CN101824485A - 一种豇豆重花叶病毒反转录pcr分子检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种豇豆重花叶病毒反转录pcr分子检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。试剂盒包括引物CPSMVf和CPSMVr；CPSMVf为5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，R＝A或G，N＝I，M＝A或C；CPSMVr为5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，N＝I，R＝A或G。检测步骤：提取样品RNA，以CPSMVr为引物进行反转录反应；以反转录产物为模板，CPSMVf和CPSMVr为引物进行PCR反应，并进行电泳，若样品RNA在356bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了CPSMV。该方法具有快速、操作简便，特异性好、重复性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus，CPSMV)检测的试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
豇豆重花叶病毒(CPSMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)豇豆花叶病毒属(Comovirus)的确定种。该病毒的自然寄主为豆科植物，可严重侵染豇豆、大豆等多种作物。该病毒侵染豇豆后，可造成叶片花叶和斑驳，严重的可导致整株枯死；在田间对豇豆的侵染率可达100％，造成产量损失可达50％。
目前CPSMV主要分布在美洲地区，如美国、巴西、秘鲁、委内瑞拉、特立尼达、波多黎各、哥斯达黎加和苏里南等国，中国尚无发生与危害的报道。
CPSMV可通过种子进行远距离传播，其中豇豆的种传率为10％，长豇豆(Vignasesquipedalis)的种传率为8％；在田间，该病毒还可以通过菜豆叶甲(Ceratomatrifurcata)，带斑黄瓜叶甲(Diabrotica balteata)和南美叶甲(D.speciosa)等媒介昆虫及机械传播。该病毒的自然寄主在中国广泛种植，且气候条件与该病毒发生地的气候条件相似，因此，CPSMV传入、定殖和扩散的可能性都很大，并可随种子的调运或害虫的迁移而在国内传播。CPSMV已成为我国豆科植物尤其是豇豆和大豆生产潜在的巨大威胁。
鉴于该病毒的自然寄主豇豆和大豆等为中国的主要经济作物，能够对其造成很大的危害，中国已将该病毒列入“中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录”。
目前，CPSMV多采用DAS-ELISA试剂盒(即双抗夹心酶联免疫吸附法)检测，但该方法不够快速、灵敏、准确，难以适合检疫口岸使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种适宜于检疫口岸使用的豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，以便于口岸简便、快速、准确地对进口的豇豆种子进行豇豆重花叶病毒的检测。
本发明从豇豆种子或植株中提取病毒RNA，进行豇豆重花叶病毒RT-PCR检测。
本发明提供一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，包括如下试剂：dNTP混合物、无RNase的ddH2O、5×RT Buffer、RNase抑制剂、反转录酶、10×PCR Buffer、MgCl2溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq DNA聚合酶和ddH2O；所述CPSMVf序列为5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G，N＝I(次黄嘌呤核苷酸)，M＝A或C；所述CPSMVr序列为5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝I(次黄嘌呤核苷酸)，R＝A或G。
该豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，还含有用作阳性对照的豇豆重花叶病毒冻干粉。
本发明还提供利用所述试剂盒检测豇豆重花叶病毒的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA；
(2)反转录反应：以步骤(1)所述样品RNA为模板，以CPSMVr为引物进行反转录反应，获得反转录产物；阳性对照中的模板为所述的豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA；
(3)以步骤(2)所述的反转录产物为模板，以CPSMVf和CPSMVr为引物进行PCR反应，获得PCR产物；
(4)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若PCR电泳图谱中，对应于样品RNA的泳道在356bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了CPSMV。
步骤(2)所述反转录反应步骤为：在PCR管中配制反转录反应液，其组成为1μL浓度为10μM的CPSMVr，1μL浓度为10mmol/L的dNTP混合物，样品RNA，用无RNase的ddH2O补足体系至10μL；反应程序为：65℃反应5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中继续添加如下成分：4μL的5×RT Buffer，0.5μL浓度为40U/μL的RNase抑制剂，1μL浓度为200U/μL的RTase，4.5μL无RNase的ddH2O，反应程序为：42℃反应60min，70℃反应15min。
步骤(3)所述PCR反应体系的组成为：2μL的10×PCR Buffer(不含Mg2+)、2μL浓度为25mM的MgCl2、2μL浓度为2.5mM的dNTP混合物、浓度为20μM的CPSMVf和CPSMVr各0.5μL、0.2μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶以及2μL所述反转录产物，以ddH2O补足体系至20μL；所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
本发明提供的豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒及其检测方法。利用从美国菌种保藏中心(ATCC)引进CPSMV标准菌种，经测序后，综合已知的GeneBank中CPSMV外壳蛋白基因序列设计了一对特异性的简并引物，能较好地扩增出目标条带。该方法具有快速、操作简便，特异性好、重复性高等优点。针对该病毒可以通过种子传播的特点，对豇豆种子或植株都可以直接进行检测。本发明适合对进出境豇豆等豆类蔬菜种子及种苗中豇豆重花叶病毒的检测，在各植物检疫口岸具有良好的应用前景。
附图说明
图1用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒(CPSMV)的电泳图谱，其中M(bp)为marker，ck为阴性对照(灭菌双蒸水)，+为阳性对照(CPSMV)，1为感染CPSMV的豇豆种子，2为感染CPSMV豇豆叶片。
图2采用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒的特异性验证电泳图谱，其中M(bp)为marker，ck为阴性对照(灭菌双蒸水)，+为阳性对照(CPSMV)，1为豇豆花叶病毒，2为菜豆荚斑驳病毒，3为烟草环斑病毒，4为黑眼豇豆花叶病毒，5为大豆花叶病毒；
图3用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒(CPSMV)的灵敏度电泳图谱，其中M(bp)为marker，ck为阴性对照(灭菌双蒸水)，1～8分别对应的是总RNA量100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg；
具体实施方式
实施例1豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒
本发明豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒的组成如下：
dNTP混合物(10mmol/L)、无RNase的ddH2O、5×RT Buffer、RNase抑制剂(40U/μL)、RTase(200U/μL)、10×PCR Buffer(不含Mg2+)、MgCl2(25mM)、dNTP混合物(2.5mM)、CPSMVr(10μM)、CPSMVf(20μM)、CPSMVr(20μM)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)、ddH2O和阳性对照。
其中CPSMVf，CPSMVr设计过程如下如何：通过GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索，根据CPSMV外壳蛋白编码基因(登录号：NC003544、M83309)中的保守序列设计一对寡核苷酸引物，以CPSMV(美国菌种保藏中心标准菌种编号PV-273)为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增出产物后测序，根据测序结果以及GeneBank中CPSMV外壳蛋白编码基因(登录号：NC003544、M83309、AF263549、GQ229416)设计如下一对豇豆重花叶病毒的特异性寡核苷酸简并引物：上游引物(CPSMVf)：5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G、N＝I(次黄嘌呤核苷酸)、M＝A或C)；下游引物(CPSMVr)：5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝I(次黄嘌呤核苷酸)，R＝A或G。引物CPSMVf和CPSMVr预期的扩增产物大小为356bp。引物CPSMVf和CPSMVr由金思特科技(南京)有限公司合成。
阳性对照为豇豆重花叶病毒冻干粉，其制备方法为：利用CPSMV标准毒株(美国菌种保藏中心编号PV-273)为材料，接种健康的感病豇豆品种(Blackeye EarlyRamshorn)。植株发病后，采集发病的豇豆叶片，以1∶5(m/v)的比例加入样品抽提缓冲液，充分研磨成匀浆，制备成病汁液。将病汁液置于70℃水浴锅中，处理10分钟，使病毒灭活。然后将病汁液分装于安瓿瓶中，-40℃冷冻固化后，放入冷冻干燥机中，在-50℃、真空度0.04mBar的条件下冷冻干燥60小时，制备成豇豆重花叶病毒冻干粉。
其中抽提缓冲液的成分如下：2％(质量浓度)聚乙烯基吡咯烷酮，0.05％(质量浓度)吐温-20，pH7.4磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)。
其他试剂按照本领域内常规方法制备。
实施例2利用本发明试剂盒检测感病的豇豆叶片和种子样品
1.分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA
采用Trizol法分别提取样品及豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA。
利用CPSMV标准毒株(美国菌种保藏中心编号PV-273)为材料，接种感病豇豆品种(Blackeye Early Ramshorn)，发病后，采集叶片及发病种子，以发病植株的种子和叶片为样品。
种子样品的制备：根据豇豆感染该病毒后的症状特点，挑选粒小，粒瘪等症状的种子，经3％(m/v)次氯酸钠表面消毒10min后，用无菌水洗涤三次，选取种胚，加入液氮，充分研磨成粉状，制成样品。
叶片样品的制备：豇豆出苗至第一对真叶展平后，选取有疑似症状的植株的叶片，加入液氮，充分研磨成粉状，制成样品。
采用Trizol法分别提取样品：称取20mg样品，迅速将其移入灭菌的1.5ml离心管中，加入1mL TRIzoL试剂(Invitrogen公司产品)剧烈震荡摇匀3min后，在4℃、离心力12000g的条件下离心10min，取上清液，加入0.2mL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置3min；然后再次4℃、12000g条件下离心10min，取上层水相，加等体积的异丙醇，颠倒混匀；在4℃、12000g离心力的条件下离心10min，弃上清；加75％(体积浓度)的乙醇洗涤沉淀，在4℃、离心力7500g的条件下离心2min，弃乙醇；将沉淀在室温下充分干燥后，溶于30μL经焦碳酸二乙酯处理的双蒸水(ddH2O)中，置于-20℃保存备用。
豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA的提取方法同上。
2.反转录反应
在PCR管中配制下列混合液：
CPSMVr(10μM)：1μL
dNTP混合物(10mmol/L)：1μL
RNA(步骤1提取得到)：1μg
无RNase的ddH2O：补足体系至10μL
在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：65℃反应5min，冰上急冷。
在上述PCR管中继续添加如下成分：
5×RT Buffer：4μL
RNase抑制剂(40U/μL)：0.5μL
RTase(200U/μL)：1μL
无RNase的ddH2O：4.5μL
反转录反应总体积：20μL
反转录反应条件：42℃反应60min，70℃反应15min。
注：阳性对照中的模板是豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA，阴性对照为灭菌双蒸水。
3.豇豆重花叶病毒的特异性PCR扩增
按下列组分配制PCR反应体系(20μL)：
10×PCR Buffer(Mg2+-free)：2μL
MgCl2(25mM)：2μL
dNTP混合物(2.5mM each)：2μL
CPSMVf(20μM)：0.5μL
CPSMVr(20μM)：0.5μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)：0.2μL
模板(反转录产物)：2μL
ddH2O：补足体系至20μL
反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
此PCR反应的阳性对照为步骤2中的阳性对照产物。
4.结果分析
取8μl PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析系统上观察、拍照并记录结果。电泳结果(图1)表明，发病植株的种子和叶片均扩增出356bp的特异性条带，并与阳性对照大小一致，表明所检测的样品为阳性，也说明本发明提供的试剂盒可以用来检测豇豆重花叶病毒。
实施例3利用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒反转录PCR的特异性
1.特异性验证材料及病毒RNA提取
选取与豇豆重花叶病毒同属(豇豆花叶病毒属Comovirus)的豇豆花叶病毒(CPMV)和菜豆荚斑驳病毒(BPMV)，同科(豇豆花叶病毒科Comoviridae)的另外一个线虫传多面体病毒属(Nepovirus)烟草环斑病毒(TRSV)，豇豆上另外一个重要种传病毒马铃薯Y病毒属的黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)以及大豆花叶病毒(SMV)，进行豇豆重花叶病毒(CPSMV)RT PCR特异性验证。以上这些病毒毒源来源于美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection，简称ATCC)。病毒RNA的提取采用Trizol方法提取。
2.反转录反应
在PCR管中配制下列混合液：
CPSMVr(10μM)：1μL
dNTP混合物(10mmol/L)：1μL
RNA：1μg
无RNase的ddH2O：补足体系至10μL
在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：65℃反应5min，冰上急冷。
在上述PCR管中配制下列反转录反应液：
5×RT Buffer：4μL
RNase抑制剂(40U/μL)：0.5μL
RTase(200U/μL)：1μL
无RNase的ddH2O：4.5μL
反转录反应总体积：20μL
反转录反应条件：42℃反应60min，70℃反应15min。
注：阴性对照为灭菌双蒸水。
3.豇豆重花叶病毒的特异性PCR扩增
按下列组分配制PCR反应体系(20μL)：
lO×PCR Buffer(Mg2+-free)：2μL
MgCl2(25mM)：2μL
dNTP混合物(2.5mM each)：2.μL
CPSMVf(20μM)：0.5μL
CPSMVr(20μM)：0.5μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)：0.2μL
模板(反转录产物)：2μL
ddH2O：补足反应总体积20μL
反应条件为：94℃预变性3min：94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环：最后72℃延伸5min。
此PCR反应阳性对照为步骤2中的阳性对照产物。
4.结果分析
结果如图2，只有CPSMV在356bp处有扩增片段，而其他五个病毒均无扩增，
表明用本发明提供的试剂盒来检测豇豆重花叶病毒能满足PCR特异性反应的要求。
实施例4利用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒反转录PCR方法的灵敏度
1.分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA
样品为CPSMV标准毒株(美国菌种保藏中心编号PV-273)感染的豇豆叶片。
采用Trizol法分别提取样品及豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA。
2.反转录反应
在PCR管中配制下列混合液：
CPSMVr(10μM)：1μL
dNTP混合物(10mmol/L)：1μL
RNA(步骤1提取得到)：500ng
无RNase的ddH2O：补足体系至10μL
在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：65℃反应5min，冰上急冷。
在上述PCR管中继续添加如下成分：
5×RT Buffer：4μL
RNase抑制剂(40U/μL)：0.5μL
RTase(200U/μL)：1μL
无RNase的ddH2O：4.5μL
反转录反应总体积：20μL
反转录反应条件：42℃反应60min，70℃反应15min。
注：阳性对照中的模板是豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA。阴性对照为灭菌双蒸水。
3.PCR反应
反转录获得的cDNA溶液用EASY Dilution(TAKARA公司产品)按10倍梯度逐级稀释，各取2μL进行PCR反应。此时20μL PCR反应液中的cDNA添加量分别相当于100ng、10ng、1g、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg的总RNA量。此PCR反应的阳性对照为步骤2中的阳性对照产物。
按下列组分配制PCR反应体系(20μL)：
10×PCR Buffer(Mg2+-free)：2μL
MgCl2(25mM)：2μL
dNTP混合物(2.5mM each)：2μL
CPSMVf(20μM)：0.5μL
CPSMVr(20μM)：0.5μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)：0.2μL
模板(反转录产物)：2μL
ddH2O：补足体系至20μL
反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
4.结果分析
PCR反应产物的电泳结果表明，总RNA量从100ng至1pg均能扩增出356bp的目的片段，表明本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒的灵敏度可达1pg的总RNA量(如图3)。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120>一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒及其检测方法
<130>JSCHJ0904
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CPSMVf
<220>
<221>misc_feature - - -
<222>(9)..(9)
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<220>
<221>misc_feature
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<221>misc_feature
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<223>n＝i
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acacargtnm gnccngatac 20
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CPSMVr
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n＝i
<400>2
gctacnggac trctrctca 19
Claims (5)
1.一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，包括如下试剂：dNTP混合物、无RNase的ddH2O、5×RT Buffer、RNase抑制剂、反转录酶、10×PCR Buffer、MgCl2溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq DNA聚合酶和ddH2O；所述CPSMVf序列为5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G，N＝次黄嘌呤核苷酸，M＝A或C；所述CPSMVr序列为5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝次黄嘌呤核苷酸，R＝A或G。
2.根据权利要求1所述的豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，其特征在于还含有用作阳性对照的豇豆重花叶病毒冻干粉。
3.一种采用权利要求2所述的试剂盒检测豇豆重花叶病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA；
(2)反转录反应：以步骤(1)所述样品RNA为模板，以CPSMVr为引物进行反转录反应，获得反转录产物；阳性对照中的模板为所述的豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA；
(3)以步骤(2)所述的反转录产物为模板，以CPSMVf和CPSMVr为引物进行PCR反应，获得PCR产物；
(4)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若PCR电泳图谱中，对应于样品RNA的泳道在356bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了CPSMV。
4.根据权利要求3所述的检测豇豆重花叶病毒的方法，其特征在于：步骤(2)所述反转录反应步骤为：在PCR管中配制反转录反应液，其组成为样品RNA、1μL浓度为10μM的CPSMVr和1μL浓度为10mmol/L的dNTP混合物，用无RNase的ddH2O补足体系至10μL；反应程序为：65℃反应5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中继续添加如下成分：4μL的5×RT Buffer、0.5μL浓度为40U/μL的RNase抑制剂、1μL浓度为200U/μL的Rtase和4.5μL无RNase的ddH2O，反应程序为：42℃反应60min，70℃反应15min。
5.根据权利要求3或4所述的检测豇豆重花叶病毒的方法，其特征在于：步骤
(3)所述PCR反应体系的组成为：2μL的10×PCR Buffer、2μL浓度为25mM的MgCl2、2μL浓度为2.5mM的dNTP混合物、浓度为20μM的CPSMVf和CPSMVr各0.5μL、0.2μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和2μL所述反转录产物，以ddH2O补足体系至20μL；所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
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|---|---|---|---|---|
| CN102140555A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-08-03 | 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用rt-pcr检测用简并引物、检测方法及其应用 |
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2009
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| CN102140555B (zh) * | 2011-04-07 | 2014-09-03 | 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用rt-pcr检测用简并引物、检测方法及其应用 |
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Granted publication date: 20120718 Termination date: 20121230 |