CN101812121A - 一种基于sds缓冲液高效土壤残留bt蛋白提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明为提取各种不同类型土壤中的残留BT蛋白提取方法，属于环境监测与环境保护范畴。SDS提取缓冲液的配方：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g、SDS 2g、甘油50ml，溶于800ml灭菌的去离子水中，调节pH值至7.4，定容至1L。以此缓冲液为基础结合BT残留蛋白提取技术能够高效提取不同类型土壤中的残留BT蛋白，这种提取方法具较高的提取效率、易操作性及较低的成本，为土壤BT蛋白残留检测和监测提供了高效、易操作性及较低成本的技术方法。图为SDS缓冲液提取法和其他三种提取法对不同类型土壤残留BT蛋白提取比较结果。

Description

一种基于SDS缓冲液高效土壤残留BT蛋白提取方法

(一)技术领域

本发明涉及针对不同类型土壤中残留BT蛋白的提取方法，属于生物技术领域。适用于环境监测、环境保护、农业生产等部门使用。

(二)背景技术

Bt(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性、需氧型芽孢杆菌，在其芽孢形成过程中，能产生一种以上的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，简称ICPs)。BT杀虫蛋白可分为α外毒素，β-外毒素、δ-内毒素和虱因子，其中用于转基因植物的主要是β-外毒素、δ-内毒素。这两种毒素被敏感昆虫幼虫取食后，在其消化道内消化酶的作用下，蛋白被水解释放出约M_r60×10³～70×10³的活性毒蛋白分子(toxin)。毒蛋白与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔。消化道细胞内的离子浓度和渗透压平衡遭到破坏，使上皮细胞裂解，最终导致昆虫死亡(崔洪志等，2001)。随着转基因技术的发展，Bt基因陆续被导入到棉花、玉米、水稻中。转Bt作物的面世与推广种植，给作物害虫防治带来了一条新的途径(Wu等，2003；Wan等，2004；李浩宾等，2006)。

自上世纪90年代以来，转Bt棉花在我国进行商业化种植已达10余年。据2006年统计，转Bt棉花种植面积已占我国棉花种植总面积的70％以上(吴孔明，2007)。随着转Bt作物种植面积的不断扩大，其对生态环境的潜在风险也日益成为国内外专家和学者研究的热点。转Bt作物在种植以后，在其整个生长期内，会通过根系分泌物、花粉、植物残茬向土壤释放Bt毒素(Sexena等，1999)，这些分泌的Bt毒素会和土壤中的粘土矿物和腐殖质等表面活性颗粒吸附，且该结合态毒素仍具有较强的杀虫活性，在土壤环境中可长时间存留(Sexena等，2004)。土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤中的动物和微生物种群对于土壤生态系统的物质降解和能量转换起着非常重要的作用。这些残留的毒索可能会对土壤中无脊椎动物、微生物种群产生潜在的毒性，影响土壤动物及微生物种群的多样性结构，从而破坏土壤的物质循环和能量转换(李云河等，2006)。因此，研究转Bt基因植物毒蛋白在土壤中的残留和降解动态对于保护生态环境安全、保障人类健康具有十分重要的意义。

目前，对于土壤中残留BT蛋白的检测方法，主要有生物测定法和Dot-ELISA试剂盒检测法。生物测定法以目标害虫取食转Bt作物组织后的死亡率、化蛹率、羽化率、体重变化等作为指标，是确认土壤中残留的Bt毒蛋自杀虫活性的一种直接、有效、简便易行的手段，只需将含有Bt毒蛋白的抽提液直接加入到敏感昆虫的人工饲料中即可，且灵敏度高，可检测到亚致死剂量的Bt毒蛋白。但生物测试法需要统一虫源、虫龄和饲养条件，且占用的空间大，检测所需的时间长，环境因素干扰大，因此难以对大量的样品进行检测(Sims等，1996；Zwahleh等，1994；Tapp等，1997)。ELISA检测法通过提取缓冲液提取土壤中的BT蛋白，然后采用ELISA检测方法对提取的蛋白进行定性或定量。ELISA检测法操作相对生物测定法较为简单，检测所需时间短，因此成为目前检测土壤中残留BT蛋白最常用的一种方法(沈法富等，1999)。由上述两种方法可以看出，在对土壤中BT蛋白检测的过程中，最为关键的就是能否高效地从土壤中提取BT蛋白。目前提取土壤中残留BT蛋白的方法主要有碳酸盐法(徐海根等，2008)、人造蠕虫肠道蛋白提取液法(Shan等，2005)、PBST法。碳酸盐法和人造蠕虫肠道蛋白提取液法分别是在蛋白的提取缓冲液添加碳酸盐和人造蠕虫肠道蛋白提取液，以提高缓冲液对土壤蛋白的提取效率。碳酸盐提取法提取效率偏低，对于BT蛋白含量较低的土壤中，无法提取出BT蛋白，易造成假阴性结果。人造蠕虫肠道蛋白提取液由于添加液成本较高，无法满足大量样品检测的需要。PBST法是采用美国Envirologix公司生产的CrylAb/CrylAc检测试剂盒自带的提取缓冲液提取方法，该试剂盒由于价格昂贵，且提取效率不高，在一定程度上限制了其使用范围。

因此，开发出一种高效、低成本、操作较为简单的土壤BT蛋白提取方法显得尤为重要。通过该技术，提高土壤中BT蛋白的提取效率，降低检测成本，避免由于提取蛋白效率过低造成的假阴性结果，从而对土壤中BT蛋白的残留降解动态进行更加准确地监测。

本发明设计了一种新的土壤BT蛋白提取缓冲液，并在此基础上建立了SDS法提取土壤中残留BT蛋白提取方法。

(三)发明内容

技术问题

本发明的目的是解决现有技术中土壤残留BT提取效率过低、检测结果易出现假阴性等问题，提供用于提取土壤残留BT蛋白的缓冲液以及土壤残留BT蛋白提取方法，对不同类型土壤中残留BT蛋白进行提取，效率高、成本低、操作简便。

技术方案

本发明的目的意在克服现有土壤BT残留蛋白提取技术的不足，提供一种新的高效提取土壤BT毒蛋白方法，该方法可以简单方便地从各种类型土壤中提取BT毒蛋白并用于各种后续检测。

实现上述目的的技术方案：

1.用于提取土壤中残留BT蛋白的缓冲液配方：

NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO4 1.44g、KH₂PO4 0.24g、SDS 2g、甘油50ml，溶于800ml灭菌的去离子水中，调节pH值至7.4，定容至1L。

2.用于提取土壤中残留BT蛋白的提取方法：

土壤中残留BT蛋白的提取方法，包括如下步骤：

(1)SDS蛋白提取缓冲液的配制：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO40.24g、SDS 2g、甘油50ml、溶于800ml水中，调节pH值至7.4，加去灭菌后的离子水定容至1L；

(2)取100g土壤样品，采用300目网筛过筛去除植物残体根系等杂质，称取5g过筛后的土壤样品置于研钵中，充分研磨3～5分钟，称取0.5g充分研磨后的土壤样品；

(3)将0.5g充分研磨后的土壤样品置于2ml离心管中，加入1.5ml SDS蛋白提取缓冲液，置于涡旋混合仪上震荡1分钟，使其充分混合均匀将上述土壤悬浮液置于可控温摇床中，50℃下200rpm震荡14～16小时；

(4)将震荡后的离心管取出，迅速置于离心机中，6000rpm离心1分钟；

(5)离心结束后，用微量移液器小心吸取离心管中的上清液，转入新的离心管中，该上清液即为含有BT毒蛋白的溶液，该溶液可直接用于BT蛋白Elisa试剂盒检测及其他各种后续检测。

有益效果采用上述技术方案，突出的技术进步在于：

1.提取效率高：与现有的土壤BT蛋白提取方法(碳酸盐缓冲液提取法，人造蠕虫肠道液提取法，Envirologix试剂盒自带提取缓冲液提取法)相比，效率分别大约提高了3倍、8倍和10倍；且提取产物可直接用于ELISA，western blot，SDS-PAGE凝胶电泳，BCA总蛋白浓度检测等后续试验。

2.实用性好：通过对不同类型含BT残留蛋白的土壤样品进行效果验证后，结果显示，对于不同类型土壤样品，本方法提取效率均高于碳酸盐缓冲液提取法，人造蠕虫肠道液提取法(AGF法)，Envirologix试剂盒自带提取缓冲液提取法(PBST法)；

3.成本低：本方法中使用试剂均为实验室中常规实验试剂，成本较低；

4.操作简便：本方法仅需5步便可从不同类型土壤中高效提取BT蛋白，无需进行专业的培训。

采用SDS缓冲液提取法作为土壤BT残留蛋白提取方法，弥补了现有土壤BT残留蛋白提取方法提取效率过低、成本高、检测结果易出现假阴性等问题，为土壤中BT蛋白残留动态监测提供了一种高效、低成本、易操作的技术途径。

(四)说明书附图

表1.采用SDS缓冲液提取法对不同土壤类型省份土壤残留BT蛋白提取结果。

表2.采用SDS缓冲液提取法和其他三种提取法对不同土壤类型省份土壤残留BT蛋白提取结果。

图1.采用SDS缓冲液提取法和其他三种提取法对不同土壤类型省份土壤残留BT蛋白提取比较结果。

结果表明，采用SDS缓冲液提取法可以成功地从各种不同类型的土壤中提取BT残留蛋白，提取效率显著高于其他三种提取方法。

(五)具体实施方式

实施例1：一种高效提取土壤中残留BT蛋白的方法，用于提取不同类型土壤中的BT残留蛋白。

用于提取各种不同类型土壤中残留BT蛋白的SDS提取缓冲液：

NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g、SDS 2g、甘油50ml，溶于800ml灭菌的去离子水中，调节pH值至7.4，定容至1L。

提取的主要步骤包括：

(1)取100g土壤样品，采用300目网筛过筛去除植物残体根系等杂质，称取5g过筛后的土壤样品置于研钵中，充分研磨3～5分钟；称取0.5g充分研磨后的土壤样品；

(2)将0.5g充分研磨后的土壤样品置于2ml离心管中，加入1.5ml SDS蛋白提取缓冲液，置于涡旋混合仪上震荡1分钟，使其充分混合均匀；

(3)将上述土壤悬浮液置于可控温摇床中，50℃下200rpm震荡14～16小时；

(4)将震荡后的离心管取出，迅速置于离心机中，6000rpm离心1分钟；

(5)离心结束后，用微量移液器小心吸取离心管中的上清液，转入新的离心管中，该上清液即为含有BT毒蛋白的溶液。

(6)采用酶标仪对含有BT毒蛋白的溶液进行定量。

实例1从河南、江西、新疆、陕西种植转Bt棉花田块土壤样品中提取BT残留蛋白：

上述SDS提取缓冲液和提取方法用于提取河南、江西、新疆、陕西种植转Bt棉花田块土壤样品中的残留蛋白，方法包括：

1)将上述四个省、自治区的转Bt棉花田块土壤样品作为提取对象。

2)参照上述技术方案利用SDS提取缓冲液法对上述样品进行BT残留蛋白的提取。提取结果见表1。结果表明采用SDS缓冲液提取法均能上述四个省、自治区的土壤样品中提取BT蛋白。证明了上述技术方案能够应用于不同类型土壤样品BT残留蛋白的实际提取。

Claims (2)

1.提取土壤蛋白的SDS缓冲液配方：

NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g、SDS 2g、甘油50ml，溶于800ml灭菌的去离子水中，调节pH值至7.4，定容至1L。

2.权利要求提取土壤BT残留蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)取100g土壤样品，采用300目网筛过筛去除植物残体根系等杂质，称取5g过筛后的土壤样品置于研钵中，充分研磨3～5分钟，称取0.5g充分研磨后的土壤样品；

(2)将0.5g充分研磨后的土壤样品置于2ml离心管中，加入1.5ml SDS蛋白提取缓冲液，置于涡旋混合仪上震荡1分钟，使其充分混合均匀将上述土壤悬浮液置于可控温摇床中，50℃下200rpm震荡14～16小时；

(3)将上述土壤悬浮液置于可控温摇床中，50℃下200rpm震荡14～16小时；

(4)将震荡后的离心管取出，迅速置于离心机中，6000rpm离心1分钟；

(5)离心结束后，用微量移液器小心吸取离心管中的上清液，转入新的离心管中，该上清液即为含有BT毒蛋白的溶液。

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