象是人类，但是农业动物例如牲畜和禽类，以及伴侣动物例如狗、猫和马，也明确地包含在本发明中。化合物的剂量或有效量被选择为具有所需的预防、减少或逆转待治疗疾病或病症的至少一种征兆或症状的结果。用于在人类中治疗癌症和其他与端粒酶相关的疾病的方法，描述在美国专利Nos.5,489,508、5,639,613和5,645,986中。作为说明，患有癌症(包括例如癌，黑素瘤，肉瘤，淋巴瘤和白血病)的对象可能经历无法解释的体重减轻、疲劳、发烧、疼痛、皮肤改变、不能愈合的疮、乳腺或身体其他部分的增厚或结块，或不断的咳嗽或声音嘶哑，其中使用本发明的化合物进行治疗可以预防、减轻或逆转这些症状中的一种或多种。

药物组合物可以采取可药用的盐和复合物的形式，可以以适合的剂量提供在可药用载体中。这样的药物组合物通过本技术领域公知的方法制备，并包含本技术领域公知的载体。这样的方法和成分的普遍认同的概要是《Remington：药物科学与实践》(Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro主编，第20版，LippincottWilliams & Wilkins：Philadelphia，PA，2000。可药用载体、组合物或介质，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂囊封材料，参与了对象化合物从身体的一个器官或部分，向身体的另一个器官或部分的运载或运输。每种载体必须在与制剂的其他成分相容，并且对被治疗的对象无伤害的意义上是可接受的。

可用作可药用载体的材料的例子包括糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄耆胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；Ringer′s溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及其他在药物制剂中使用的无毒性相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包层剂、甜味剂、调味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于组合物中。

根据标准医学实践，本发明的组合物可以肠胃外(例如通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内注射)，局部(包括颊和舌下)，口服，鼻内，阴道内或直肠给药。

选择的剂量水平将依赖于各种不同因素，包括使用的本发明的具体化合物的活性，给药途径，给药时间，使用的具体化合物的排泄或代谢速度，治疗的时间长度，与使用的具体化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和以前的医学史，以及医学技术领域中公知的其他因素。

具有本技术领域的普通技术的医生或兽医，可以容易地确定和规定所需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以从低于为了获得所需治疗效果所需的水平的化合物剂量开始，并逐渐增加剂量，直到获得所需疗效。这被认为在专业人员的技术范围之内，人们可以查阅关于特定化合物或类似化合物的现有文献，以确定最适剂量。

通过下面的非限制性实施例对本发明进行了更详细的描述。

实施例1嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)TERT的结构

蛋白表达和纯化。嗜热四膜虫(T.thermophila)TERT的254-519位残基通过有限蛋白水解进行鉴定，并克隆到在其N-末端含有可切开的6个组氨酸标签的修改版本的pET28b载体中。将蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(pLysS)中，在20℃过表达4小时。细胞在50mM Tris-HCl，10％甘油，0.5M KCl，5mM β-巯基乙醇和1mM PMSF，pH 7.5中，在冰上通过超声进行裂解。将蛋白首先在Ni-NTA柱上纯化，然后用TEV在4℃过夜切开6个组氨酸标签。将TRBD/TEV混合物稀释，使得咪唑的浓度为15mM，将蛋白混合物通过Ni-NTA柱以除去TEV、切开的标签和任何带标签的蛋白。将Ni-NTA流出液浓缩到1ml，并稀释到盐浓度为0.15M。然后将稀释的TRBD样品通过POROS-HS柱(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)。在该阶段时，蛋白纯度超过99％。最后将蛋白通过用50mM Tris-HCl，10％甘油，0.5M KCl和2mM DTT，pH 7.5预先平衡的SEPHADEX-S200孔径排阻柱，以移除任何TRBD聚集物。将通过SDS-page和动态光散射分别显示为纯的、单一分散的蛋白，使用AMICON 10K截留分子量(MILLIPORE，Billerica，MA)浓缩到8mg/ml，将蛋白储存在4℃用于随后的研究。在结晶试验前将蛋白储液在5mM Tris-HCl，500mM KCl，1mM TCEP，pH 7.5中透析。

蛋白结晶和数据收集。使用沉滴法，通过将一体积透析过的蛋白与一体积含有20％PEG 3350，0.2M NaNO₃的储液器溶液混合，在4℃下生长出衍射不佳(分辨率)的最初片状的TRBD簇。通过将一体积透析过的蛋白与等体积的50mM HEPES(pH 7.0)，44％PEG400，0.4M NaNO₃，0.4M NaBr和1mM TCEP混合，在石蜡油下的微量批次托盘中，在4℃生长出单个的、衍射良好的晶体。将晶体收获到含有25mM HEPES(pH 7.0)，25％PEG 400，0.2M NaNO₃，0.2M NaBr和1mM TCEP的冷冻保护剂溶液中，在液氮中速冻。数据在NSLS，光束线X6A下收集，并用HKL-2000处理(Minor(1997)Meth.Enzymol.Macromole.Crystallogr.Part A 276：307-326)(表3)。晶体属于单斜晶系P2₁，在不对称晶格中带有一个单体。

表3

^*括号中的值对应于最高分辨率外壳。

结构确定和改进。从使用蛋白与5mM HoCl₃共结晶制备的双波长MAD钬(Ho)衍生物，获得了初始相。重原子位点使用SOLVE(Terwilliger(2003)Methods Enzymol.374：22-37)定位，使用了MLPHARE对位点进行改进并计算新的相(CCP4(1994)ActaCrystallogr.D 50：760-763)，如同在ELVES中执行的(Holton & Alber(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：1537-1542)(表3)。初始的图仅仅对一大半分子显示出轮廓清晰的密度。分子的较小一半的密度弱的主要原因是相对于分子的较大一半来说内在的移动性。与将模型构建成密度相关的问题，由于缺少与特定侧链例如硒代甲硫氨酸的位置有关的信息而进一步恶化。在构建完整模型中关键的因素是在RESOLVE中的连续的PRIME和SWITCH循环(Terwilliger(2002)ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.58：1937-1940)，然后在COOT中手动构建(Emsley & Cowtan(2004)Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60：2126-2132)。模型使用CNS-SOLVE(Brunger等，(1998)ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.54：905-921)和REFMAC5(Murshudov等，(1997)Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.53：240-255)两者进行改进。最后的改进循环使用如同在REFMAC5中进行的TLS限制来进行(表4)。图在PYMOL中制备(DeLano(2002))，静电表面在APBS中制备(Baker等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：10037-10041)。

表4

TRBD结构。为了研究端粒酶的必需RNA结合结构域(TRBD)的功能，将通过有限蛋白水解鉴定的含有来自嗜热四膜虫的254-519位残基的构建物(图1A)纯化至均一。正如通过凝胶过滤和动态光散射二者所显示的，该蛋白构建物在溶液中是单体。将该构建物的晶体容易地生长，并衍射到

的分辨率(表3)。使用钬衍生物，通过多波长反常色散(MAD)，将蛋白定相到

的分辨率，并使用天然数据组将相扩展到

的分辨率(表3)。在经过改进的结构中，257-266位和277-519位残基存在清晰的密度。

结构含有12个α-螺旋，通过几个长的环和两个短的β-链连接在一起。螺旋被组织成使得分子被分成两个不对称的一半，通过三个延长的环相连。较大的一半由9个α-螺旋组成，其中之一(α11)沿着结构域的中间并跨过其整个长度，与所有其他8个螺旋接触。分子的较小一半由三个螺旋(α4，α5和α12)组成，它们都与蛋白的较大一半的平面以～120°的角度排列。蛋白的较小一半比较大一半柔性稍微更大一些，正如由它的反映出该区域的内在移动性的高B因数所表明的，并可以导致缺少可观察的与RNA底物的接触。结构的一个有趣特点是由分别连接较大和较小一半的螺旋α11和α12的15个残基形成的β-发夹。β-发夹从蛋白的两个一半形成的裂缝的基部伸出，与分子的较小一半的平面成45°角。这种定位以及该发夹的密度轮廓清晰的事实，可以归因于螺旋α7以及连接它与螺旋α8的环。这些元件都方便地定位在该发夹的背部，将它保持在位。使用Dali服务器(Holm & Sander(1996)Science 273：595-603)在蛋白结构数据库中进行的搜索，没有产生结构同源物，表明端粒酶的TRBD结构域是一个新的核酸结合折叠。蛋白的两个一半的总体组织与核酸识别和结合有显著关联。

TRBD的RNA结合基序。TRBD结构域与TER相互作用的能力，已经归因于被称为CP-和T-基序的两个保守基序，而第三个被称为QFP-基序的基序被认为对于RNP的组装是重要的(图2A和2B)(Bosoy等，(2003)J.Biol.Chem.278：3882-3890；Bryan等，(2000)同上；Jacobs等，(2005)同上；Xia等，(2000)Mol.Cell.Biol.20：5196-5207)。TRBD结构显示出，QFP-基序由几个主要是疏水的残基形成，它们位于分子的较大一半上，埋藏在结构域的核心中，与周围的残基形成广泛的疏水接触，辅助蛋白的折叠。这些残基包括Gln375，Ile376，Leu380，Ile383，Ile384，Cys387，Val388，Pro389，Leu392，Leu393，Asn397，Leu405，Phe408，Tyr422，Ile423，Met426，Trp433和Phe434。QFP-残基的位置和接触表明它们不直接参与核酸结合。

T-基序位于分子的中心，蛋白的两个一半在那里相会，并且它由形成了β-发夹和螺旋α12二者的一部分的残基构成。这些结构元件一起形成了狭窄的

轮廓清晰的口袋(T-口袋)，由几个暴露于溶剂的高度保守的残基排列而成(Phe476，Tyr477，Thr479，Glu480，Tyr491，Arg492，Lys493和Trp496)。特别需要指出的是不变的残基Tyr477和Trp496的侧链，它们分别是β-发夹和螺旋α12的部分。这些残基一起形成了“疏水钳状物”，可以夹住相互作用的RNA核苷酸的嘌呤/嘧啶基团。在该结构中，Tyr477和Trp496的侧链仅仅分开不足以容纳核苷酸碱基。在两个侧链之间插入碱基将需要T-口袋的结构重排，可能将分子的两个一半外张分开。除了其疏水部分之外，T-口袋还包含几个亲水残基，例如Arg492和Lys493，二者都是暴露于溶剂的，并位于T-和CP-口袋的界面处，将二者连接到一起。

CP-基序由螺旋α3和随后的环形成。与作为狭窄的轮廓清晰的口袋的T-基序相反，CP-基序构成浅的、宽的

高度带正电荷的空腔，位于T-口袋入口的附近和下方。形成CP-基序的几个保守残基包括Phe323，Leu327，Lys328，Lys329，Cys331，Leu333和Pro334。这些残基埋在较大一半的核心或连接分子的两半的区域中，有助于蛋白折叠。特别有趣的是残基Leu327、Cys331、Leu333和Pro334，它们都是被埋的，并与T-基序的结构元件直接接触，从而帮助了CP-和T-口袋二者的形成。例如，Leu327和Cys331在不变的Phe476的大的疏水侧链和保守的Arg492的侧链的脂族部分的范德华接触范围内，后两者形成了β-发夹的一部分。有趣的是，Arg492位于螺旋α12的基部，它与Leu327、Cys331和Leu333的接触部分帮助了将该螺旋定位成与分子的较大一半平行的平面成45°角，从而进一步促进了T-口袋的形成。此外，Arg492与Leu327、Cys331和Leu333的相互作用帮助了将胍基团、该残基的唯一溶剂暴露部分，定位于由CP-和T-口袋形成的界面处。CP-口袋还包含几个本质上主要是疏水的、表面暴露的、保守的残基。它们包括Lys328和Lys329，二者位于T-口袋的下方，与Arg492和Lys493紧密接近，一起形成了几乎跨越分子的整个侧面的单一的、大的、带正电荷的表面区域。

TRBD结构和现有突变体。已经分离了几个影响RNA结合和端粒酶活性的TERT的突变体。这些突变体中的几个被发现在TRBD结构域中，特别是在T-和CP-基序中。这两个基序中的单个和两个以及跨度为4-10个氨基酸的丙氨酸取代，当与野生型酶相比时，显示了RNA结合亲和性和聚合酶活性的中度到严重丧失(20-100％)(Bryan等，(2000)同上；Lai等，(2002)同上；Miller等，(2000)同上)。

一组突变体Phe476Ala，Tyr477Ala，Thr479Ala，Glu480Ala，Arg492Ala和Trp496Ala，显示出RNA结合亲和性和端粒酶活性的严重丧失(80-100％)，表明这些残基介导了与RNA底物的直接接触(Bryan等，(2000)同上；Lai等，(2002)同上)。所有5个残基都是T-基序的一部分，并且除了Phe476之外，所有它们的侧链都是溶剂暴露的。在结构中，Tyr477和Trp496二者位于T-口袋的基部，它们的侧链形成了“疏水钳状物”。假设这些残基的溶剂暴露的侧链参与与ssRNA的堆积相互作用，将它们突变成小的丙氨酸将可能损害底物结合，这可以解释RNA结合亲和性和端粒酶功能的急剧丧失。与Tyr477和Trp496相反，Phe476被埋，对于与核酸底物的相互作用来说是不可接近的。相反，Phe476位于β-发夹的基部，对T-口袋的形成有显著贡献。将该残基的大的疏水侧链突变成小的丙氨酸，将可能导致该口袋的构象重排和RNA结合亲和性和端粒酶活性的丧失。

也已经分离了第二组丙氨酸突变体Leu327Ala，Lys329Ala，Cys331Ala和Pro334Ala，它们显示了RNA结合亲和性和端粒酶活性的中度丧失(Bryan等，(2000)同上；Miller等，(2000)同上)。Leu327和Cys331与Phe476和Arg492侧链的脂族部分直接接触，二者都位于T-基序的基部。突变成较小的丙氨酸残基可能导致T-口袋的重排，潜在地导致与核酸底物的相互作用的丧失和功能的丧失。同样地，Pro334位于螺旋α12的背部，并与该结构元件的残基直接接触。螺旋α12含有不变的Trp496和保守的Lys493，二者形成了T-口袋的一部分。将Pro334突变成丙氨酸，可能导致螺旋α10的位移，和T-口袋的重新组织，导致功能的丧失。Lys329也位于螺旋α3上，与Leu327Ala、Cys331Ala和Pro334Ala不同，是溶剂暴露的，可能与核酸底物直接接触。将它突变成丙氨酸将导致RNA相互作用的失去以及RNA结合亲和性和端粒酶活性的丧失。

TRBD结构域介导的稳定RNP复合物的形成和重复序列添加的持续合成能力。在体内，端粒酶作为稳定的核糖核蛋白复合物存在，蛋白(TERT)和RNA成分(TER)之间的接触由TEN、TRBD和RT结构域介导。广泛的生物化学和诱变研究显示，TRBD参与了与TER的茎I和TBE的广泛的、特异性的相互作用(Lai等，(2001)同上；O′Connor等，(2005)同上)(图4)。TRBD与TER之间的接触被认为促进了RNP复合物的适合的组装和稳定性，并促进了重复序列添加的持续合成能力(Lai等，(2003)同上)。在纤毛虫中，除了TRBD之外，位于TRBD结构域N-末端方向的保守基序(CP2)被认为是TERT-TER组装和模板边界确定所必需的(Lai等，(2002)同上；Miller等，(2000)同上)。但是，到目前为止，还不清楚端粒酶TRBD如何执行该过程。本分析表明，TRBD结构域被分成两个不对称的一半，通过几个长的形状类似回飞棒(boomerang)的环连接，这种排列方式与RNA识别和结合有显著关联。分子两叶的总体组织导致在蛋白表面上形成了两个轮廓清晰的空腔(CP-和T-口袋)，它们由几个溶剂暴露的、不变/保守的残基构成。T-口袋是狭窄、深的空腔，位于分子的两半的连接处，其一部分在本质上是疏水的，而位于CP-口袋近端的部分带正电荷。有趣的是，Tyr477和Trp496的疏水侧链是溶剂暴露的，彼此堆积形成了狭窄的“疏水钳状物”，在该结构中不能容纳核苷酸碱基。但是，值得注意的是，含有Trp496的螺旋α12相对于含有Tyr477的β-发夹来说有些柔性。螺旋α12以及因此Trp496可以移动的能力，可能将两个侧链外展分开，从而允许在它们之间容纳核苷酸碱基所需的空间。另一种可能性是Tyr477和Trp496的极性基团可以一起发挥作为核苷酸碱基的作用，能够允许与引入的核苷酸碱基形成假性Watson-Crick相互作用。假性Watson-Crick相互作用以前已经在许多蛋白核酸复合物中观察到，包括Rho转录终止因子(Bogden等，(1999)Mol.Cell 3：487-493)以及信号识别粒子(Wild等，(2001)Science 294：598-601)。T-口袋的疏水部分的宽度和组织表明它结合ssRNA，更可能是TBE，可能由堆积相互作用的网络介导。

与T-口袋相反，CP-口袋是带正电荷的、浅的空腔，位于分子的侧面，形成了T-口袋的延伸。T-口袋与CP-口袋的亲水部分一起，排列有几个赖氨酸和精氨酸，其侧链是溶剂暴露的，可能参与了与双链RNA骨架的直接接触。该口袋的宽度和化学本质表明，它结合双链RNA，更可能是茎I或茎II(图4)。由TRBD结合口袋介导的蛋白/核酸相互作用的本质和程度，提供了功能性核糖核蛋白酶的适当组装所需的稳定性，并将TERT引导到与端粒酶功能有显著关联的TER结合位点上(在茎I和II之间)。

端粒酶在线性染色体的末端处添加多个短的寡核苷酸重复序列的能力是独特的。酶这样作用的能力已被部分归因于TRBD结构域与TBE、以及在纤毛虫中与TRBD和CP2基序二者的相互作用(Lai等，(2002)同上；Lai等，(2003)同上；Miller等，(2000)同上)。TBE由茎II和侧翼的ssRNA区域构成，位于茎I的下游和RNA模板仅仅几个核苷酸的上游(图4)。TRBD的结构表明，T-口袋，位于蛋白表面上只能够容纳ssRNA的狭窄的疏水空腔，可能在该过程中发挥重要作用。假设T-口袋与连接茎I和茎II的ssRNA结合，这种相互作用迫使茎II用作空间位阻，反过来迫使TRBD结构域保持在茎I和茎II的边界中。然后茎I和II锁定的TRBD结构域可以用作锚，限制了RT结构域可以移动的距离，并防止它移动到RNA模板的边界之外，从而促进了端粒酶添加的持续合成能力。但是，在纤毛虫中，单独的TRBD结构域不足以用于确定模板边界，它需要CP2基序的作用(Lai等，(2002)同上；Miller等，(2000)同上)。考虑到了CP2与TER的结合，通过有助于RNP复合物的稳定化作用，或者象TRBD一样，它可以用作锚阻止RT结构域的活性位点滑动到RNA模板之外，来促进模板边界的确定。

实施例2：赤拟谷盗(Tribolium castaneum)TERT的结构

蛋白表达和纯化。将合成的赤拟谷盗(T.castaneum)全长TERT基因克隆到其N-末端含有可切开的6个组氨酸标签的修改版本的pET28b载体中。将蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(pLysS)中，在30℃过表达4小时。细胞在50mM Tris-HCl，10％甘油，0.5M KCl，5mMβ-巯基乙醇和1mM PMSF，pH 7.5中，在冰上通过超声进行裂解。将蛋白首先在Ni-NTA柱上纯化，然后在4℃过夜用TEV切开6个组氨酸标签。将TERT/TEV混合物透析以除去过量咪唑，然后将蛋白在第二个Ni-NTA柱上进一步纯化，以除去所有带组氨酸标签的产物。然后将Ni-NTA流出液通过POROS-HS柱(Perseptive Biosystems)，以除去任何痕量的蛋白污染物。在该阶段时，蛋白纯度超过99％。最后将蛋白在用50mM Tris-HCl，10％甘油，0.5M KCl和1mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)，pH 7.5预先平衡的SEPHADEX-S200孔径排阻柱上纯化，以移除任何TRBT聚集物，并使用AMICON 30K截留分子量(MILLIPORE)将蛋白浓缩到10mg/ml，并储存在4℃用于随后的研究。在结晶试验前将蛋白储液在10mM Tris-HCl，200mM KCl，1mMTCEP，pH 7.5中透析。

蛋白结晶和数据收集。最初的单独蛋白的结晶试验不能产生晶体。蛋白与单链端粒DNA((TCAGG)₃)的共结晶产生了两种杆状晶体形式，其中一种属于斜方晶系P2₁2₁2₁，并衍射到

另一种属于六方晶系P6₁，衍射到

分辨率。在设置结晶试验之前，通过将一体积透析过的蛋白与1.2倍过量的DNA底物混合，来制备蛋白核酸混合物。形成了两种晶体，其中使用蒸汽扩散沉滴法，通过将一体积蛋白-DNA混合物与一体积储液器溶液混合进行生长。斜方晶体在存在50mM HEPES(pH 7.0)和1.5M NaNO₃的情况下生长，而六方晶体在存在100mM Tris(pH 8.0)和2M(NH₄)₂SO₄的情况下生长，都在室温下进行。将斜方晶体收获到含有50mM HEPES(pH 7.0)，25％甘油，1.7MNaNO₃，0.2M KCl和1mM TCEP的冷冻保护剂溶液中，并在液氮中速冻。将六方晶体收获到含有100mM Tris(pH 8.0)，25％甘油，2M(NH₄)₂SO₄，0.2M KCl和1mM TCEP的冷冻保护剂溶液中，也在液氮中速冻。数据在NSLS，光束线X6A下收集，并用HKL-2000处理(Minor(1997)Methods in Enzymology：Macromolecular Crystallography，part A276：307-326)(表5)。两种晶体形式在不对称晶格中含有二聚体。

表5

^*最高分辨率外壳显示在括号中。

结构确定和改进。使用在两种不同波长处(Hg1-

Hg2-

)从两种不同的汞(CH₃HgCl)衍生的晶体收集的数据组，使用带有反常信号的单一同晶置换(SIRAS)方法，获得了斜方晶体的初始相(表5)。衍生物通过将晶体用5mM甲基氯化汞(CH₃HgCl)浸泡15分钟来制备。最开始，使用SOLVE(Terwilliger(2003)MethodsEnzymol.374：22-37)定位了12个重原子位点并改进，使用MLPHARE(Collaborative Computational Project 4(1994)Acta Crystallogr.D50：760-763)计算新的相。使用MLPHARE增强的相，通过将反常差异图计算到分辨率，来鉴定剩余的重原子位点(总共22个)。然后将使用所有重原子位点获得的MLPHARE相用于带有二倍NCS的DM中，使用收集到的高分辨率数据组，在

波长处进行相扩展，以计算初始实验图。这些图对于在COOT中(Emsley &Cowtan(2004)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60：2126-32)进行模型构建已足够好。电子密度图显示出蛋白的所有596个残基的清晰的密度。但是，结构中核酸底物的密度没有观察到。使用CNS-SOLVE(Brunger等，(1998)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54：905-21)和REFMAC5(Murshudov等，(1997)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr53：240-55)二者对模型进行改进。最后一轮的改进使用如同在REFMAC5中进行的TLS限制来进行(表5)。使用P2₁2₁2₁改进过的模型，通过使用PHASER(Potterton等，(2003)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 59：1131-7)进行分子置换，解析了以P6₁结晶形式结晶的TERT的结构(数据在

波长处收集)。

TERT结构的构造。以

分辨率测定了赤拟谷盗(T.castaneum)活性端粒酶的全长催化亚基TERT的结构。正如显示的，在不对称晶胞(AU)中存在二聚体，但是单独的蛋白在溶液中明显是单体，正如通过凝胶过滤和动态光散射所显示的，表明在晶体中观察到的二聚体是晶体堆积的结果。这得到了下述事实的进一步支持，即同样蛋白的不同结晶形式(表5)也在不同构型的AU中包含二聚体。值得注意的是，来自该生物体的TERT不包含TEN结构域，这是端粒酶的低保守区域(图1B)。

TERT结构由三个不同的结构域构成，TER结合结构域(TRBD)、反转录酶(RT)结构域以及被认为代表了TERT的推衍的“拇指”结构域的C-末端延伸部分(图1A和1B)。正如本文显示的，TRBD主要是螺旋，在其表面上包含由两个分别结合双链和单链RNA的保守基序(CP和T)形成的缺口，已经被定义为是端粒酶TER的RNA底物的模板边界元件。来自赤拟谷盗的TRBD结构域与来自嗜热四膜虫结构的结构域的结构比较显示出两种结构是相似的(RMSD

)，表明在不同系统发育组的生物体中这些结构域之间的高度的结构保守性。

RT结构域是组织成两个亚结构域的α-螺旋和β-链的混合物，这两个亚结构域最类似于反转录病毒的反转录酶例如HIV反转录酶(PDBcode ID 1N5Y；Sarafianos等，(2002)EMBO J.21：6614-24)，病毒RNA聚合酶例如丙型肝炎病毒聚合酶(Code ID 2BRL；Di Marco等，(2005)J.Biol.Chem.280：29765-70)和B家族的DNA聚合酶例如RB69(PDBCode ID 1WAF；Wang等，(1997)Cell 89：1087-99)的“手指”和“手掌”亚结构域，并包含这些蛋白家族的里程碑式的关键标志基序(Lingner等，(1997)Science 276：561-7)(图3A-3C)。TERT与HIVRTs的结构比较，显示出TERT的“手指”亚结构域(即基序1和2)相对于“手掌”亚结构域(即基序A，B’，C，D和E)来说排列成开放的构型，这与HIV RTs在缺少结合的核苷酸和核酸底物的情况下所采用的构型非常一致(Ding等，(1998)J.Mol.Biol.284：1095-111)。TERT与HIV反转录酶的推衍的“手掌”结构域之间的一个显著差异，是TERT的基序A和B′之间被称为IFD基序的长的插入片段，它为端粒酶的持续合成能力所必需(Lue等，(2003)Mol.Cell Biol.23：8440-9)。在TERT结构中，IFD掺入片段由位于环的外周上“手指”与“手掌”亚结构域的界面处的两个反向平行的α-螺旋(α13和α14)构成。这两个螺旋与环平面的中心轴几乎平行定位，与螺旋α10和α15进行广泛接触，在RT结构域的该部分的结构组织中发挥重要作用。在病毒聚合酶中也存在类似的结构排列，在这些结构中，螺旋α10的等价物参与了与核酸底物的直接接触(Ferrer-Orta等，(2004)J.Biol.Chem.279：47212-21)。

与RT结构域相反，C-末端延伸部分是细长的螺旋束，含有几个表面暴露的长的环。在蛋白结构数据库中使用软件SSM(Krissinel &Henrick(2004)Acta Cryst.D60：2256-2268；Krissinel(2007)Bioinformatics 23：717-723)进行的搜索没有产生结构同源物，表明端粒酶的CTE结构域采用了新的折叠。TERT与HIV RT、病毒RNA聚合酶和B家族的DNA聚合酶的结构比较，将这些酶的“拇指”结构域和TERT的CTE结构域放置在相对于“手指”和“手掌”亚结构域相同的空间位置中，表明端粒酶的CTE结构域是酶的“拇指”结构域，该发现与以前的生物化学研究非常一致(Hossain等，(2002)J.Biol.Chem.277：36174-80)。

TERT结构域组织将构成分子的末端结构域的TRBD和“拇指”结构域带到一起，这种排列方式导致形成了类似汽车轮胎形状的环状结构(图1C)。几条证据表明，本文提出的TERT结构的结构域组织是生物学相关的。首先，在两种不同晶体形式中观察到的4个TERT单体的结构域(每种不对称晶胞中各2个)，其组织是相同的(所有4个单体之间平均

)。其次，TERT的N-和C-末端结构域之间的接触是广范围的

在本质上主要是疏水的，涉及氨基酸残基Tyr4、Lys76、Thr79、Glu84、Ser81、His87、Asn142、His144、Glu145、Tyr411、His415、Phe417、Trp420、Phe422、Ile426、Phe434、Thr487、Ser488、Phe489和Arg592。这个观察与以前的生物化学研究相一致(Arai等，(2002)J.Biol.Chem.277：8538-44)。第三，TERT结构域的组织与其最接近的同源物HIV反转录酶(Sarafianos等，(2002)同上)、病毒RNA聚合酶(Di Marco等，(2005)同上)和B家族的DNA聚合酶，特别是RB69(Wang等，(1997)同上)的聚合酶结构域(p66减去RNase H结构域)的组织相似。TERT结构域的排列方式在颗粒的内部产生了宽、

深的孔，足以容纳大约7到8个碱基长的双链核酸，与现有的生物化学数据非常一致(Forstemann &Lingner(2005)EMBO Rep.6：361-6；Hammond & Cech(1998)Biochemistry 37：5162-72)。

TERT环结合双链核酸。为了理解TERT环如何与RNA/DNA结合以形成功能性延伸复合物，使用TERT的最接近的结构类似物HIV反转录酶-DNA复合物(Sarafianos等，(2002)同上)，将双链核酸模拟到内部。TERT-RNA/DNA模型立即显示出某些显著的特点，支持了TERT-核酸结合的模型。TERT环的孔和核酸异源双链体突出以进行结合的部位排列有几个该家族聚合酶标志性的关键标志基序，它们已经被暗示参与了核酸结合、核苷酸结合和DNA合成。此外，这些基序的组织导致了在环的内部形成了类似于双链核酸骨架的几何形状的螺旋形。几个被鉴定为与DNA底物的接触点的基序，部分由带正电荷的残基形成，它们的侧链朝向环的中心延伸并互相平衡，用于与DNA底物的骨架直接接触。例如，高度保守的形成了螺旋α10的一部分的K210的侧链，位于模型化的DNA的骨架的配位距离内，从而提供了功能性端粒酶所需的稳定性。螺旋α10位于RT结构域的上部区段中，朝向环的内部。该螺旋的位置和稳定作用受到与IFD基序的广范围接触的强烈影响，该IFD基序与端粒酶的持续合成能力相关(Lue等，(2003)Mol.Cell Biol.23：8440-9)。通过该基序的缺失或突变破坏IFD与螺旋α10的接触，将导致螺旋α10从其当前位置的位移，反过来影响DNA结合和端粒酶功能。

定位于环内部的“拇指”结构域的结构元件，也与模型化的DNA底物进行了几处接触。具体来说，将“手掌”连接到“拇指”结构域上，并构成了也被称为端粒酶的“引物手柄”区的E基序的延伸部分的环(“拇指”环)，在相当大程度上保护了双链核酸骨架的几何形状。形成了该环的一部分的几个赖氨酸(例如Lys406，Lys416，Lys418)和天冬酰胺(例如Asn423)的侧链，朝向TERT分子的中心延伸，位于模型化的双链核酸骨架的配位距离之内。特别有趣的是Lys406。该赖氨酸位于基序E的近端，其侧链朝向核酸异源双链体延伸并处于平衡中，以便与位于引入的DNA引物的3’末端的核苷酸的骨架直接接触。因此，有可能该赖氨酸的侧链与基序E一起，帮助促进了在端粒延伸过程中将引入的DNA底物的3’-末端放置在酶的活性位点处。来自广范围系统发育组的TERTs的“拇指”结构域的序列比对，显示出预测与DNA底物接触的残基总是极性的(图3A-3C)。“拇指”结构域支持双链核酸结合的另一个特点是螺旋α19，一个3¹⁰螺旋(“拇指”3¹⁰螺旋)，它延伸到环的内部，显示出将它自身停靠在模型化双链核酸的小沟中，从而促进了RNA/DNA杂交体结合和稳定化。在酵母和人类TERT中缺失或突变相应的残基，导致TERT的持续合成能力的严重丧失，明确表明了该基序在TERT功能中的重要作用(Hossain等，(2002)J.Biol.Chem.277：36174-80；Huard等，(2003)Nucleic Acids Res.31：4059-70；Banik等，Mol.Cell Biol.22：6234-46)。

TERT的活性位点和核苷酸结合。本文显示的赤拟谷盗TERT结构是在不存在核苷酸底物和镁的情况下结晶的，但是，在现有生物化学数据(Lingner等，(1997)同上)，并与其最接近的类似物HIV反转录酶(Das等，(2007)J.MolI.Biol.365：77-89)的聚合酶结构域进行了结构比较的基础上确定了TERT的活性位点和核苷酸结合口袋的位置和组织。TERT活性位点由3个不变的天冬氨酸(Asp251，Asp343和Asp344)构成，它们形成了基序A和C的一部分，这两个基序是位于“手掌”亚结构域上并与TERT的“手指”接近的两个短的环。TERT与HIV反转录酶以及RNA和DNA聚合酶的结构比较显示，在这些蛋白家族的活性位点之间存在高度相似性，表明端粒酶也使用双金属机制进行催化。这些TERT天冬氨酸的丙氨酸突变体导致TERT活性的完全丧失，表明这些残基是端粒酶功能中不可缺少的角色(Lingner等，(1997)同上)。

端粒酶核苷酸结合口袋位于TERT的“手指”和“手掌”亚结构域的界面处，由形成了参与模板和核苷酸结合的基序1、2、A、C、B′和D的保守残基构成(Bosoy&Lue(2001)J.Biol.Chem.276：46305-12；Haering等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6367-72)。TERT与结合ATP的HIV反转录酶(Das等，(2007)同上)的结构比较，支持了核苷酸底物位于该位置中。分别来自基序A和C的两个高度保守的、表面暴露的残基Tyr256和Val342，形成了疏水口袋，它靠近并位于三个催化性天冬氨酸的上方，可以容纳核苷酸底物的基部。核苷酸结合在该油性口袋中，将三磷酸酯部分放置在酶的活性位点的近端，与一个Mg²⁺离子配位，同时它将核糖基团放置在不变的谷氨酰胺(Gln308)的配位距离内，该谷氨酰胺形成了基序B’的一部分，该基序B’据认为是底物特异性的重要决定子(Smith等，(2006)J.Virol.80：7169-78)。蛋白与核苷酸的三磷酸酯部分的接触由基序D介导，它是一个长的环，位于酶的活性位点下方。具体来说，不变的Lys372的侧链在核苷酸的γ-磷酸的配位距离之内，这种相互作用最可能在催化过程中帮之定位和稳定三磷酸酯基团。一起形成了长的β-发夹、形成了“手指”亚结构域的一部分的基序1和2的高度保守的Lys189和Arg194的侧链，也位于模型化的核苷酸的糖和三磷酸酯部分二者的配位距离内。与核苷酸底物的糖部分和三磷酸酯中的任何一个或二者的接触，将促进核苷酸结合和定位，以配位到引入的DNA引物的3’-末端上。

TRBD促进模板定位在TERT的活性位点处。与大多数DNA和RNA聚合酶相同，端粒酶进行的核酸合成需要TER的模板区域(通常为7到8个碱基或以上)与引入的DNA引物的配对(Lee&Blackburn(1993)Mol.Cell Biol.13：6586-99)。TRBD-RT结构域的组织在蛋白表面上形成了深的空腔，跨越分子壁的整个宽度，形成了允许从其侧面进入环的孔的缺口。该空腔相对于环的中心孔的排列方式，提供了在TERT-TER组装后，将RNA模板放置在环的内部和酶的活性位点所位于的部位的精巧的机制。特别重要的是形成了T-基序的一部分的β-发夹的排列方式。该发夹从RNA结合口袋伸出，与“拇指”环和基序1和2进行广泛接触。该发夹与“手指”和“拇指”结构域二者之间的接触，将TRED口袋朝向环内部的开口，放置到酶的活性位点附近。因此，有可能该β-发夹用作协同效应物开关，将RNA在环内部的结合，与RNA模板在酶的活性位点处的放置相偶联。将模板放置在分子的内部，将便于它与引入的DNA底物的配对，它们一起将形成端粒延伸所需的RNA/DNA杂交去。RNA/DNA配对是端粒合成的先决条件，因为它将引入的DNA引物的3’-末端带到酶的活性位点附近用于核苷酸添加，同时异源双链体的RNA成分为在染色体的末端忠实添加相同的DNA重复序列提供了模板。引人注目的是，RNA/DNA异源双链体在TERT环内部的模拟，将RNA底物的5’-末端放置在RNA结合口袋的入口处，预计TERT将与TER结合的位置，同时将引入的DNA引物的3’-末端放置在TERT活性位点处，提供了功能性端粒酶延伸复合物的组织的快照。

实施例3：端粒酶抑制剂的效能

本发明的新的端粒酶抑制剂可以在各种系统中进行分析。化合物可以在确定的、公知的、用于评估细胞通透性、毒性和药物动力学效应的模型系统中进行评估。这些分析方法包括基于细胞和基于动物的分析方法。

基于细胞的分析方法。将来自P388细胞株(CellGate，Inc.，Sunnyvale，CA)或人类恶性黑素瘤细胞株SK-MEL-2的细胞，生长在含有胎牛血清(10％)、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的RPMI 1640细胞培养基中，每周分成两份分裂两次。所有化合物首先用DMSO稀释。然后使用磷酸盐缓冲的盐水溶液进行连续稀释。所有稀释在玻璃小瓶中进行，最终的DMSO浓度一般低于0.5％体积。最后的2倍稀释在96孔板中使用细胞培养基进行，使每个孔含有50μL。对所有化合物在多个浓度上进行分析。细胞浓度使用血细胞计数器测量，最终的细胞浓度用细胞培养基调整为大约1X10⁴个细胞/mL。然后将获得的细胞溶液(50μL)加入到每个孔中，将板在37℃、5％CO₂下，在加湿的培养箱中温育5天。然后向每个孔加入MTT溶液(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物，10μL)，将板在同样条件下重新温育2小时。然后向每个孔添加酸化异丙醇(150μL含有0.05N HCl的i-PrOH)并充分混合。然后将板在595nm扫描，并读取吸光度(Wallac Victor1420 Multilabel Counter)。然后分析获得的数据，以确定ED₅₀值。杀死癌细胞，但是不杀死正常细胞的化合物，可以在癌症的预防或治疗中发现应用。

小鼠卵巢癌异种移植模型。本发明的化合物在癌症的卵巢癌异体移植物模型中，根据Davis等的描述((1993)Cancer Research53：2087-2091)进行评估。简单来说，该模型包括将1X10⁹个OVCAR3-icr细胞接种在雌性nu/nu小鼠的腹腔中。在例如注射肿瘤细胞之前或之后，将一种或多种测试化合物作为在1％甲基纤维素中的悬液通过口服途径给药，或作为在含有0.01％TWEEN-20的磷酸缓冲盐水中的悬液腹膜内给药。在实验得出结论时(4-5周)，对腹膜细胞的数量进行计数，并称量任何实体肿瘤沉积物。在某些实验中，肿瘤的发生通过测量肿瘤特异性抗原来监测。

大鼠乳腺癌模型。本发明的化合物在癌症的HOSP.1大鼠乳腺癌模型中进行评估(Eccles等，(1995)Cancer Res.56：2815-2822)。该模型包括将2x10⁴个肿瘤细胞静脉内接种到雌性CBH/cbi大鼠的颈静脉中。在例如注射肿瘤细胞之前或之后，将一种或多种测试化合物作为在1％甲基纤维素中的悬液通过口服途径给药，或作为在磷酸缓冲盐水和0.01％TWEEN-20中的悬液腹膜内给药。在实验得出结论时(4-5周)，将动物杀死，取出肺脏，在Methacarn中固定20小时后，对单个肿瘤进行计数。

小鼠B16黑素瘤模型。在C57BL/6中的B16黑素瘤模型中评估了本发明的化合物的抗肿瘤转移潜力。用2X10⁵个从体外培养物收获的B16/F10鼠肿瘤细胞静脉内接种小鼠。抑制剂作为在1％甲基纤维素中的悬液通过口服途径给药，或作为在pH 7.2磷酸缓冲盐水和0.01％TWEEN-20中的悬液腹膜内给药。在细胞接种后14天杀死动物，取出肺脏并称重，然后在Bouin′s溶液中固定。然后计数每组肺脏表面上出现的集落的数量。

序列表

<110>威斯特研究所

<120>调节端粒酶活性的化合物的鉴定方法

<130>SCT101896-30

<150>US 60/981,548

<151>2007-10-22

<150>US 61/090,726

<151>2008-08-21

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

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<212>PRT

<213>Tetrahymena thermophi la

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<213>Mus musculus

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<213>Schizosaccharomyces pombe

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<212>PRT

<213>Tribolium castaneum

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Leu Ile Tyr Gln Phe Gln Ser Leu Thr Asp Leu Ile Lys Pro Leu Arg

725 730 735

Pro Val Leu Arg Gln Val Leu Phe Leu His Arg Arg Ile Ala Asp

740 745 750

<210>15

<211>877

<212>PRT

<213>Tetrahymena thermophila

<400>15

Val Phe Lys Ser Ser Phe Phe Asn Tyr Ser Glu Ile Lys Lys Gly Phe

1 5 10 15

Gln Phe Lys Val Ile Gln Glu Lys Leu Gln Gly Arg Gln Phe Ile Asn

20 25 30

Ser Asp Lys Ile Lys Pro Asp His Pro Gln Thr Ile Ile Lys Lys Thr

35 40 45

Leu Leu Lys Glu Tyr Gln Ser Lys Asn Phe Ser Cys Gln Glu Glu Arg

50 55 60

Asp Leu Phe Leu Glu Phe Thr Glu Lys Ile Val Gln Asn Phe His Asn

65 70 75 80

Ile Asn Phe Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Phe Cys Lys Leu Pro Glu Asn

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Tyr Gln Ser Leu Lys Ser Gln Val Lys Gln Ile Val Gln Ser Glu Asn

100 105 110

Lys Ala Asn Gln Gln Ser Cys Glu Asn Leu Phe Asn Ser Leu Tyr Asp

115 120 125

Thr Glu Ile Ser Tyr Lys Gln Ile Thr Asn Phe Leu Arg Gln Ile Ile

130 135 140

Gln Asn Cys Val Pro Asn Gln Leu Leu Gly Lys Lys Asn Phe Lys Val

145 150 155 160

Phe Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Phe Val Gln Met Lys Arg Phe Glu Asn

165 170 175

Gln Lys Val Leu Asp Tyr Ile Cys Phe Met Asp Val Phe Asp Val G1u

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Trp Phe Val Asp Leu Lys Asn Gln Lys Phe Thr Gln Lys Arg Lys Tyr

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Ile Ser Asp Lys Arg Lys Ile Leu Gly Asp Leu Ile Val Phe Ile Ile

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Asn Lys Ile Val Ile Pro Val Leu Arg Tyr Asn Phe Tyr Ile Thr Glu

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Lys His Lys Glu Gly Ser Gln Ile Phe Tyr Tyr Arg Lys Pro Ile Trp

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Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Ile Val Lys Leu Glu Glu Glu Asn Leu

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Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Ile Pro Glu Asp Ser Phe Gln Lys Tyr

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Ile Ser Glu Lys Phe Ala Gln Phe Ile Glu Lys Trp Lys Asn Lys Gly

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Ser Ile Asp Gln Met Lys Leu Leu Asn Phe Phe Asn Gln Ser Asp Leu

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Met Thr Lys Leu Phe Gln Ile Asp Leu Lys Lys Ser Lys Gln Tyr Ser

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Leu Ser Gln Gln Lys Tyr Gln Leu Asn Lys Lys Glu Leu Glu Ala Ile

835 840 845

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850 855 860

Pro Lys Ile Ser Ala Lys Ser Asn Gln Gln Asn Thr Asn

865 870 875

<210>16

<211>790

<212>PRT

<213>Euplotes aediculatus

<400>16

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1 5 10 15

Glu Phe Val Ser Asn Lys Asn Asn Ile Ser Ala Met Asp Arg Ala Gln

20 25 30

Thr Ile Phe Thr Asn Ile Phe Arg Phe Asn Arg Ile Arg Lys Lys Leu

35 40 45

Lys Asp Lys Val Ile Glu Lys Ile Ala Tyr Met Leu Glu Lys Val Lys

50 55 60

Asp Phe Asn Phe Asn Tyr Tyr Leu Thr Lys Ser Cys Pro Leu Pro Glu

65 70 75 80

Asn Trp Arg Glu Arg Lys Gln Lys Ile Glu Asn Leu Ile Asn Lys Thr

85 90 95

Arg Glu Glu Lys Ser Lys Tyr Tyr Glu Glu Leu Phe Ser Tyr Thr Thr

100 105 110

Asp Asn Lys Cys Val Thr Gln Phe Ile Asn Glu Phe Phe Tyr Asn Ile

115 120 125

Leu Pro Lys Asp Phe Leu Thr Gly Arg Asn Arg Lys Asn Phe Gln Lys

130 135 140

Lys Val Lys Lys Tyr Val Glu Leu Asn Lys His Glu Leu Ile His Lys

145 150 155 160

Asn Leu Leu Leu Glu Lys Ile Asn Thr Arg Glu Ile Ser Trp Met Gln

165 170 175

Val Glu Thr Ser Ala Lys His Phe Tyr Tyr Phe Asp His Glu Asn Ile

180 185 190

Tyr Val Leu Trp Lys Leu Leu Arg Trp Ile Phe Glu Asp Leu Val Val

195 200 205

Ser Leu Ile Arg Cys Phe Phe Tyr Val Thr Glu Gln Gln Lys Ser Tyr

210 215 220

Ser Lys Thr Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asn Ile Trp Asp Val Ile Met Lys

225 230 235 240

Met Ser Ile Ala Asp Leu Lys Lys Glu Thr Leu Ala Glu Val Gln Glu

245 250 255

Lys Glu Val Glu Glu Trp Lys Lys Ser Leu Gly Phe Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Leu Arg Leu Ile Pro Lys Lys Thr Thr Phe Arg Pro Ile Met Thr Phe

275 280 285

Asn Lys Lys Ile Val Asn Ser Asp Arg Lys Thr Thr Lys Leu Thr Thr

290 295 300

Asn Thr Lys Leu Leu Asn Ser His Leu Met Leu Lys Thr Leu Lys Asn

305 310 315 320

Arg Met Phe Lys Asp Pro Phe Gly Phe Ala Val Phe Asn Tyr Asp Asp

325 330 335

Val Met Lys Lys Tyr Glu Glu Phe Val Cys Lys Trp Lys Gln Val Gly

340 345 350

Gln Pro Lys Leu Phe Phe Ala Thr Met Asp Ile Glu Lys Cys Tyr Asp

355 360 365

Ser Val Asn Arg Glu Lys Leu Ser Thr Phe Leu Lys Thr Thr Lys Leu

370 375 380

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740 745 750

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770 775 780

Leu Ile Gln Tyr Asp Ala

785 790

Claims

1.用于鉴定调节端粒酶活性的化合物的方法，包括

(a)设计或筛选与端粒酶TRBD结构域的至少一个氨基酸残基结合的化合物；以及

(b)测试在(a)中设计或筛选的化合物调节端粒酶活性的能力，由此鉴定调节端粒酶活性的化合物。

2.权利要求1的方法，其中TRBD结构域包含嗜热四膜虫(T.thermophila)端粒酶的254-519位氨基酸残基，或它们在来自其他物种的端粒酶中的等价氨基酸残基。

3.权利要求1或2的方法，其中化合物与TRBD结构域的CP-基序、T-基序和/或QFP-基序的至少一个氨基酸残基结合。

4.权利要求1、2或3的方法，其中化合物与表1中显示的至少一个氨基酸残基结合。

5.用于鉴定调节端粒酶活性的化合物的方法，包括

(a)设计或筛选与核苷酸结合口袋的至少一个氨基酸残基结合的化合物；以及

6.权利要求5的方法，其中化合物与表1中显示的手指亚结构域和/或手掌亚结构域的至少一个氨基酸残基结合。

7.权利要求5或6的方法，其中化合物与选自下列的至少一个氨基酸残基结合：赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的K189、R194、Y256、Q308、V342和K372，或它们在来自其他物种的端粒酶中的等价氨基酸残基。

8.用于鉴定调节端粒酶活性的化合物的方法，包括

(a)设计或筛选与直接接触DNA的至少一个氨基酸残基结合的化合物；以及

9.权利要求8的方法，其中化合物与表2中显示的拇指亚结构域和/或手掌亚结构域的至少一个氨基酸残基结合。

10.权利要求8或9的方法，其中化合物与选自下列的至少一个氨基酸残基结合：赤拟谷盗(T.castaneum)端粒酶的K210、K406、K416、K418和N423，或它们在来自其他物种的端粒酶中的等价氨基酸残基。

11.前述权利要求任一项的方法，其中化合物与至少2、3、4、5、6个或以上氨基酸残基结合。

12.前述权利要求任一项的方法，其中端粒酶是嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，智人(Homosapiens)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，小鼠(Musmusculus)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Oxytricha trifallax，小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)或赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的端粒酶。

13.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(a)在计算机上进行。

14.前述权利要求任一项的方法，其中步骤(a)在体外进行。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中化合物抑制端粒酶活性。

16.权利要求1-14任一项的方法，其中化合物刺激端粒酶活性。

17.前述权利要求任一项的方法，其中化合物与没有被通过突变鉴定为影响核苷酸结合、RNA结合、DNA结合或端粒酶活性的氨基酸残基结合。

18.前述权利要求任一项的方法，其中化合物将端粒酶的活性与没有接触化合物的端粒酶相比调节至少30％。

19.通过前述任一项权利要求的方法鉴定的化合物。