CN101829109A - 具有水通道蛋白调节作用的白果内酯及其衍生物在脑水肿治疗上的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,公开了一种白果内酯及其衍生物在治疗脑水肿特别是大脑缺血引起的脑水肿中的应用。研究结果表明,白果内酯能够减少永久性中动脉闭塞模型动物的脑组织水含量和梗死病灶面积。白果内酯减弱脑水肿形成的机制是在不同的阶段降低水通道蛋白1、4、9的mRNA转录和蛋白质的表达水平。白果内酯可以和药学上可以接受的载体结合制成临床上可以接受的注射剂、透皮制剂或口服给药制剂用于治疗脑水肿。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种白果内酯及其衍生物在治疗脑水肿特别是大脑缺血引起的脑水肿中的应用。
背景技术
白果内酯是从银杏叶中提取而得的萜类内酯的有效成分,是传统的银杏叶提取物中重要活性成分,具有很强的药理活性。白果内酯在动物大脑的缺氧及缺血损伤中发挥了神经保护作用(Chandrasekaran,K.;Mehrabian,Z.;Spinnewyn,B.;Drieu,K.;Fiskum,G.Brain research 2001,922,282-292.)。可以使线粒体在缺血条件下能保持其呼吸作用,从而可阻止缺血诱导的肝脏和大脑中呼吸作用的减少(Janssens,D.;Delaive,E.;Remade,J.;Michiels,C.Fundamental & Clinical Pharmacology 2000,14,193-201.);对NO诱导的PC 12细胞内神经毒有保护作用(Song,W.;Guan,H.J.;Zhu,X.Z.;Chen,Z.L.;Yin,M.L.;Cheng,X.F.Acta pharmacologica Sinica 2000,21,415-420.);可促进鼠星型胶质细胞内神经胶质细胞株起源的神经营养因子(GDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达(Zheng,S.X.;Zhou,L.;J.;Chen,Z.L.;Yin,M.L.;Zhu,X.Z.Acta pharmacologica Sinica 2000,21,151-155.);能减少缺血诱导的神经细胞凋亡,近期一些研究者将海马切片与N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)接触,实验结果表明,白果内酯能减少缺血时甘氨酸的释放(Kiewert,C.;Kumar,V.;Hildmann,O.;Hartmann,J.;Hillert,M.;Klein,J.Brain Research 2008,1201,143-150.)。在细胞兴奋性中毒时抑制甘氨酸的释放或许可以解释在胆碱释放和组织水肿型实验中观察到的白果内酯的神经保护作用。此外白果内酯通过增强谷氨酸脱羧酶活性来抑制4-O-甲基吡哆醇诱导的γ-氨基丁酸水平下降,即白果内酯具有抗4-O-甲基吡哆醇诱导的惊厥作用(Sasaki,K.;Hatta,S.;Wada,K.;Ohshika,H.;Haga,M.Life sciences 2000,67,709-715.);能够拮抗重组的GABA受体(Huang,S.H.;Duke,R.K.;Chebib,M.;Sasaki,K.;Wada,K.;Johnston,G.A.European journal of pharmacology 2003,464,1-8.)。
脑水肿,又称脑积水或水脑症,是指中枢神经系统对脑外伤、脑肿瘤、脑卒中等外源性或内源性有害因素的刺激所致脑损害产生的一种组织病理学反应,脑组织内水分异常增多,可使脑体积增大,重量增加,颅内压增高、脑疝,甚至死亡,危害严重。引起脑水肿的因素有很多,如颅脑损伤、颅内占位病变、感染、脑血管病、外源性或内源性中毒、脑的放射性损害、冷冻伤、妊娠高血压病、脑代谢障碍、脑缺氧、全身性疾病等。其中,急性中风和脑外伤引起的脑水肿所占比例最大。
根据发生机制,脑水肿可分为血管源性脑水肿、细胞中毒性脑水肿、间质性脑水肿等,但往往多种类型脑水肿同时出现,目前的临床治疗主要局限于渗透性利尿或外科减压,可采用高渗药物或肾上腺皮质甾类药物等来治疗脑水肿。如:甘露醇可作为广泛性脱水剂;甘油果糖可提高血浆渗透压,夺取组织内水分,促进利尿,从而减轻脑水肿,缩小脑体积,降低颅内压力;利尿药如呋塞米,是伴有心肺肾功能障碍患者的首选药;糖皮质激素如地塞米松、泼尼松龙或甲泼尼龙可稳定血-脑屏障、改善局部脑组织微循环、稳定溶酶体膜、抑制内源性神经内啡肽的释放、减缓炎症反应等。目前的临床治疗尚缺少针对脑水肿形成机制方面的治疗。
水通道蛋白(AQP)存在于动物、植物和微生物的细胞膜中,这是一种负责转运水的特定蛋白。目前已经发现的哺乳动物的AQP有13种,从AQP0到AQP12(Ishibashi,K.Handbook of experimental pharmacology 2009,251-262.)。所有的AQP蛋白都是由5个相连的环组成,并且都有6个跨膜区域。文献报道AQP1、AQP4和AQP9主要分布在脑组织中,此外它们可能在保持细胞外平衡和维持正常的神经活动中起重要作用。对大脑内部环境的破坏常常导致区域性的脑水肿。对AQP1,4,9表达量的研究数据表明,AQP蛋白的上调与脑组织膨胀有关。所以在脑水肿早期使用AQP蛋白的抑制剂可以阻碍水肿液进入脑组织,从而治疗脑水肿。因此,AQP可以成为治疗脑水肿的一个新的靶点。(Griesdale,D.SurgicalNeurology 2004,61,418-421)
发明内容
本发明公开了一种白果内酯及其衍生物在治疗脑水肿特别是大脑缺血引起的脑水肿中的应用。本发明人的前期研究表明,银杏总内酯具有神经保护作用(专利授权公开号:CN100569234)。在此基础和上述背景情况下,本发明人进行了深入地研究,建立了白果内酯单一组分(纯度>98%,用高效液相色谱联机蒸发光通用检测器检测见附图1)的制备方法,并制备了多种白果内酯衍生物,药理试验结果显示:白果内酯能显著地而且特定地减弱水肿的形成,白果内酯减弱脑水肿形成的机制是在不同的阶段降低AQP蛋白的表达。
本发明可通过以下内容进一步阐述
白果内酯结构确认
制备的白果内酯通过红外(IR)、质谱(MS)、核磁(1H-NMR、13C-NMR)进行结构确认,数据如下:
IR:3467.3,2962.6,1790.7,1364.3,865.4,792.0
MS:325.3(M-1)
1H-NMR:7.25(1H,d),6.26(1H,s),5.40(1H,s),5.14(1H,d),4.90(1H,t),2.89(1H,d),2.74(1H,d),2.54(1H,m),2.06(1H,m),1.02(9H,s)
13C-NMR:176.9,173.2,172.7,98.9,85.2,82.4,67.8,64.9,57.3,41.1,36.7,35.3,26.1
对照文献,所得数据与文献值基本一致,可判定所得为白果内酯。
白果内酯对栓塞后脑组织含水量的变化的影响
如附图2所示,大鼠永久性中动脉闭塞(pMCAO)24h后梗死半球水含量从75.30±0.28%增加至81.61±0.56%(所有数据均为平均值±标准差),可见pMCAO引起的脑水肿非常严重。而且梗死侧(左)半球比对侧(右)严重(R,&p<0.05)。给药组动物的脑组织水含量明显少于对照组,即pMCAO后24h患侧水含量为79.49±0.79%。梗死侧半球和对侧都是这种情况(#p<0.05),这表明用白果内酯预治疗动物可以减少pMCAO后脑水肿的形成。
白果内酯对栓塞后的脑梗死区域体积变化的影响
用PhotoShop软件计算脑组织四部分的梗死区域体积。大鼠pMCAO后24h将其处死,将脑组织冠切成2mm厚。线粒体活动不足的区域显示苍白色(附图3)。对照组大鼠大脑梗死总体积是30.59±1.21%(A),而给药组大鼠是18.92±3.24%(P<0.05,n=3)。显然,用白果内酯预处理能降低梗死体积。
白果内酯的神经保护作用
甲苯胺蓝染色可以观察到神经细胞中的尼氏体。如果神经细胞受到损伤,尼氏体就会溶解甚至消失。随着pMCAO时间的延长,该现象会越来越严重,越来越多的神经细胞中的尼氏体溶解、消失。但如附图4所示,用白果内酯预处理可以减少尼氏体的溶解或消失。在整个大脑范围内,海马是对缺血非常敏感的部位,CA1区的锥体细胞最敏感。附图4F显示给药组动物的CA1区的锥体细胞损伤较轻。
白果内酯对GFAP的免疫表达的影响
缺血损伤后,GFAP免疫染色可以揭示反应性胶质化的情况。患侧及对侧半球包括缺血中心均呈现较强的GFAP阳性反应(附图5),并且包括灰质和白质在内患侧均强于对侧,但是在pMACO后24h反应变弱。白果内酯预治疗能减少反应性胶质化现象。在对侧半球这种作用更为明显。右侧大脑半球在pMCAO后16h呈现减弱的反应性胶质化现象。
pMCAO后白果内酯对AQP1表达量的影响
如附图6所示,由脑梗死诱发的大鼠脑水肿损伤中,神经元和胶质细胞在皮层和白质中出现强烈的阳性反应。随着pMCAO后时间的延长,阳性反应越来越强烈,但pMCAO 24h后免疫反应变弱。预先注射白果内酯能显著减少AQP1在神经元和神经纤维尤其是pMCAO 8h和16h后胶质细胞的免疫反应。
AQP1在大脑的脉络从中表达,脉络丛在脑脊液的形成过程中起着重要作用(Speake,T.;Freeman,L.J.;Brown,P.D.Biochimica et biophysica acta 2003,1609,80-86.)。研究表明,基础条件下脑血管中仅有少量AQP1表达,这说明生理条件下AQP1对血液和大脑间的水分子转运不起关键的作用(Kobayashi,H.;Yokoo,H.;Yanagita,T.;Satoh,S.;Kis,B.;Deli,M.;Niwa,M.;Wada,A.Brain research 2006,1123,12-19.)。
免疫组化染色发现,随着闭塞时间的延长,越来越多的神经细胞中出现AQP1强阳性反应,同时胶质细胞也出现强阳性反应。但在pMCAO后24h,如图5所示,胶质细胞呈阴性表达而神经元呈弱阳性表达。实时RT-PCR定量系统分析结果表明,pMCAO后在大鼠脑皮层和白质中对AQP 1mRNA的调节有所不同。pMCAO后8hAQP1mRNA急剧上调,16h后明显下调,梗死侧半球尤为显著。梗死侧皮质中AQP1mRNA上调出现在pMCAO24h后,这至少说明,缺血性脑水肿的形成与AQP1有关。
经过白果内酯预治疗,pMCAO后AQP1的mRNA和蛋白质都明显减少。实时RT-PCR定量分析发现,这种情况在梗死侧半球更为明显。
pMCAO后白果内酯对AQP4表达量的影响
染色后大鼠的软脑膜和皮层中出现较弱的阳性反应,而AQP4在正常大鼠的脑白质中也有表达。pMCAO后,缺血导致AQP4在大鼠软脑膜和皮层内的神经元和神经纤维中过量表达(附图7),而且pMCAO 8h后这种情况在梗死侧大脑半球中比对侧严重得多。AQP4在白质内的胶质细胞有微量表达(图中未示)。pMCAO 16h后AQP4在软脑膜中阳性反应变强,在皮层中阳性反应变弱,而在白质的胶质细胞中表达增强(图中未示)。pMCAO 24h后,对侧半脑的神经纤维中有非常微量的表达,但在软脑膜中仍出现阳性表达。同时,在血脑屏障的星形胶质细胞足突和胶质细胞中呈阴性,而血管内皮细胞中呈阳性。预先注射白果内酯能显著地减少pMCAO 8h后AQP4在胶质细胞内和在软脑膜及皮层中神经元内的表达,尤其在梗死侧的半球的软脑膜和对侧皮层中效果明显。在pMCAO 24h后,AQP4在给药组神经纤维内的表达减少。
AQP4仅对水分子通透,在脑组织中广泛分布,而且与电解质代谢和分布密切相关。它还能调节脑组织的渗透压,因此成为脑水肿研究的热点(Fu,X.;Li,Q.;Feng,Z.;Mu,D.Glia 2007,55,935-941.)。在正常大鼠的脑组织中,AQP4mRNA和蛋白质的表达多于AQP1和AQP9(Dun,S.Neural RegenerationResearch 2007,2,234-238.)。经组织学证实,在缺血中心的边缘区域,AQP4的免疫反应比中心区强烈,AQP4的免疫反应主要发生在星形胶质细胞中,包括面向微血管侧终足在内的所有部分(Taniguchi,M.;Yamashita,T.;Kumura,E.;Tamatani,M.;Kobayashi,A.;Yokawa,T.;Maruno,M.;Kato,A.;Ohnishi,T.;Kohmura,E.;Tohyama,M.;Yoshimine,T.Brain research.Molecular brainresearch 2000,78,131-137.,Lee,M.;Lee,S.;Choi,H.;Jung,Y.;Frokiar,J.;Nielsen,S.;Kwon,T.Brain Research 2008,1195,1-11.)。的确,AQP4的表达与血脑屏障的损伤有关,而且脑水肿时在调节脑渗透压方面起着重要作用(Vizuete,M.L.;Venero,J.L.;Vargas,C.;Ilundáin,A.A.;Echevarría,M.;Machado,A.;Cano,J.Neurobiology of disease 1999,6,245-258.)。
用白果内酯预处理后,pMCAO 8h后AQP4在软脑膜和神经纤维中的表达显著减少,而且AQP4mRNA比对照组少。
如附图5所示,pMCAO后预治疗组的GFAP在星形胶质细胞中的表达受到抑制。免疫组化染色发现,AQP4主要分布于神经胶质细胞中(Nielsen,S.;Arnulf Nagelhus,E.;Amiry-Moghaddam,M.;Bourque,C.;Agre,P.;PetterOttersen,O.J.Neurosci.1997,17,171-180.)。脑缺血与细胞损伤有关,特征是广泛地激活胶质细胞或反应性胶质化作用。因为在脑损伤后,核苷、核苷酸和谷氨酸盐从受损区域中释放出来,这些物质能诱导小胶质细胞增殖,激活小胶质细胞和星形胶质细胞。而白果内酯能显著抑制星形胶质细胞的活动,控制胶质增生。所以使用白果内酯预治疗后AQP4的表达受到了抑制。
pMCAO后白果内酯对AQP9表达量的影响
正常大鼠的脑白质和脑灰质中AQP9的表达呈阴性。pMCAO后,大脑患侧和对侧内胶质细胞和神经元中AQP9表达都呈强阳性。如附图8所示,pMCAO 8h后,在左右两侧大脑半球中这种情况没有明显不同。pMCAO 16h后,患侧脑半球比对侧出现更严重的阳性反应(图中未示)。pMCAO 24h后,在神经元和星形胶质细胞中出现微弱的AQP9阳性反应,而少突胶质细胞仍呈现较强的阳性反应。给药组的胶质细胞和神经元中AQP9的阳性反应明显减少,尤其在pMCAO 8h和16h后在患侧白质和对侧大脑皮层中,这种现象更为明显。但是,在pMCAO 24h后,给药组和对照组中AQP9的免疫反应情无显著差异。
一些研究者在星形细胞培养物中发现AQP9的mRNA(Tsukaguchi,H.;Shayakul,C.;Berger,U.V.;Mackenzie,B.;Devidas,S.;Guggino,W.B.;van Hoek,A.N.;Hediger,M.A.The Journal of biological chemistry 1998,273,24737-24743.),不过Elkjaer等人首先说明了在大鼠脑室膜细胞和下丘脑内侧基底存在这种蛋白(Elkjaer,M.;Vajda,Z.;Nejsum,L.N.;Kwon,T.;Jensen,U.B.;Amiry-Moghaddam,M.;J.;Nielsen,S.Biochemical andbiophysical research communications 2000,276,1118-1128.)。随后的研究发现其他啮齿类动物大脑中也有AQP9的表达。人们在胶质细胞尤其是脑室膜细胞和星形胶质细胞(Badaut,J.;Hirt,L.;Granziera,C.;Bogousslavsky,J.;Magistretti,P.J.;Regli,L.Journal of cerebral blood flow and metabolism 2001,21,477-482.)、内皮细胞和神经元(Badaut,J.;Petit,J.-M.M.;Brunet,J.-F.F.;Magistretti,P.J.;Charriaut-Marlangue,C.;Regli,L.Neuroscience 2004,128,27-38.)中发现了AQP9,迄今为止,多数研究显示,AQP9在脑组织的新陈代谢中起着甘油和一元羧酸通道的作用。
大鼠在脑梗死后的瞬间,梗死部位边缘的星形胶质细胞上的AQP9蛋白受到上调,这种上调作用主要存在于在皮层、腹侧苍白球及杏仁核内星形胶质细胞上。
我们的研究发现,用白果内酯预治疗能够下调AQP9mRNA和蛋白质的表达。由试验证实,AQP9对水、甘油和乳酸盐的通透性在病理条件(如脑缺血)下发挥着重要作用。缺血时的乳酸性酸中毒可能会增加AQP9的透水性,导致星形胶质细胞摄取过量乳酸盐,这样,AQP9就可以转运细胞外的乳酸盐和甘油(S chulz,M.K.;Wang,L.P.;Tange,M.;Bjerre,P.Journal of neurosurgery2000,93,808-814.)。另外,近期研究报告显示,乳酸能增加星形胶质细胞表面AQP4的表达水平(Morishima,T.;Aoyama,M.;Iida,Y.;Yamamoto,N.;Hirate,H.;Arima,H.;Fujita,Y.;Sasano,H.;Tsuda,T.;Katsuya,H.;Asai,K.;Sobue,K.Neuroscience research 2008,61,18-26.)。白果内酯能减少缺血状态下甘氨酸的释放(Kiewert,C.;Kumar,V.;Hildmann,O.;Hartmann,J.;Hillert,M.;Klein,J.Brain Research 2008,1201,143-150.)。
pMCAO后白果内酯对AQP1,AQP4,AQP9mRNA的表达的影响
从免疫组化的结果可以看出,pMCAO后在脑灰质和白质中有不同程度mRNA的表达。所以我们分别研究了AQP1,AQP4,AQP 9的mRNA在灰质和白质中的表达情况。
如附图9所示,在对照组灰质中,AQP1的mRNA在pMCAO后8h和16h仅略有增加,而到了24h则大量表达,梗死侧与对侧有显著差异(n=4,P<0.05)。同样的情况也出现在预治疗组中,但是AQP1的mRNA水平要比对照组低得多。在白质中的情形有所不同,pMACO后8h AQP1的mRNA显著增加,到了16h和24h后增加缓慢,而且对照组中对侧AQP1的mRNA比梗死侧高得多。预治疗组通对照组,但8h后AQP1的mRNA水平比对照组低很多(n=4,P<0.05)。
pMACO后8h梗死侧半球皮质中AQP4的mRNA数量比对侧多(附图10),但对侧白质中AQP4的mRNA数量比患侧明显上调,然后都下降。在皮质中,pMCAO后AQP4的mRNA水平显著增加,与对照组有显著差异。预治疗组皮质中AQP4的mRNA数量在pMACO16h后达到高峰。而且AQP4的mRNA水平比对照组的低。
pMACO后对照组梗死侧灰质中AQP9的mRNA水平持续上升(附图11),但对侧AQP9的mRNA水平在16h才开始上升,预治疗组AQP9的mRNA比对照组明显减少。pMACO后16h白质中的AQP9的mRNA数量上升,8h和16h时预治疗组AQP9的mRNA明显减少于对照组(n=4,P<0.05)。
白果内酯抗水肿可能的分子机制
近期的报道认为胶质细胞在脑损伤后受到很大的影响(Borlongan,C.V.;Yamamoto,M.;Takei,N.;Kumazaki,M.;Ungsuparkorn,C.;Hida,H.;Sanberg,P.R.;Nishino,H.The FASEB journal 2000,14,1307-1317.),在神经元凋亡之前会出现胶质细胞减少或者神经胶质过多症。正如甲苯胺蓝染色和GFAP免疫的免疫反应所示,在白果内酯预治疗组中,胶质细胞缺失和神经胶质过多症都明显减少,反之对照组大鼠缺血中心的胶质细胞缺失现象和缺血半影区的神经胶质过多症非常严重。尽管随时间变化AQP蛋白的表达不尽相同,但是在缺血早期预治疗组的AQP1、AQP4和AQP9的表达都受到下调。
体内和体外的研究表明,白果内酯的作用机制非常复杂,它可能与保护线粒体ATP合成、抑制十字孢碱诱发的细胞凋亡和脑组织缺氧诱导的膜结构退化等机理有关(Chandrasekaran,K.;Mehrabian,Z.;Spinnewyn,B.;Drieu,K.;Fiskum,G.Brain research 2001,922,282-292,Pierre,S.;Jamme,I.;Droy-Lefaix,M.T.;Nouvelot,A.;Maixent,J.M.Neuroreport 1999,10,47-51.)。早期的体外研究研究发现,对钠钙流和抗氧化剂的抑制能够对抗脑水肿的形成(LoPachin,R.M.;Gaughan,C.L.;Lehning,E.J.;Weber,M.L.;Taylor,C.P.Neuroscience2001,103,971-983.)。在细胞兴奋性中毒时抑制甘氨酸的释放或许可以解释在胆碱释放和组织水肿型实验中观察到的白果内酯的神经保护作用。这些作用可能对保持缺血区的离子平衡有重要意义。
AQP蛋白的表达量随时间的不同而变化,说明AQP在pMCAO后发挥着不同的作用,而白果内酯减弱脑水肿的主要机制就是在不同阶段减少AQP蛋白的表达。在缺血早期,白果内酯预治疗后可以抑制皮层中AQP4的表达,接着下调AQP9的表达,然后减少AQP1的合成。在白质中缺血早期,白果内酯预治疗后能抑制AQP1和AQP4合成,然后减少AQP9的表达。因此白果内酯在研究治疗脑缺血和脑水肿的疗法方面有非常重要的意义。
白果内酯可以和药学上可以接受的载体结合制成临床上可以接受的注射剂、透皮制剂或口服给药制剂用于治疗脑水肿。
附图说明
图1:白果内酯液相图;检测条件:色谱柱:C18柱(4.6*250),流动相:甲醇∶水=35∶65,流速:1ml/min,蒸发光检测器。
图2:白果内酯对pMACO诱发的脑水肿的作用;pMACO后,预治疗组(腹腔注射白果内酯10mg/kg)和对照组(腹腔注射生理盐水)的左侧(梗死侧)和右侧半脑的含水量均多于正常大鼠,而且左侧半脑的含水量多于右侧。(N=3,*:与正常相比,#:与对照相比,&:与右脑相比)。
图3:白果内酯对大鼠脑组织梗死区域的影响;pMCAO后24h处死大鼠,脑组织冠切为2mm厚薄片,TTC染色。线粒体活性不足的地方呈苍白色,对照组(A)大鼠梗死面积百分比为30.59+1.21%。而白果内酯预治疗组(B)的大鼠该数据为18.92+3.24%(P<0.05,所有数据为平均值±标准差,N=3)。
图4:白果内酯的神经保护作用(A-F)甲苯胺蓝染色;pMCAO 8h后,缺血侧脑灰质中尼氏体溶解,甚至消失(A)。左侧白质(B)和海马的CA1区(C)大多数神经元细胞体受损或消失。但给药组动物的灰质(D)、白质(E)和海马CA1区(F)内神经元数量增加。用白果内酯预治疗可减少尼氏体尤其是海马CA1区神经元的溶解和消失。
图5:GFAP在大鼠脑组织中的免疫反应;对照组和预治疗组的梗死侧半脑没有明显不同。白果内酯主要抑制pMCAO后右侧半脑星形胶质细胞的活动。(A-B)星形胶质细胞分布于皮质白质中,表现出轻微的阳性反应,但在右侧半脑中,白果内酯在pMCAO后16h和24h开始抑制反应性胶质化。(C,E,G)对照组大鼠右侧大脑皮层在pMCAO后8h,16h和24h出现强烈的阳性反应。(D,F,H)对照组大鼠右侧脑白质在pMCAO后8h,16h和24h出现强烈的反应性胶质化现象。(I,K,M)预治疗组的大鼠在pMCAO后8h,16h和24h,右侧皮质呈现GFAP的弱阳性反应。(J,L.N)预治疗组的大鼠在pMCAO后8h,16h和24h,右侧白质出现轻微的神经胶质过多症。
图6:AQP1在大鼠脑皮层和白质中的免疫反应;在正常大鼠皮层(A)和白质(B)中仅有少量的神经纤维有微弱的免疫反应。对照组大鼠的左侧皮层(C)和白质(D)在pMCAO后8h出现强烈的免疫反应。随着缺血时间的延长,左侧皮层(G)和白质(H)中AQP1的阳性反应更为剧烈。而到了24h后左侧皮层(K)和白质(L)的阳性反应减弱。预治疗组大鼠的左侧皮层(E)和白质(F)在pMCAO 8h后AQP1的阳性反应较弱对比AQP1的免疫反应发现,pMCAO后16h(I,J)和24h(M,N),预治疗组中皮层和白质的阳性反应比对照组的弱。pMCAO后16hAQP1的阳性反应最强,然后开始减弱,对照组和预治疗组均如此。
图7:AQP4在脑组织中的免疫表达;正常大鼠脑组织的软脑膜(A)和皮层(B)中仅有微弱的AQP4表达。对照组大鼠pMCAO后8h软脑膜(C)、左侧皮层(D)和右侧皮层(F)中出现AQP4强阳性反应,而右侧软脑膜则出现弱的阳性反应(E)。预治疗组大鼠pMCAO后8h左侧软脑膜(G)、右侧软脑膜(I)、右侧皮质(J)仅有较弱的阳性反应。(K,L)pMCAO后24h,左侧软脑膜和皮层。(M,N)pMCAO后24h,右侧软脑膜和皮层。(O,P)pMCAO后24h,预治疗组左侧软脑膜和皮层。(Q,R)pMCAO后24h,预治疗组右侧软脑膜和皮层。(S)pMCAO后24h,右侧白质的血脑屏障中除星形胶质细胞足突外没有AQP4表达。(T)pMCAO后24h,预治疗组情况同(S),白质胶质细胞中没有AQP4表达。
图8:正常大鼠白质(A)和灰质(B)中AQP9呈阴性表达;pMCAO后在缺血侧和对侧都有AQP9表达。但pMCAO后8h对照组(C)白质的阳性反应强于预治疗组(D),AQP9在对侧大脑皮层中大量表达,而且对照组(E)远远强于预治疗组(F),pMCAO后16h情况类似。用白果内酯预治疗能显著减少AQP9的表达,(G)为pMCAO后16h,对照组缺血半脑白质中的AQP9的表达。(F)为pMCAO后16h预治疗组缺血半脑白质中的AQP9的表达。(I)为pMCAO后16h对照组对侧半脑皮层中AQP9的表达。(J)为pMCAO后16h预治疗组对侧半脑皮层中AQP9的表达。
图9:pMCAO 8h、16h和24h后AQP1 mRNA在大鼠脑中的表达;用实时RT-PCR确定预治疗组和对照组mRNA的表达量。A为AQP1 mRNA在灰质中的表达,B为AQP1 mRNA在白质中的表达。(n=4,*:与正常相比,#:与对照相比,@:与右脑相比,P<0.05)。
图10:pMCAO 8h、16h和24h后AQP4 mRNA在大鼠脑中的表达情况;用实时RT-PCR确定预治疗组和对照组mRNA的表达量。C为AQP4mRNA在灰质中的表达。D为AQP4 mRNA在白质中的表达(n=4,*:与正常相比,#:与对照相比,@:与右脑相比,P<0.05)。
图11:pMCAO 8h、16h和24h后AQP9mRNA在大鼠脑中的表达情况。用实时RT-PCR确定预治疗组和对照组mRNA的表达量。E为AQP9mRNA在灰质中的表达。F为AQP9mRNA在白质中的表达(n=4,*:与正常相比,#:与对照相比,@:与右脑相比,P<0.05)。
具体实施方式
现在在下文通过非限制性实施例描述本发明:
实施例1
实验动物及白果内酯及其衍生物的制备
实验动物:
雌性Wister大鼠(250~300g),均在标准的条件即温度22℃和湿度70%下饲养,大鼠自由进食进水。
白果内酯的制备和鉴定
10kg绿色干燥银杏叶粗粉经50%乙醇回流提取2h得提取液。浓缩或回收溶剂并过滤,通过大孔树脂柱层析,用水醇洗脱,浓缩后过滤得滤液。滤液经有机溶剂萃取,有机层经浓缩后放置结晶得到总内酯80g。总内酯通过硅胶柱层析分离得到白果内酯20g。
白果内酯纯度大于98%(HPLC,色谱柱:C18柱(4.6*250),流动相:甲醇∶水=35∶65,流速:1ml/min,蒸发光检测器,见附图1)。结构确认:IR:3467.3,2962.6,1790.7,1364.3,865.4,792.0;MS:325.3(M-1);1H-NMR:7.25(1H,d),6.26(1H,s),5.40(1H,s),5.14(1H,d),4.90(1H,t),2.89(1H,d),2.74(1H,d),2.54(1H,m),2.06(1H,m),1.02(9H,s);13C-NMR:176.9,173.2,172.7,98.9,85.2,82.4,67.8,64.9,57.3,41.1,36.7,35.3,26.1,经与文献数据对比,确本品为白果内酯。
白果内酯供试品的制备
用0.9%氯化钠溶液加热溶解白果内酯,通过腹腔注射向大鼠给药,给药浓度为10mg/kg。
8,10-二乙酰基-白果内酯制备方法:
将500mg(1.53mmol)白果内酯与5ml醋酸酐110℃预热,加入880mg乙酸钾并逐渐升温至200℃并保持20min,而加入预冷的冰水,将析出沉淀过滤,滤出固体柱层析可得8,10-二乙酰基-白果内酯217mg。
实施例2
大鼠永久性中动脉闭塞(pMCAO)缺血损伤模型的构建
采用水合氯醛将雌性Wister大鼠(250~300g)麻醉,浓度为350mg/kg。实验过程中用加热灯使大鼠体温维持在37±0.5℃。通过颈部正中的一个切口,分离出左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。用4号外科丝缝合线结扎CCA和ECA,用微血管夹将ICA夹闭,在远心端剪一个切口。将涂有多聚赖氨酸的0.22mm尼龙丝线一段蘸上石蜡,延CCA的切口插入ICA。移去微血管夹后迅速将丝线继续向前插入至距ECA和ICA分叉部位20mm的位置以阻塞中动脉。实验动物需要在温和的加热器中恢复6个小时,然后将它们放回笼中。给药组在造模之前腹腔注射给药(10mg/kg),对照组腹腔注射含10%DMSO的生理盐水0.3ml。对大鼠进行2小时的监测以获得其行为学记录。观察者在不知其组别的情况下为每组大鼠进行神经功能缺失评分,描述如下:0分,无明显的神经功能损伤(正常);1分,提起尾巴时不能伸展右前肢(轻度);2分,向对侧转圈(中度);3分,静态时向对侧倾斜,不能自发行走(严重)。试验中使用评分为1或2分的大鼠。
实施例3
栓塞后脑组织含水量的变化
根据重量确定测量pMCAO后8h、16h或24h的脑组织含水量,为此,将大脑两半球表面烘干,转移至铝箔,称重(此为湿重),然后在105℃烤箱中烘干过夜。烘干的组织再次称重(此为干重),脑组织的含水量可以通过公式来测定:[(湿重-干重)/湿重]×100。
实验结果见附图2。
实施例4
栓塞后的脑梗死区域
造模24小时后,将大鼠断头取下脑组织,把脑组织冠切成2.0mm厚的薄片。用2%2,3,5,-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(sigma,USA)在37℃环境下孵化脑组织切片30分钟,梗塞部位呈白色而正常部位呈红色,然后转入4%多聚甲醛溶液(pH7.2)中固定。用数码相机给染色后的脑组织拍照。用图像分析软件计算每个大脑的梗死部位的面积。梗死体积就是所有动物的脑组织薄片梗塞区面积的平均值。
实验结果见附图3。
实施例5
组织学分析和免疫组织化学
在室温下,将取下的左右两侧脑组织在10%的中性甲醛中固定12小时,缓冲液选择0.1M PBS,pH7.4。用石蜡包埋组织后将其切成4μm厚的切片,进行苏木精和伊红染色(HE染色),观察脑组织的结构形态。
免疫组化时,样本首先在室温下在二甲苯中脱蜡,接着在一系列浓度的乙醇中再水合,然后脱水,在含有3%H2O2的PBS缓冲液中孵育15min以灭活内源性过氧化物酶。在PBS中简单清洗后,将切片浸入Tris-EDTA缓冲液中,高温高压下修复抗原2min。加一抗之前要将样本在正常兔血清中孵育以封闭非特异性结合。然后向样本加入一抗并在湿盒中4℃下孵育过夜,使用的一抗是鼠抗AQP-1,AQP-4,AQP-9多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)和羊抗GFAP多克隆抗体(DAKO,Danmark)。在PBS中洗涤3次,然后在生物素化的兔抗羊IgG中孵育30min,接下来在链霉菌抗生物素--过氧化酶复合体中孵育30min,再洗涤3次,通过二氨基联苯胺法使组织中与过氧化物酶结合的位点显色。阴性对照不加一抗,取而代之的是未免疫的山羊血清。各实验结果见附图4、5、6、7、8。
实施例6
实时RT-PCR定量分析
将大鼠的左右半脑切开,迅速放入液氮中,-70℃保存。将冰冻后的脑组织在Trizol试剂(Invitrogen,USA)中匀浆,每25mg组织使用1ml Trizol试剂。根据制造商提供的说明提取总RNA,主要步骤有氯仿提取、离心分离、70%乙醇溶解RNA,用RCP试剂重新溶解RNA,在260或280nm下测定吸收度,计算RNA浓度。用1.5%琼脂糖凝胶鉴定RNA的纯度。用RT-PCR试剂盒(Takara,Japan)做RT-PCR反应,由RNA合成cDNA。
用Premix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa公司,日本)和Line-GeneReal-Time PCR检测系统(博日科技有限公司,中国)进行PCR扩增。引物如下(Tenckhoff et al.,2005):
AQP1:5′-CTT ACC TCC AGG ACC CTT CC-3′(forward)
5′-TAG CTC ATC CAC ACG TGC TC-3′(reverse)NM_012778
AQP4:5′-CGG TTC ATG GAA ACC TCA CT-3′(forward)
5′-CAT GCT GGC TCC GGT ATA AT-3′(reverse),NM_012825
AQP9:5′-GAT GCC TTC TGA GAA GGA CG-3′(forward)
5′-AGA GAG CCA TCA CGA CTG C-3′(reverse),NM_022960;
GAPDH:5′-GCA GGG GGG AGC CAA AAG GGT-3′(forward)
5′-TGG GTG GCA GTG ATG GCA TGG-3′(reverse),M33197
引物由Invitrogen公司合成。扩增反应进行40个循环,用曲线表示每个循环的荧光强度(Yang et al.,2009)。循环温度为95℃变性,60℃退火,72℃延伸。在每个循环延伸阶段的终点检测荧光强度。按一定的标准分析荧光强度进而计算每个样本中目的分子的拷贝数。用GAPDH做内参,以它的表达量计算样本中mRNA的相对含量。另外,在PCR循环后做一个溶解曲线来确定扩增产物的性质。用标准曲线来推断大鼠脑中目的cDNA的拷贝数。实验结果见附图9、10、11。
实施例7
白果内酯冻干粉针的制备
白果内酯12g,右旋糖酐40150g,用2850ml的注射用水先将白果内酯原料药和右旋糖酐40加热搅拌至溶解。然后加入3g的针用活性炭,70℃搅拌30分钟,过滤。溶液温度降至室温后,用注射用水将溶液体积补至3000ml。在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤(除菌)。滤液分装于10mL西林瓶中,每支3mL,制成1000支。将分装好的西林瓶半压塞,装入冻干机中,按工艺条件进行冻干,冷冻结束后压塞、轧盖、灯检,全检,包装入库。
实施例8
白果内酯片剂的制备
白果内酯20g,微晶纤维素160g,硬脂酸镁20g,混合物用于打片,每片重0.2g,每片含本白果内酯0.02g。结合症状,每次服1-2片,每日2-3次。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的脑水肿为大脑缺血引起的脑水肿;
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,白果内酯及其衍生物是通过调节水通道蛋白实现对脑水肿的治疗作用;
4.权利要求1所述的化合物为:
白果内酯
8-甲氧基-白果内酯
10-甲氧基-白果内酯
8,10-二甲氧基-白果内酯
8-乙氧基-白果内酯
10-乙氧基-白果内酯
8,10-二乙氧基-白果内酯
8-卞基-白果内酯
10-卞基-白果内酯
8,10-二卞基-白果内酯
8-乙酰基-白果内酯
10-乙酰基-白果内酯
8,10-二乙酰基-白果内酯
8-甲磺酰基-白果内酯
10-甲磺酰基-白果内酯
8,10-二甲磺酰基-白果内酯
5.根据权利要求1,2,3所述的应用,其特征在于,所述的白果内酯通过如下方法制备:
1)绿色干燥银杏叶粗粉经含水醇回流提取后得提取液;
2)浓缩或回收溶剂并过滤,通过大孔树脂柱层析,用水醇洗脱,浓缩后过滤得滤液;
3)滤液经有机溶剂萃取,有机层经浓缩后放置结晶得到总内酯;
4)总内酯通过柱层析分离得到白果内酯。
6.根据权利要求1,2,3,4所述的应用,其特征在于,所述的白果内酯及其衍生物可以制成注射剂、透皮制剂或口服给药制剂。
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Citations (2)
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
但建新,等: "银杏叶提取物对大鼠创伤后脑细胞的保护作用", 《中国临床神经外科杂志》 * |
刘玺昌,等: "脑淋巴阻滞后SAH大鼠脑组织含水率和血管内皮细胞损害论著及银杏内酯的影响", 《临床和实验医学杂志》 * |
吴雪丰,等: "银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血的保护作用", 《中国药科大学学报》 * |
陈玉昆: "《萜类天然产物的提取及生产工艺》", 31 October 2009, 科学出版社 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103880857A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-06-25 | 石药银湖制药有限公司 | 银杏叶内酯及其提取制备方法与含其药物制剂 |
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