CN101797390A - 基因rab13的拮抗剂的应用及包含该拮抗剂的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因rabl3(SEQ ID NO.：1)的拮抗剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物中的应用。本发明也涉及包含该拮抗剂的用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物。

Description

基因rab13的拮抗剂的应用及包含该拮抗剂的药物

技术领域

本发明涉及基因rabl3(SEQ ID NO.：1)的拮抗剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物中到应用。本发明也涉及包含该拮抗剂的用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物。

背景技术

现在已知ras、rab亚家族的许多成员在肿瘤的发生和发展中起了一个促进作用，是潜在的癌基因。如rab2与白血病的发病有关，在白血病中高表达；rab7、8与黑色素瘤有关，在黑色素瘤中高表达；rab11在食管癌细胞的囊泡运输中不正常而可能导致了食管癌的发生；rab25在上皮来源的乳腺癌和卵巢癌的发生发展及侵袭性方面都起了重要作用，特别在乳腺癌和卵巢癌III、IV表达异常增高，它明显促进了肿瘤细胞的增殖，抑制了凋亡和失巢凋亡。

肿瘤的发生是一个多阶段、多步骤的过程，这一过程中伴随着机体许多的细胞学、遗传学的改变，出现多种基因表达异常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因灭活，激发异常的信号传导通路，导致细胞周期及细胞凋亡异常，从而使得细胞恶性转化，并随着各种分子异常的累积，肿瘤出现进展、转移。因此，了解这些在肿瘤发生过程中、在肿瘤组织中起了重要作用的基因，对于肿瘤发生发展机制的阐明、寻找新的肿瘤治疗靶标具有重要意义。

由于rab家族的一些成员是潜在的癌基因，已有的实验结果表明在体内和体外采用基因沉默或敲除的方法。均可以抑制肿瘤细胞的增殖和生长，因而就提出了一种新式治疗靶标，我们可以把这些潜在的癌基因作为肿瘤治疗的新靶标。Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)中公开了一种基因rabl3(Gene ID：285282)(SEQ ID NO.：1)及其所编码的蛋白质(GI：627514717)(SEQ ID NO.：2)。但是迄今为止，并没有文献报道该基因在治疗肿瘤方面的功能。

发明内容

本发明的目的是提供基因rabl3(SEQ IDNO.：1)的拮抗剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供包含该拮抗剂的用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物。

为了达到该目的，本发明提供了如下的技术方案：本发明的基因rabl3(SEQ IDNO.：1)可以作为肿瘤治疗的靶标，也就是说基因rabl3的拮抗剂可以用于制备用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物。同时，本发明也提供了一种用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物，其包含基因rabl3的拮抗剂。

本发明人通过实验发现在肿瘤细胞中，抑制和敲除rabl3基因的表达，可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞发生凋亡，增加肿瘤细胞对抗癌药的敏感性；反之，在肿瘤细胞中转染基因rabl3则可以促进肿瘤细胞的增殖和存活，出现对抗癌药抵抗。

并且通过本发明后面的实施例及本领域的公知常识可以知道，针对基因rabl3的任何拮抗剂都可以用于本发明的目的。例如，所述拮抗剂可以是抑制mRNA翻译的反义RNA。本领域技术人员已知反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译。另外，最近几年已经成熟的siRNA也可以作为本发明所述的拮抗剂，所述siRNA是由双链RNA来降解mRNA，从而抑制mRNA转录后的翻译，使得相应基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTCG)的一项技术。2001年Elbashir等《Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。对于哺乳动物细胞来说，外源倒入的ds RNA长度超过30bp时，会引起非特异性的mRNA降解。

可以根据本发明的核酸序列设计一段ds DNA序列合成小双链干扰的RNA或将ds DNA序列连接到载体中，构建干扰RNA的载体，载体进入细胞，利用体内的环境转录获得拮抗剂siRNA序列，使得Rabl3基因沉默而达到治疗肿瘤的目的。

本发明所述的siRNA分子含有第一链和第二链，第一链包含对应于基因rabl3核苷酸序列的核糖核苷酸序列，第二链包含与基因rabl3核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列。

可用携带本发明基因rabl3的克隆载体或表达载体转导、转化或转染适当的宿主细胞。所用的载体例如可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体形式的。可在为活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因rabl3而适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。

可按重组DNA技术使用本发明的基因rabl3生产本发明具有免疫调节活性和造血细胞刺激活性的多肽。为此，可将所说的基因rabl3插入到各种用于表达该多肽的适当表达载体中。这样的载体包括染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、噬菌体(由质粒和噬菌体DNA组合体衍生的载体)、以及病毒(如杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。

可用各种已知的方法将适当的DNA序列插入到载体的适当限制性核酸内切酶位点中。插入到表达载体中的DNA序列被可操作地连接到适当的表达控制序列即启动子，以指导mRNA合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。

此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，并含有一个或多个选择标志基因，以提供被转化的宿主细胞的可选择表型特征，如适用于真核细胞的新霉素抗性或二氢叶酸还原酶基因，或适用于大肠杆菌中的氨苄青霉素或四环素抗性基因。

可用含有上文所述适当DNA序列，以及适当启动子或其他转录与翻译控制序列的载体转化适当的宿主细胞，以使宿主表达所需的蛋白质。

可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的基因rabl3，可提到的适当宿主的例子有：细菌细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；哺乳动物细胞如CHO、COS细胞；以及人细胞如HEK293细胞、U937细胞和Hela细胞。

具体地说，本发明涉及包括上述一个或多个基因rabl3的重组构建体，该构建体包括在其中以正向或反向插入了本发明的基因rabl3的载体，如质粒或病毒载体，并且在所说的基因rabl3的上游可操作地连接了适当的调节序列如启动子序列和增强子序列。

适用的载体的例子包括用于原核细胞的pMTY/4(马大龙，高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；以及适用于真核细胞的pcDNA3.1、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。适用的启动子包括lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及CMV、SV40等真核细胞启动子。

在一个实施方案中，本发明进一步涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞或人肿瘤细胞，或者是低等真核细胞如酵母细胞，或者是原核细胞如大肠杆菌细胞。可用本领域已知的方法如氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击所说的构建体导入宿主细胞内。

可按常规方法使用包含在宿主细胞中的构建体产生由基因rabl3编码的多肽产物(SEQ ID NO.：2)。或者，也可使用常规的肽合成仪化学合成本发明的多肽(SEQID NO.：2)。或者，也可使用衍生于本发明的基因rabl3构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白质(SEQ ID NO.：2)。

必要时，为了提高编码本发明多肽的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中插入增强子序列。增强子一般是约含10-300个碱基对并作用于启动子以增强DNA转录的顺式作用元件。另外，必要时也可在启动子和下游结构序列之间插入一个能指导翻译产物向周质或细胞外培养基中分泌的前导序列(分泌信号)。或者，可根据需要导入编码融合蛋白质的异源DNA序列，所说的融合蛋白可包括一个赋予所需特征，如用于稳定被表达之产物的或简化其纯化步骤的N末端识别肽。

可适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，以及已知克隆载体pBR322(ATCC37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。

在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养之。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。

也可用各种哺乳动物细胞表达本发明的重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括人细胞系，如Hela、293和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可含有复制原点、转录终止序列，及5’侧翼非编码序列。可使用衍生于SV40的剪切和聚腺苷酸化位点的DNA序列来提供必要的遗传元件。

可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的Rabl3多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

本发明的多肽可以是天然产生、化学合成、或用DNA重组技术由原核或真核细胞产生的。优选重组产生的多肽。

本发明的基因rabl3的拮抗剂可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂相混合以制备药物。可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物制成多种剂型，例如溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。载体或赋形剂的例子包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。可根据需要在组合物中添加辅助成：例如与本发明Rabl3的拮抗剂有协同作用的化合物；又如人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或赖氨酸)和金属阳离子(如Zn²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺和Ca²⁺)等蛋白保护剂；聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽等稳定剂；蛋白酶抑制剂及自由基清除剂；以及在粘膜或皮肤局部给药的情况下，添加二甲基亚砜或月桂氮卓酮等皮肤渗透剂。

可通过常规途径，特别是胃肠道外途径使用本发明给药。本发明药物的有效剂量范围可从几微克到几毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量应根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状况给药方式等因素由临床医生来确定。

上述这些方法以及用于这些方法的反转录病毒、包含在载体内的适当的启动子、包括启动子和处于适当启动子控制下的多核苷酸编码序列的载体、用于转染包装细胞系以形成生产细胞系的逆转录病毒质粒载体，以及适当的可被转染的包装细胞都是基因治疗领域中已知的。

可借助各种已知的方法用携带本发明多肽的核酸编码序列的载体体外或体内转染包装细胞或靶细胞。这些方法包括但不只限于电穿孔、微粒轰击(例如使用Biolistic装置)、脂质体转染法，以及磷酸钙沉淀法或这些方法的联合使用。另外，也可以将反转录病毒载体包裹在脂质体中，或者偶联到脂质体上，然后再运送到宿主体的适当靶细胞内。

总之，可由生产细胞系产生包含本发明多肽的核酸编码序列的感染性反转录病毒载体颗粒，然后使用这样的载体颗粒于体外或体内转导宿主真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码所说多肽的核酸序列。可被转的真核细胞包括但不只限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞和成人癌细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、间质细胞、上皮细胞及表皮细胞。

用本发明的Rabl3多肽及其片段、类似物或衍生物作为免疫原制备相应的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体，可以是嵌合的、单链的或人源化抗体及其Fab片段。可以用杂交瘤技术生产人单克隆抗体，可以用转基因小鼠制备人源化抗体。所述制备该单克隆及多克隆抗体技术为本领域已知的技术。

本发明涉及可以阻断或封闭Rabl3蛋白活性的拮抗剂，如前述单或多克隆抗体。拮抗剂可以与一或多种药学上可接受的载体、赋形剂或辅料结合形成药物。

本发明的有益效果是：通过在药物中应用基因rabl3的拮抗剂，可以抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药的疗效。

为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施方式对本发明进行详细的说明。需要说明的是，所述的实施例仅仅是示例本发明的目的，而不应该理解为对本发明的任何限制。

附图说明

图1是基因Rabl3在各种细胞系中的表达谱分析。

图2是CCK-8法检测瞬时转染rabl3对MDA-MB-231细胞增殖和代谢活性的影响。

图3是CCK-8法检测过表达rabl3基因对hela细胞增殖和代谢活性的影响。

图4是过表达Rabl3基因对细胞凋亡的影响。

图5是Rabl3si-RNA对基因Rabl3特异性抑制效率的检测。

图6是CCK-8法检测瞬时沉默Rabl3基因对MDA-MB-231细胞生存和代谢活性的影响。

图7是结晶紫染色法检测过表达Rabl3基因对MDA-MB-231细胞生存能力的影响。

图8是Anncxin V-PI染色法检测瞬时沉默Rabl3基因对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。

图9是Anncxin V-PI染色法检测过表达Rabl3基因使MDA-MB-231细胞对抗癌药紫杉醇的抵抗力增强。

图10是Anncxin V-PI染色法检测瞬时沉默Rabl3基因使MDA-MB-231细胞对抗癌药紫杉醇的敏感性增加。

本发明到申请文件中所用的技术如无特别说明均为本领域一般技术人员所公知的常规技术。

具体实施方式

实施例1：cDNA克隆和质粒构建

基因rabl3(SEQ ID NO.：1)的cDNA克隆：Genbank中所公开的rabl3基因染色体定位3q13.33，由8个外显子和7个内含子组成。ORF全长711bp，编码236个氨基酸。

根据Rabl3基因序列，设计Rabl3基因特异引物，上游引物P1(P1：5’-ATGGCGTCCCTGGATCGGGT-3’)，下游引物P2(P2：5`-CATCTAGATGAGCTGTGAAAAACTGCC-3`)从人细胞系Hela cDNA文库中通过PCR扩增得到Rabl3基因编码区cDNA片段。PCR扩增中采用Taq DNA聚合酶，得到含有3’突出碱基A的扩增产物，经电泳鉴定后将其回收、纯化后插入含有3’突出碱基T的线性pGEM-T Easy载体(Promega，A1360)，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，用ABI PRISM 3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/applied Biosystem)测序，获得Rabl3。当然也可以商购该基因。

通过酶切pGEM-T Easy载体，产生5‘突出端，然后在体外加入RNApol来进行体外翻译，从而产生cRNA探针，它是用地高辛标记的，然后用它来检测RABL3在Hela细胞中的表达，用的是Northern blotting方法。发现它在Hela中是有表达的，它的大小和所公开的蛋白质(SEQ ID NO.：2)大小是一致的。

实施例2：基因rabl3的真核表达载体的构建

为了检测RABL3对细胞的功能，首先构建含有RABL3cDNA的真核表达载体pcDNA3.1B-RABL3。pcDNA3.1/MycHis(-)B(Invitrogen，V85520)是设计用于重组蛋白在哺乳类动物细胞系中高表达的载体，它含有人巨细胞病毒CMV启动子，可在哺乳类动物细胞糸中实现高表达。Rabl3基因采用高表达效率的pcDNA3.1/MycHis(-)B(Invitrogen，V85520)作为真核表达载体，运用分子克隆技术，将连接在pGEM-TEasy载体中的Rabl3cDNA片断和pcDNA3.1/MycHis(-)B空载体同时用限制性内切酶EcoRI(Takara)酶切，两者连接后转化大肠杆菌DH5α，挑选转化子提取质粒，通过测序挑选正向插入的克隆，即得列含有Rabl3cDNA的真核表达载体pcDNA3.1B-Rabl3。为随后的基因功能研究打下基础。

实施例3：siRNA(小干扰RNA)合成

根据测序得到的RABL3基因的序列，设计出针对Rabl3的特异性的si-RNA，序列为：正义链：5`-CAAGAGCAGUAUUCUACAATT-3`；反义链：5`-UUGUAGAAUACUGCUCUUGTG-3`，以及不具有任何已知基因序列同源性的阴性对照si-RNA(非沉默的si-RNA)，其序列为：正义链：5`-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3`反义链：5`-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3`；该siRNA合成后经PAGE纯化，并根据合成厂家的说明，用无RNA酶水溶解，配制成使用浓度20uM，-20℃保存备用。使用时，380ul电转体系中，取10ul si-RNA进行真核细胞转染。这里需要说明的是siRNA的设计及制备属于本领域公知的技术，并不是本发明的内容。通常可以通过化学合成、体外转录或者RNAaseIII消化ds RNA等方法进行制备siRNA。当然也可以委托专业公司进行制备。

实施例4：RT-PCR

细胞系总m-RNA的提取，采用TRIZOL(Invitrogen，USA)RNA提取试剂，提取步骤按照试剂使用说明书进行。逆转录反应使用Quantscript RT Kit第一链合成试剂盒(TIANGEN，China)，合成出相应细胞系的c-DNA文库，并通过Rabl3基因特异性引物：上游引物P3：5`-TTGGGAGACTCAGGTGTTGGGAAA-3`；下游引物P4：5`-CAGTTGGCACCAAATCCCTGTTGA-3`，对该基因进行PCR扩增，进行相应细胞系的表达丰度检测，在进行检测时，使用GAPDH作为内参，以保证各实验组c-DNA含量一致。

实施例5：细胞增殖检测指标：

1.细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8，购买自Dojindo，日本)(Cck-8)实验检测细胞增殖和代谢水平

利用电穿孔的方法将连接于真核表达载体上的rabl3基因瞬时转染入MDA-MB-231细胞，并在转染后12小时按2500个/孔的细胞密度铺入％孔板，待铺入细胞状态稳定，开始进行检测。每隔12小时设为一个检测点，检测时，按每孔10ul的体积加入cck-8，反应3小时，在450nm的波长下进行吸光度测量，得到各时间点的光密度值，并以此作为反映细胞活力和增殖水平的重要指标。

2.结晶紫染色实验：

将瞬时转染rabl3的细胞以及空载体阴性对照的细胞在转染后的12小时以2500个/孔的细胞密度铺入96孔板，待细胞状态稳定后(铺入后12h)开始进行检测。每隔12小时设为一个检测点。检测时，将培养基彻底去除，并用PBS清洗三遍，以完全祛除凋亡细胞；清洗完成后，按100ul/孔的体积加入12％的甲醛固定1小时，加入结晶紫染液30ul/孔，染色35分钟，洗去浮色，将黏附于板底的已染色的活细胞进行初次比色留底(波长570nm)；比色后，每孔加入100ul脱色液，并吹打均匀，再将脱色液在570nm波长处进行比色分析，获得光密度值，并将该值作为衡量各孔活细胞数目的指标。

实施例6：通过磷脂酰丝氨酸(PS)外翻，检测凋亡细胞比例

在转染后相应的时间点胰酶消化、收集细胞，使用PBS洗涤细胞两遍，并重悬于200ul binding buffer(10mM HEPES，pH 7.4，140mM NaCl，1mM MgCl2，5mMKCl，2.5mMCaCl2))中，各实验组分别加入终浓度为0.5ug/ml的Annexin V(FITC-偶联)，混合均匀后，室温避光孵育20min，孵育后加入PI(1ug/ml)，立即进行流式细胞仪(Becton Dickinson)检测，每实验组收集10000个细胞进行统计分析。

实施例7：基因rabl3的表达谱分析

如实施例4所述，通过RT-PCR的方法，获得所选各种细胞系的c-DNA文库，并使用基因序列特异性引物(P3：5`-TTGGGAGACTCAGGTGTTGGGAAA-3`：P4：5`-CAGTTGGCACCAAATCCCTGTTGA-3`)监测Rabl3基因在各种细胞系中的表达丰度，由实验结果可得知，Rabl3基因在各种细胞系中，均有相对较为丰富的表达(见图1)。

实施例8：基因rabl3的功能研究

(1)在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(商购)中，瞬时转染基因rabl3，产生促进肿瘤细胞增殖的作用。

根据实施例5和6所述的方法，本发明利用上述构建的真核表达载体，运用电穿孔的方法，将其导入人乳腺癌细胞系MDA-MV-231中，并在转染后，通过AV-PI染色，CCK-8实验，结晶紫染色三种不同的实验指标检测细胞表型和功能的变化以及对肿瘤细胞增殖代谢能力的影响。现分别叙述如下：

i通过cck-8实验，运用掺入代谢的方法，发现瞬时转染rabl3后，可引起MDA-MB-231增殖能力增强，代谢水平升高

Cell counting kit-8(Cck-8)实验是公认的检测细胞活力和增殖程度较为敏感的指标，实验结果表明：转染rabl3基因的乳腺癌细胞较空载体阴性对照组相比，在转染后的12h，24h，36，48h，各时间点光密度值明显升高，代谢强度明显增大(见图2)。相同的实验结果也在hela细胞系(购买于ATCC)中得到了验证(见图3)。该实验从代谢和增殖的角度，证明了人rabl3基因对肿瘤细胞具有促进增殖和加强代谢的作用，这一较为明确的现象差异提示该基因在肿瘤细胞生存中的重要作用，从而可以成为一个与肿瘤细胞生存和生长密切相关的侯选癌基因，成为癌症预防或治疗方面的新靶标。

ii通过Annecin V-PI双重染色的方法，利用流式细胞仪检测凋亡细胞数，发现瞬时转染rabl3基因48h的细胞组中，Annecin V-PI单独染色以及Annecin V-PI双重染色的细胞比例较阴性对照明显升高，从而表明，rabl3基因对于肿瘤细胞具有促进增殖和维持存活的作用(见图4)，通过该实验，验证了上述试验方法所揭示的基因功能，丰富了实验指标，从而为进一步的实验研究提供了基础和保证。

(2)在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，运用si-RNA技术，抑制rabl3基因的表达，可抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞发生凋亡。

Si-RNA技术是近年来发展起来的，能够有效的特异性降解相关基因表达的重要技术，它更能从生理水平客观而真实的反映基因的功能，为此，我们合成了特异性针对rabl3基因的si-RNA(合成的siRNA命名为si237)，其正义链序列为：5`-CAAGAGCAGUAUUCUACAATT-3`；反义链序列为：5`-UUGUAGAAUACUGCUCUUGTG-3`。并从蛋白水平和m-RNA水平检测了该si-RNA的抑制效率，以验证由si-RNA而引发基因沉默的有效性。同时，为了去除si-RNA本身对转染细胞的机能和代谢产生的影响，我们同时合成了一条无任何抑制作用的无关对照si-RNA，非沉默si-RNA(命名为si non)，其正义链序列为：5`-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3`；反义链序列为：5`-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3`，以科学合理的反映出基因敲除后，细胞表型和功能的变化。

通过实验结果，可以清楚地发现，Rabl3特异性si-RNA si237在转染后24-48小时内，能够从mRNA水平明显有效的抑制rabl3基因的表达，同时，转染后48h，蛋白质水平的抑制效果也得到了确认(见图5)，而阴性对照非沉默si-RNA却不能起到抑制基因表达的作用，从而为rabl3的功能研究提供了有效的工具和手段。

通过将合成的siRNA瞬时转染进入MDA-MB-231细胞，运用以上提及的三种检测细胞存活和凋亡的实验方法，我们可以清楚地看到，同阴性对照组相比，将rabl3基因沉默，肿瘤细胞恢复了对凋亡的敏感性，增殖能力明显受到抑制，细胞凋亡数明显增多。现分别阐述如下：

i cck-8实验：

运用电穿孔的方法，将rabl3特异性的siRNA瞬时转染进入乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，运用上述相同的方法进行检测，发现，同超表达产生的细胞增殖的变化相反，抑制该基因的表达，可以使肿瘤细胞生长减缓，代谢减弱，密度降低(见图6)，从而有效地减低细胞的增殖代谢活性，推迟肿瘤细胞的发生和发展进程。通过si-RNA的转染，我们可以从正反两个方面验证rabl3基因在肿瘤存活和增殖水平的重要作用，从而完善的显示出该基因的真实功能。

ii结晶紫染色：

结晶紫染色实验，通过对活细胞计数的方法，验证rabl3基因促进肿瘤细胞增殖的功能。

利用Cell counting kit-8(Cck-8)法检测细胞增殖和活力，存在一定局限性，它不能排除凋亡细胞崩解后，释放至细胞外，但活性仍然存在的各种代谢相关酶类对代谢底物的变色作用，从而产生实验偏差。为了避免这一误差造成的对基因功能的错误判断，更直观而准确的把握基因的真实功能，我们采用活细胞染料结晶紫，对瞬时转染了rabl3siRNA细胞和空载体阴性对照进行染色，并对已着色的活细胞进行比色分析，分别设置12h，24h，36h，48h，72h，五个时间点，通过该方法，直接反映rabl3在各个时间点对细胞存活能力的影响。通过结晶紫染色实验，我们可以发现，在si-RNA转入的细胞组中，其活细胞数较阴性对照组明显减少(见FIG 7)，说明rabl3siRNA对细胞具有增殖抑制的作用，从而排除了由于实验方法等因素造成的实验误差，从另一个角度更加充分的验证了敲除rabl3基因，对于肿瘤细胞生存的影响。

iii AV-PI双重染色：

实验中，转染有效siRNA 48小时后，通过运用Annecin V-PI双重染色的方法，并使用流式细胞仪进行染色细胞计数的方法，我们可以更加明确的得出同以上实验结果一致的结论，该实验表明rabl3基因的缺失，将明显增加Annecin V、PI单染以及AV-PI双染的细胞数目，从而说明了敲除rabl3基因，将使细胞的生存能力受到影响，使肿瘤细胞凋亡比例升高，存活的肿瘤细胞比例降低(见图8)，试验结果同以上实验完全符合，从而为rabl3基因作为一个肿瘤治疗和监测的新靶标提供了坚实的实验支持。

(3)基因rabl3与抗癌药的实验

肿瘤细胞对于抗癌药物的抵抗，是导致肿瘤治疗失败的重要原因，寻找新的治疗靶点，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，成为肿瘤临床治疗的热点和前沿。通过以上实验数据和结果，可以清楚地发现，rabl3基因单独转入细胞，可以明显地增强乳腺癌肿瘤细胞的增殖能力，但如果将基因敲除，细胞便维持在较低的增殖水平。基于以上实验的研究结果，探讨rabl3同常用的肿瘤治疗药物之间的关联，并以此作为肿瘤耐药性研究的切入点，将成为该基因研究的最重要应用价值所在。

通过以上分析，我们以抗癌药敏感的细胞系MDA-MB-231为模型，将临床治疗乳腺癌最为常用的药物紫杉醇作用于基因rabl3超表达的乳腺癌细胞中，运用流式细胞仪检测的手段，观察紫杉醇与基因rabl3之间的相互作用，以及对肿瘤细胞生存和增殖的影响，我们发现，在使用终浓度为7uM紫杉醇24h的情况下，超表达rabl3基因可以明显地降低紫杉醇诱导的乳腺癌细胞的凋亡(见图9)，反之，运用siRNA技术，将rabl3基因敲除，同对照组相比，(见图10)，显著的增强了乳腺癌细胞对于紫杉醇诱导凋亡的敏感性，增强了紫杉醇对乳腺癌细胞的抑制和杀伤能力。凋亡细胞的比例明显加大。

通过以上对人类新基因rabl3的功能实验，我们可以发现，rabl3基因具有促进细胞增值和代谢，维持细胞存活的功能表型，若将该基因敲除，则会出现细胞凋亡增加，存活数目降低的现象，同时，该基因可以抵抗紫杉醇诱导的乳腺癌细胞的凋亡，从而表明，rabl3可以作为降低肿瘤细胞耐药性，提高化疗药药效的的重要靶分子，通过对该基因表达水平的调控，可以有效地提高紫杉醇对乳腺癌细胞的杀伤能力，而该基因的抑制剂是一个潜在的化疗药增敏剂。

序列表

<110>北京大学

<120>基因rabl3的拮抗剂的应用及包含该拮抗剂的药物

<130>CNC1F090007443

<160>2

 

<210>1

<211>711

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(711)

<400>1

atggcgtccc tggatcgggt gaaggtactg gtgttgggag actcaggtgt tgggaaatct  60

tcgttagtcc atctcctatg ccaaaatcaa gtgctgggaa atccatcatg gactgtgggc  120

tgctcagtgg atgtcagagt tcatgattac aaagaaggaa ccccagaaga gaagacctac  180

tacatagaat tatgggatgt tggaggctct gtgggcagtg ccagcagcgt gaaaagcaca  240

agagcagtat tctacaactc cgtaaatggt attattttcg tacacgactt aacaaataag  300

aagtcctccc aaaacttgcg tcgttggtca ttggaagctc tcaacaggga tttggtgcca  360

actggagtct tggtgacaaa tggggattat gatcaagaac agtttgctga taaccaaata  420

ccactgttgg taatagggac taaactggac cagattcatg aaacaaagcg ccatgaagtt  480

ttaactagga ctgctttcct ggctgaggat ttcaatccag aagaaattaa tttggactgc  540

acaaatccac ggtacttagc tgcaggttct tccaatgctg tcaagctcag taggtttttt  600

gataaggtca tagagaagag atacttttta agagaaggta atcagattcc aggctttcct  660

gatcggaaaa gatttggggc aggaacatta aagagccttc attatgactg a           711

 

<210>2

<211>236

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

 

<400>2

Met Ala Ser Leu Asp Arg Val Lys Val Leu Val Leu Gly Asp Ser Gly

1               5                   10                  15

Val Gly Lys Ser Ser Leu Val His Leu Leu Cys Gln Asn Gln Val Leu

            20                  25                  30

Gly Asn Pro Ser Trp Thr Val Gly Cys Ser Val Asp Val Arg Val His

        35                  40                  45

Asp Tyr Lys Glu Gly Thr Pro Glu Glu Lys Thr Tyr Tyr Ile Glu Leu

    50                  55                  60

Trp Asp Val Gly Gly Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Val Lys Ser Thr

65                  70                  75                  80

Arh Ala Val Phe Tyr Asn Ser Val Asn Gly Ile Ile Phe Val His Asp

                 85                  90                  95

Leu Thr Asn Lys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Arg Arg Trp Ser Leu Glu

            100                 105                 110

Ala Leu Asn Arg Asp Leu Val Pro Thr Gly Val Leu Val Thr Asn Gly

        115                 120                 125

Asp Tyr Asp Gln Glu Gln Phe Ala Asp Asn Gln Ile Pro Leu Leu Val

    130                 135                 140

Ile Gly Thr Lys Leu Asp Gln Ile His Glu Thr Lys Arg His Glu Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Arg Thr Ala Phe Leu Ala Glu Asp Phe Asn Pro Glu Glu Ile

                165                 170                 175

Asn Leu Asp Cys Thr Asn Pro Arg Tyr Leu Ala Ala Gly Ser Ser Asn

            180                 185                 190

Ala Val Lys Leu Ser Arg Phe Phe Asp Lys Val Ile Glu Lys Arg Tyr

        195                 200                 205

Phe Leu Arg Glu Gly Asn Gln Ile Pro Gly Phe Pro Asp Arg Lys Arg

    210                 215                 220

Phe Gly Ala Gly Thr Leu Lys Ser Leu His Tyr Asp

225                 230                 235

Claims (10)

1.基因rabl3(SEQ ID NO.：1)的拮抗剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述的肿瘤是人乳腺癌。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述的拮抗剂是针对基因rabl3所转录的mRNA的siRNA分子或者反义RNA。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述的siRNA分子含有第一链和第二链，第一链包含对应于基因rabl3核苷酸序列的核糖核苷酸序列，第二链包含与基因rabl3核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列。

5.如权利要求1或2所述的应用，其中所述的拮抗剂是针对基因rabl3所翻译的蛋白质(SEQ ID NO.：2)的单克隆抗体或多克隆抗体。

6.一种抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡或者用于增强抗肿瘤药疗效的药物，其包含基因rabl3(SEQ ID NO.：1)的拮抗剂。

7.如权利要求6所述的药物，其中所述的肿瘤是人乳腺癌。

8.如权利要求6或7所述的用途，其中所述的拮抗剂是针对基因rabl3所转录的mRNA的siRNA分子或者反义RNA。

9.如权利要求8所述的药物，其中所述的siRNA分子含有第一链和第二链，第一链包含对应于基因rabl3核苷酸序列的核糖核苷酸序列，第二链包含与基因rabl3核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列。

10.如权利要求6或7所述的药物，其中所述的拮抗剂是针对基因rabl3所翻译的蛋白质(SEQ ID NO.：2)的单克隆抗体或多克隆抗体。

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