CN101805698A - 基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂的制备方法，所述多种益生菌包括啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆、沼泽红假单胞菌和菌粪肠球菌，所述制备方法包括培养基的制备和发酵工艺：一、培养基的制备：a)用于啤酒酵母菌发酵的培养基，b)用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基，c)用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基。二、发酵工艺：a)啤酒酵母发酵，b)嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的发酵，c)枯草芽孢杆菌的发酵。本发明的优势在于：制品中活菌数量高，成品保存期长。

Description

基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种微生物复合制剂。具体地说是涉及一种基于多种益生菌的发酵培养物的复合微生物制剂及其应用。属于微生物制剂领域。

(二)背景技术

由于农药、化肥、抗生素和激素的大量使用给生态环境和农产品品质带来了日趋严重的影响。为此，需采用微生物制剂来改良生态环境。目前，已经上市的微生物制剂，大多是单一菌或简单的复合菌制剂，因而其功能都较为单一，用于种植业和养殖业时仅能针对肥料或饲料的一项或几项指标进行改良；在很多复合菌制剂的制备过程中，部分企业盲目的认为加入的菌的种类越多越好，而将互相拮抗菌放在了一起；有的由于菌种选用不当，或使用的培养基营养成分不均衡或，酸碱度、温度等关键性参数设定存在偏差，造成活菌含量低，杂菌多，水分含量偏高等问题，影响了产品的质量及其使用效果。

(三)发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种功能多、制品中活菌数量高，成品保存期长的基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：一种基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂的制备方法，所述多种益生菌包括啤酒酵母菌(好氧菌)、枯草芽孢杆菌(厌氧菌)、嗜酸乳杆菌(兼性厌氧菌)、沼泽红假单胞菌(兼性厌氧菌)和菌粪肠球菌(兼性厌氧菌)，所述制备方法包括培养基的制备和发酵工艺：

一、培养基的制备

a)用于啤酒酵母菌(好氧菌)发酵的培养基

用于啤酒酵母发酵菌的培养基，包含以下重量配比的原料：蜂蜜50-200份、红糖300-900份、磷酸二氢钾1-5份、磷酸氢二钾1-5份、硫酸亚铁80-160份、硫酸锰5-20份、硫酸铜3-10份、硫酸锌8-20份、硼酸8-40份、钼酸铵0.5-1份和水5000-8000份；

b)用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌(兼性厌氧菌)发酵的培养基

用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基包含以下重量配比的原料：蜂蜜50-200份、红糖300-900份、磷酸二氢钾1-5份、磷酸氢二钾1-5份、硫酸亚铁80-160份、硫酸锰5-20份、硫酸铜3-10份、硫酸锌8-20份、硼酸8-40份、钼酸铵0.5-1份和水5000-8000份；

c)用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基

用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基包含以下重量配比的原料：腐植酸钠3-8份，红糖50-90份，蜂蜜10-30份和水3000-5000份。

二、发酵工艺

a)啤酒酵母(好氧菌)发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌30-40分钟后待温度降至30-35℃时，加入啤酒酵母菌种，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在30-40℃，发酵36-48小时，得啤酒酵母菌培养物，所述啤酒酵母菌种的加入量占其培养基总量的重量百分比为0.1％-0.5％；

b)嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌(兼性厌氧菌)的发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌30-40分钟后待温度降至30-35℃时，加入嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在25-35℃，发酵36-48小时，得嗜酸乳杆菌培养物、沼泽红假单胞菌培养物和粪肠球菌培养物，所述嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的加入量占其培养基总量的重量百分比分别为0.05％-0.4％、0.01％-0.2％和0.1％-0.5％；

c)枯草芽孢杆菌(厌氧菌)的发酵

按所述配方将腐植酸钠、红糖、蜂蜜和水置入发酵罐中，加入碳酸氢钠调节pH为7-7.5，加热至温度为85-95℃灭菌30-40分钟，后待温度降至30-35℃时，加入所述发酵工艺a)和b)的培养物的混合物，再加入枯草芽孢杆菌菌种，搅拌后温度控制在30-40℃，将发酵罐中大气压抽负压至0.1-0.3个大气压，发酵72-96小时得到成品。其中所述枯草芽孢杆菌的加入量占所述用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基总量的重量百分比分别为0.01％-0.05％。

所述粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和啤酒酵母五种益生菌发酵的菌种的重量配比为：1∶0.8-2.5∶0.8-1.2∶0.8-3.5∶1.5-3.0。

本发明基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂作用机理：

(1)嗜酸乳杆菌

嗜酸乳杆菌能摄取光合细菌生产的物质，分解在常温下不易分解的木质素和纤维素，使未腐熟的有机物发酵，转化成动植物有效的养分。嗜酸乳杆菌是能够分解糖类产生乳酸为主要代谢产物的无芽孢革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧生长，在pH 3.0～4.5酸性条件下仍能生存。通过生物拮抗(竞争排斥，降低pH，提高挥发性脂肪酸浓度，阻止和抑制致病菌的侵入和定植，维持正常生态平衡，被称为“后抗生素”。嗜酸乳杆菌能够分解常温下不易分解的木质素和纤维素，合成各种氨基酸和维生素，产生消化酶类，帮助食物消化和营养吸收，促进新陈代谢。

(2)沼泽红假单胞菌

沼泽红假单胞菌能利用太阳热能或紫外线将土壤中的硫氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害为无害；并和c、氮等合成糖类、氨基酸类、维生素类、生物活性物质(激素)等，培肥土壤。在厌气性条件下，沼泽红假单胞菌能够利用小分子有机物来合成自身生长繁殖需要的各种养料，并以动植物体内的分泌物、有机物和有害气体(氨气、沼气、硫化氢等)为基质，合成糖类、氨基酸、维生素和生物活性物质等，有效降解了有毒有害物质含量，从而使养殖业从严重的化学污染中解放出来，生产出具有更高产量和无污染的优质畜产品。

(3)啤酒酵母

啤酒酵母可以产生出促进细菌分裂的生物活性物质，同时啤酒酵母还对促进其它有效微生物增殖的基质(食物)的生产起着重要作用。它能够特征性地发酵一系列碳水化合物，所生产的单细胞蛋白是动物的有效养分。有机物经啤酒酵母发酵后，蛋白质、维生素、氨基酸生物活性大幅度提高，所产生的单细胞蛋白是动物的有效养分。啤酒酵母菌体富含蛋白质、纤维素和多种酶类，可以加强消化吸收功能，提高动物对植酸磷的利用。

(4)粪肠球菌

粪肠球菌可以优化土壤结构，改善动物肠道内微生态环境，促进其他益生菌的增殖，其发酵产物能改善动物生长发育，调节动物消化吸收功能，提高动物生长速度。

(5)枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的多种等活性物质，能明显抑制致病菌的生长，增强动植物抗病能力；枯草芽孢杆菌能迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；枯草芽孢杆菌刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；枯草芽孢杆菌菌体自身合成多种酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，从而加强消化吸收功能，促进动物加速生长发育。

上述五种微生物混合发酵可以实现共生酶系的互补，这几种微生物代谢途径不同，答谢产物各不相同，因而能起到单一菌株发酵难以起到的作用。在本发明中的混合培养中，一种微生物可以产生有利于另一种(或多种)微生物生长、发酵所需的基本物质(如碳源、氮源)和营养素(多糖等)，能加快另一种(或多种)微生物的生长繁殖。混合培养这几种微生物能产生多种酶，可以作用于多种化合物，能很好的消除合改变底物中的抑制物，提高培养基的利用率。在这些微生物的混合发酵培养过程中，可以完成多种转化，而单一种微生物的发酵是不可能完成的。

在本发明中由于采用了合理适当的配比和培养条件，这些微生物可以迅速定植并与环境相结合，产生大量易为动植物吸收的有益物质，如氨基酸、有机酸、多糖类、各种维生素、各种生化酶、促生长因子、抗氧化物质和抗病毒物质等，能够清除腐败和恶臭，提高动植物免疫功能，预防和抑制致病菌，形成有利于动植物生长的良好环境，应用于种植业和养殖业，可以降低成本、提高产量、改善品质。

本发明的有益效果是：

本发明基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂，它将多种具有不同性质和作用的微生物有机的结合为一体，具有了多种微生物和谐共生的微环境，使其具备了改良生态的能力。具体功能表现在：应用于种植业，可有效地恢复和保持土壤的生态平衡，预防和长期控制果树植物的病虫害，促进植物生长，提高果蔬植物品质；应用于养殖业，可增强动物机体免疫力，提高饲料转化率，促进动物生长发育等。

本发明的优势在于：

制品中活菌数量高，成品保存期长。本产品应用于种植业能促进光合作用、改良土壤、减少病虫害、促进植物健康快速生长；应用于养殖业能提高饲料转化率，促进动物生长发育，提高禽畜抗病能力。

用于本发明的益生菌(粪肠球菌AS 1.0130、枯草芽孢杆菌AS 1.0884、嗜酸乳杆菌AS 1.1854、沼泽红假单胞菌AS 1.2180和啤酒酵母AS 2.0121)均可由中国科学院微生物研究所购得，并在常规培养基中进行常规预培养。

本发明通过优化培养基的配方和制备方法，将嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、沼泽红假单胞菌和啤酒酵母分别接种培养基进行发酵，再混合后接种啤酒酵母进行厌氧发酵，使各菌种得到平衡增殖。

(四)具体实施方式

实施例1：

一、培养基的制备

a)用于啤酒酵母发酵的培养基

用于啤酒酵母发酵的培养基，包含以下重量配比的原料：蜂蜜10kg、红糖40kg、磷酸二氢钾200g、磷酸氢二钾200g、硫酸亚铁8kg、硫酸锰900g、硫酸铜300g、硫酸锌800g、硼酸1.5kg、钼酸铵50g和水500kg；

b)用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基包含以下重量配比的原料：蜂蜜10kg、红糖40kg、磷酸二氢钾200g、磷酸氢二钾200g、硫酸亚铁8kg、硫酸锰900g、硫酸铜300g、硫酸锌800g、硼酸1.5kg、钼酸铵50g和水500kg；

c)用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基

用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基包含以下重量配比的原料：腐植酸钠3kg，红糖50kg，蜂蜜20kg和4000kg水。

二、发酵工艺

a)啤酒酵母发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌30-40分钟后待温度降至30-35℃时，加入啤酒酵母菌种，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在35℃，发酵42小时，得啤酒酵母菌培养物，所述啤酒酵母菌种的加入量占其培养基总量的重量百分比为0.1％；

b)嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌30-40分钟后待温度降至30-35℃时，加入嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在28℃，发酵36小时，得嗜酸乳杆菌培养物、沼泽红假单胞菌培养物和粪肠球菌培养物，所述嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的加入量占其培养基总量的重量百分比分别为0.08％、0.01％和0.2％；

c)枯草芽孢杆菌的发酵

按所述配方将腐植酸钠、红糖、蜂蜜和水置入发酵罐中，加入碳酸氢钠调节pH为7-7.5，加热至温度为85-95℃灭菌半小时，后待温度降至30-35℃时，加入所述发酵工艺a)和b)的培养物的混合物，再加入枯草芽孢杆菌菌种，搅拌后温度控制在35℃，将发酵罐中大气压抽负压至0.2个大气压，减压发酵72小时得到成品。其中所述枯草芽孢杆菌的加入量占所述用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基总量的重量百分比为0.01％。

实施例2：

一、培养基的制备

a)用于好氧菌(啤酒酵母)发酵的培养基

用于啤酒酵母发酵的培养基，包含以下重量配比的原料：蜂蜜10kg、红糖40kg、磷酸二氢钾125g、磷酸氢二钾125g、硫酸亚铁8kg、硫酸锰800g、硫酸铜450g、硫酸锌900g、硼酸1kg、钼酸铵50g和水500kg；

b)用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基

用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基包含以下重量配比的原料：用于啤酒酵母发酵的培养基，包含以下重量配比的原料：蜂蜜10kg、红糖40kg、磷酸二氢钾125g、磷酸氢二钾125g、硫酸亚铁8kg、硫酸锰800g、硫酸铜450g、硫酸锌900g、硼酸1kg、钼酸铵50g和水500kg；c)用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基

用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基包含以下重量配比的原料：腐植酸钠3kg，红糖45kg，蜂蜜15kg和3000kg水。

二、发酵工艺

a)啤酒酵母发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌后待温度降至30-35℃时，加入啤酒酵母菌种，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在35℃，发酵36小时，得啤酒酵母菌培养物，所述啤酒酵母菌种的加入量占其培养基总量的重量百分比为0.3％；

b)嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌后待温度降至30-35℃时，加入嗜酸乳杆菌菌种、沼泽红假单胞菌菌种和粪肠球菌菌种，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在25℃，发酵42小时，得嗜酸乳杆菌培养物、沼泽红假单胞菌培养物和粪肠球菌培养物，所述嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的加入量占其培养基总量的重量百分比分别为0.2％、0.01％和0.15％。

c)枯草芽孢杆菌的发酵

按所述配方将腐植酸钠、红糖、蜂蜜和水置入发酵罐中，加入碳酸氢钠调节pH为7-7.5，加热至温度为85-95℃灭菌半小时，后待温度降至30-35℃时，加入所述发酵工艺a)和b)的培养物的混合物，再加入枯草芽孢杆菌菌种，搅拌后温度控制在35℃，将发酵罐中大气压抽负压至0.15个大气压减压发酵84小时得到成品。其中所述枯草芽孢杆菌菌种的加入量占所述用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基总量的重量百分比0.03％.

试验实施例

实例1：益生菌微生物复合制剂在番茄上应用效果试验

1、材料与方法

1.1供试材料：益生菌微生物复合制剂；番茄品种：粉瑞达.

1.2使用方法：益生菌微生物复合制剂300倍清水稀释备用。

1.3试验方法：试验采取区组设计，即番茄设每67m²施三元素复合肥20kg分别加益生菌微生物复合制剂0.1(代号a)、0.2(代号b)、0.3(代号c)、0.4(代号d)、0.5(代号e)kg，与单施三元素复合肥作对照(ck)，共设6个处理，每处理3次重复。番茄4月1日播种，小拱棚育苗，5月20日移栽，株距50cm，行距52cm，单株定植，地膜覆盖栽培。基肥施用，在蔬菜定植前20天大田开沟起垄，先沟施三元素复合肥，再冲施益生菌微生物复合制剂(稀释比为1∶300)，然后复土起垄覆盖地膜。

2、结果与分析：

2.1番茄施用益生菌微生物复合制剂对产量的影响：

结果表明，番茄小区产量以处理e最高，达564kg，不施用腐植液肥的田块处理ck，番茄产量最低，只有457kg，在三元素复合肥施用量相同的情况下，番茄施用益生菌微生物复合制剂随施用量增加产量有递增趋势；

2.2番茄施用益生菌微生物复合制剂对蔬菜抗病性的影响

番茄施用益生菌微生物复合制剂后，从搭架绑蔓开始，表现叶色深绿，无病毒病和早疫病，在番茄结果期没发现裂果、畸型果，并抗衰老，采收时间加长，果色光亮，经过营销商到试验田观察，认为市场将很受欢迎，而单施三元素复合肥的植株，在定植后25天出现轻度病毒病，定植52天后出现较严重的早疫病，少量植株在结果期畸型果多，果表皮光泽度不如其它处理。

2.3讨论

试验结果表明，番茄施用益生菌微生物复合制剂能够促进作物生长，增强坑病性，降低植保成本，提高产量和品质，增加经济收入。从长远来看，能改善土壤，增加肥力，是一种很有前途的农用微生物复合制剂。

实例2：益生菌微生物复合制剂在应用于生猪饲养的效果试验

1、试验材料与方法：

1.1在基础饲料中添加300倍稀释的益生菌微生物复合制剂，进行再次发酵；

1.2选不同性别、平均体重在16±0.5公斤的仔猪60头(分为A、B、C、D、E六组，每组12头)，试验周期为70天。各组基础日粮相同，其中A、B、C、D组日粮分别添加5％、10％、15％和20％的益生菌微生物复合制剂发酵饲料并以300倍稀释的益生菌微生物复合制剂作为饮水饲喂，E组为对照组，饲喂基础日粮。试验期防疫和饲料管理按猪场正常进行。

2、试验结果

随日粮中益生菌微生物复合制剂发酵饲料的增加，猪日增重呈增加趋势，添加量在15％以上各组日增重平均较对照组高。各组每公斤增重的饲料消耗均较对照组低，且随发酵饲料增加，每公斤增重的耗料量下降；各组每公斤增重的饲料成本均较对照组低，也随发酵饲料喂量的增加而降低。凡使用益生菌微生物复合制剂发酵饲料饲喂的，增重速度均明显提高，平均每日每头增重提高13.1-29.5％，说明在其他条件相同情况下，使用益生菌微生物复合制剂可以提高猪的生长速度，提前出栏，减少成本，单位时间的经济效益明显提高。

从观察到的情况看，使用益生菌微生物复合制剂饲养的7-10天以后，猪的毛色逐渐光亮，并变得温顺，圈内臭味明显减轻，苍蝇也减少。试验组猪没有任何不正常反应，没有患病，而对照组有时有轻微拉稀和上呼吸道感染。

Claims (1)

1.一种基于多种益生菌发酵培养物的微生物复合制剂的制备方法，其特征在于所述多种益生菌包括啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆、沼泽红假单胞菌和菌粪肠球菌，所述制备方法包括培养基的制备和发酵工艺：

一、培养基的制备

a)用于啤酒酵母菌发酵的培养基

用于啤酒酵母发酵菌的培养基，包含以下重量配比的原料：蜂蜜50-200份、红糖300-900份、磷酸二氢钾1-5份、磷酸氢二钾1-5份、硫酸亚铁80-160份、硫酸锰5-20份、硫酸铜3-10份、硫酸锌8-20份、硼酸8-40份、钼酸铵0.5-1份和水5000-8000份；

b)用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基

用于嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵的培养基包含以下重量配比的原料：蜂蜜50-200份、红糖300-900份、磷酸二氢钾1-5份、磷酸氢二钾1-5份、硫酸亚铁80-160份、硫酸锰5-20份、硫酸铜3-10份、硫酸锌8-20份、硼酸8-40份、钼酸铵0.5-1份和水5000-8000份；

c)用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基

用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基包含以下重量配比的原料：腐植酸钠3-8份，红糖50-90份，蜂蜜10-30份和水3000-5000份，

二、发酵工艺

a)啤酒酵母发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌30-40分钟后待温度降至30-35℃时，加入啤酒酵母菌种，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在30-40℃，发酵36-48小时，得啤酒酵母菌培养物，所述啤酒酵母菌种的加入量占其培养基总量的重量百分比为0.1％-0.5％；

b)嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的发酵

按所述配方将蜂蜜、红糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硼酸、钼酸铵和水置入发酵罐中，85℃-95℃灭菌30-40分钟后待温度降至30-35℃时，加入嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌，充分搅拌40-60分钟，将温度控制在25-35℃，发酵36-48小时，得嗜酸乳杆菌培养物、沼泽红假单胞菌培养物和粪肠球菌培养物，所述嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌的加入量占其培养基总量的重量百分比分别为0.05％-0.4％、0.01％-0.2％和0.1％-0.5％；

c)枯草芽孢杆菌的发酵

按所述配方将腐植酸钠、红糖、蜂蜜和水置入发酵罐中，加入碳酸氢钠调节pH为7-7.5，加热至温度为85-95℃灭菌30-40分钟，后待温度降至30-35℃时，加入所述发酵工艺a)和b)的培养物的混合物，再加入枯草芽孢杆菌菌种，搅拌后温度控制在30-40℃，将发酵罐中大气压抽负压至0.1-0.3个大气压，发酵72-96小时得到成品，其中所述枯草芽孢杆菌的加入量占所述用于啤酒酵母、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和粪肠球菌发酵后混合，再加入枯草芽孢杆菌菌种混合均匀后，再次发酵的培养基总量的重量百分比分别为0.01％-0.05％，

所述粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、沼泽红假单胞菌和啤酒酵母五种益生菌发酵的菌种的重量配比为：1∶0.8-2.5∶0.8-1.2∶0.8-3.5∶1.5-3.0。