CN101784881B - 表征生物组织的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于对生物组织(30)中的第一发色荧光化合物和第二发色化合物的含量进行联合确定的方法和系统。通过对发色荧光化合物(33)的差分吸收进行光学测量实现发色荧光化合物(33)的含量确定，通过对发色荧光化合物(33)的荧光进行光学测量而实现第二发色化合物的含量确定。本发明利用适当选择的光学辐射(11-14)，并使用单一的检测装置(21)和测量装置对两个确定中的这些辐射进行至少一个滤波操作。

Description

表征生物组织的方法和装置
本发明涉及表征生物组织的方法。本发明还涉及执行该方法的系统。
更具体地，本发明涉及表征生物组织(例如植物叶)的系统和方法，该生物组织包括第一发色荧光化合物(例如叶绿素)和具有轻微的荧光性或完全不具有荧光性的第二发色化合物(例如类黄酮)。该表征旨在确定生物组织中发色荧光化合物和第二发色化合物的含量。生物组织的这种表征是非常有用的，因为生物组织中发色荧光化合物和第二发色化合物的含量表示了与相关组织的构成和生物状态有关的信息，并有利于对产生该生物组织的实体进行管理和治疗。
文献FR 2830325公开了一种光学仪器，其能够测量包括发色荧光化合物和具有轻微的荧光性或完全不具有荧光性的第二发色化合物的生物组织样本的光吸收特性。该文献中公开的方法包括对通过用具有不同波长的第一和第二辐射照射生物组织样本来激励荧光化合物而产生的荧光进行测量。上述一个辐射被第二化合物稍微吸收或完全不吸收，而另一个辐射则被相对较好地吸收。通过测量由两个辐射产生的荧光并得到测得的荧光的比率，该方法可测量样本的光吸收特性，并从而可测量生物组织中第二化合物的含量。
该技术还包括通过对生物组织中的发色荧光化合物的差分吸收测量来对该化合物的含量进行光学测量，如文献US 4986665中所述。通常，这种测量利用两个光源：一个位于该化合物的吸收带，另一个位于该吸收带之外。
然而，目前不存在通过上述测量方法共同测量生物组织中的发色荧光化合物和具有轻微的荧光性或不具有荧光性的第二发色化合物的含量的系统。
本发明的目的在于提出通过上述测量方法共同测量生物组织中的发色荧光化合物和第二发色化合物的含量的方法和系统。
因此本发明提出了一种用于表征生物组织样本的方法，该生物组织样本包括第一发色荧光化合物和第二发色化合物，该处理包括以下步骤：
-通过对生物组织(尤其是发色荧光化合物)的吸收特性进行光学测量，确定样本中该发色荧光化合物的含量；
-通过对发色荧光化合物的荧光进行光学测量，确定样本中第二发色化合物的含量。
术语“第二发色化合物”表示具有轻微的荧光性或完全不具有荧光性的发色化合物。
术语“生物组织”表示从活体(例如，植物、人体或动物)得到的组织。生物组织的一个实例是植物叶。
第二发色化合物的含量确定是本领域技术人员公知的，在此无需详细描述。对此更多的细节，可参见文献FR 2830325，其教导包含在本申请中。同样，发色荧光化合物的含量确定通过测量差分吸收而实现，这也是本领域技术人员公知的，也无需在此详细描述。其更多的细节可参见文献US 4986665。
对于本领域技术人员非显而易见的是对生物组织中发色荧光化合物和第二发色化合物的含量进行联合确定，因为包含了相同的发色荧光化合物的吸收测量和荧光测量的这两种确定被认为是不兼容的。事实上，当前已知的方法都是分别执行这些确定的，因为其利用了波长互不兼容的光源进行测量。这使得本领域技术人员认为这两个确定不能联合地执行。
有利地，根据本发明的方法使得可联合地执行这两个确认，对表征生物组织和管理生物组织所取自的实体具有一定的有用性。此外，对生物组织中的发色荧光化合物和第二发色化合物的含量进行联合确定使得可在时间和精度上相对于本领域现有的方法具有优势。
此外，有利地，根据本发明的方法使得可非破坏性地现场表征生物组织。
根据本发明的方法还可包括确定与发色荧光化合物的含量和第二发色化合物的含量之间的比率成比例的量。在非限制性的示例性应用中，例如，生物组织为植物叶，其包括叶绿素为发色荧光化合物并包括苯丙素类或多酚族化合物(例如类黄酮)为第二发色化合物，根据本发明的方法可确定与植物叶中的叶绿素含量和类黄酮含量之比成比例的量。研究表明，叶绿素/类黄酮的比率由沿植物叶的稳定性区域和区分氮需求的更精确能力所表征。参见Aurélie Cartelat等的文章“Optically assessed contents of leaf polyphenolics and chlorophyll asindicators of nitrogen deficiency in wheat(Triticum aestivum L.)”，FieldCrops Research，2005，91：p.35-49。
根据本发明的方法的一个实施方式，确定样本中第二发色化合物的含量包括以下操作：
-由第一发射装置向样本的方向发射具有不同波长的第一和第二光学辐射，第一和第二光学辐射都选择为引发发色荧光化合物的荧光辐射；
-由第一测量装置进行的第一测量，测量由第一和第二光学辐射引发的荧光辐射；以及
-根据第一测量确定样本中第二发色化合物的含量。
类似地，确定样本中发色荧光化合物的含量包括以下操作：
-由第二发射装置向样本的方向发射具有不同波长的第三和第四光学辐射，第三和第四光学辐射都旨在由发色荧光化合物部分但以不同量地吸收；
-由第二测量装置进行的第二测量，测量第三和第四光学辐射中的至少一个未吸收部分；以及
-根据第二测量确定样本中发色荧光化合物的含量。
第三和第四辐射的未吸收部分是指第三和第四辐射中被发色荧光化合物反射或透射的部分。
第一测量可包括在第一发射装置所在的侧进行至少一次测量。在这种情况下，第一测量装置至少部分地位于第一发射装置所在的侧。测量的荧光辐射是朝向第一发射装置传播的荧光辐射。
第一测量可包括在与第一发射装置相反的侧进行至少一次测量。在这种情况下，第一测量装置至少部分地位于与第一发射装置相反的侧。测量的荧光辐射是朝向与第一发射装置相反的侧传播的荧光辐射。
此外，第二测量可包括在第二发射装置所在的侧进行至少一次测量。在这种情况下，第二测量装置至少部分地位于第二发射装置所在的侧，并对朝向第二发射装置传播的、第三和第四辐射中未被发色荧光化合物吸收的部分(即，第三和第四辐射中被发色荧光化合物反射的部分)进行测量。
第二测量还可包括在与第二发射装置相反的侧进行至少一次测量。在这种情况下，第二测量装置至少部分地位于与第二发射装置相反的侧，并对朝向与第二发射装置相反的侧传播的、第三和第四辐射中的未吸收部分(即，第三和第四辐射中被发色荧光化合物透射的部分)进行测量。
此外，第一测量装置和第二测量装置可包括共享的检测装置，该方法还包括在样本和检测装置之间执行至少一次第一滤波，该第一滤波旨在：
-至少部分地阻止第一和第二辐射穿过而通向检测装置；以及
-至少部分地允许第三和第四辐射中未被样本吸收的部分穿过而通向检测装置。
事实上，根据本发明的方法可包括使用单一的检测装置用于测量发色荧光化合物的荧光辐射并用于测量第三和第四辐射中未被该化合物吸收的部分。使用单一的检测装置引起了这些测量过程(即，一方面通过发色荧光化合物的荧光方法测量生物组织中第二发色化合物的含量，另一方面通过发色荧光化合物的差分吸收测量发色荧光化合物的含量)中涉及的波长不兼容性的问题。根据本发明的方法使得可通过在样本和单一的检测装置之间进行第一滤波来解决这一问题。
对两个测量使用单一的滤波装置有利地以较低成本实现，需要较小空间，并满足了当用于两个测量的检测装置分开时与生物组织的测量表面和检测装置之间的光学耦合相关的约束。
当检测装置是例如CCD照相机的图像获取装置时，单一检测和滤波装置的有益效果变得显而易见。在这种情况下，确保了可建立由第一、第二、第三和第四辐射产生的图像之间的像素与像素的对应。
根据本发明的方法的有利版本，除了单一的检测装置之外，单一的测量装置也可用于发色荧光化合物的荧光辐射和来自第二发射装置的未被该化合物吸收的辐射的联合测量。
此外，根据本发明的方法可有利地包括发射装置和样本之间的第二滤波，以阻止向样本的方向发射的辐射的至少一部分。这一滤波操作可包括去除由第一和第二发射装置朝向样本发射的辐射中的不期望部分。
根据本发明，将第一辐射选择为使其波长：
1.不在第二发色化合物的吸收波长带内；以及
2.不在发色荧光化合物的荧光的激发波长带内；
并将第二辐射选择为使其波长：
3.包含在第二发色化合物的吸收波长带内；以及
4.包含在发色荧光化合物的荧光的激发波长带内。
类似地，将第三辐射选择为使其波长：
1.包含在发色荧光化合物的吸收波长带内；以及
2.不在第二发色化合物的吸收波长带内；
并将第四辐射选择为使其波长：
3.不在发色荧光化合物的吸收波长带内；以及
4.不在第二发色化合物的吸收波长带内。
有利地，第二(或第一)光学辐射可以预定的强度发射，第一(或第二)光学辐射以可变的强度发射，从而使由第一和第二辐射中的每个引发的荧光辐射在强度上相等。将第一辐射的强度随着控制信号而调整，控制信号与由第一辐射和所述第二辐射引发的荧光辐射相关。因此，根据本发明的方法使得可控制发色荧光化合物的可变荧光的效应，从而对生物组织中第二发色化合物的含量进行更快速更精确的确定。
此外，第一和第二辐射的强度可以预定频率具有相移地交替地变化，第三和第四辐射的强度也是如此，从而允许对以下各项单独测量：
-由第一和第二辐射中的每个引发的每个荧光辐射；以及
-第三和第四辐射中的每个中未被生物组织吸收的部分。
根据本发明的方法的有利特性，可交替地执行确定发色荧光化合物的含量和确定第二发色化合物的含量。
此外，每个辐射都可以发射为脉冲形式。例如，在确定组织中的第二发色化合物的含量时，可以预定频率交替地发射第一和第二辐射的脉冲。
此外，第一、第二、第三和第四辐射的强度可周期性地变化，例如以正弦或准正弦调制，并具有不同的调制频率，从而允许对以下各项单独测量：
-由第一和第二辐射中的每个引发的每个荧光辐射；以及
-第三和第四辐射中的每个中未被生物组织吸收的部分。
根据本发明的另一方面，提出了将根据本发明的方法用于表征植物叶的使用，其中，发色荧光化合物是叶绿素，第二发色化合物包括多酚族化合物或苯丙素类化合物，尤其是类黄酮。使用的辐射的波长可选择为大约为以下值：
-第一辐射：650nm；
-第二辐射：370nm；
-第三辐射：720nm；以及
-第四辐射：780nm。
有利地，根据本发明的使用还可包括根据作为叶绿素和多酚的含量的函数的氮的可用性的影响确定碳分布规律。参见Sylvie Meyer等人的文章“Relationships between optically assessed polyphenols andchlorophyll contents，and leaf mass per area ratio in woody plants：asignature of the carbon-nitrogen balance within leaves？”，Plant，Cell andEnvironment，2006，29：p.1338-1348。
其它使用可被设想，例如表征叶中的类胡萝卜素向叶绿素的激发能量传输效率。在这种情况下，类胡萝卜素作为第二非荧光的发色化合物。
根据本发明的第三方面，提出了用于表征生物组织样本的系统，该样本包括第一发色荧光化合物和第二荧光化合物，该系统包括：
-第一装置，通过对发色荧光化合物的荧光进行光学测量，确定样本中第二发色化合物的含量；以及
-第二装置，通过对发色荧光化合物的吸收特性进行光学测量，确定样本中发色荧光化合物的含量。
根据本发明的系统还包括计算装置，用于确定与发色荧光化合物的含量和第二发色化合物的含量之比成比例的值。这些计算装置可包括用于电子或计算处理装置中的程序。
根据本发明的具体实施方式，第一装置可包括：
-第一发射装置，向样本的方向发射具有不同波长的第一和第二光学辐射，第一和第二光学辐射都选择为引发发色荧光化合物的荧光辐射；
-第一测量装置，测量由第一和第二光学辐射引发的荧光辐射；以及
-计算装置，根据对荧光辐射的测量确定样本中第二发色化合物的含量；
第二装置可包括：
-第二发射装置，向样本的方向发射具有不同波长的第三和第四光学辐射，第三和第四光学辐射都旨在由发色荧光化合物部分吸收；
-第二测量装置，测量第三和第四光学辐射中的至少一个未吸收部分；以及
-计算装置，根据对第三和第四光学辐射中的至少一个未吸收部分的测量确定样本中发色荧光化合物的含量；
在此实施方式的的有利版本中，第一测量装置和第二测量装置包括共享的检测装置，该系统还包括设置在样本和检测装置之间的第一滤波装置，第一滤波装置旨在：
-至少部分地阻止第一和第二辐射穿过而通向检测装置；以及
-至少部分地允许第三和第四辐射的未吸收部分穿过而通向检测装置。
特别地，检测装置可包括硅光电二极管，其一方面检测检测由第一和第二辐射中的每个引发的发色荧光化合物的荧光辐射，另一方面检测第三和第四辐射的未吸收部分。此外，第一滤波装置可包括至少一个滤光镜。
根据本发明的第一实施方式，检测装置设置在组织样本的一侧，第一和第二发射装置设置在组织样本的另一侧。检测装置检测：
-朝向与第一和第二辐射装置相反的侧传播的荧光辐射；以及
-朝向与第一和第二辐射装置相反的侧传播的第三和第四辐射的未吸收部分，即，第三和第四辐射中由发色荧光化合物透射的部分。
在第一实施方式中，根据本发明的系统例如可提供为钳的形式。
根据本发明的系统的第二实施方式，检测装置与第一和第二发射装置设置在组织样本的相同侧。在此实施方式中，检测装置检测：
-朝向第一和第二辐射装置所在的侧传播的发色荧光化合物的荧光辐射；以及
-朝向第一和第二辐射装置所在的侧传播的第三和第四辐射中未被发色荧光化合物吸收的部分，即，第三和第四辐射中由发色荧光化合物反射的部分。
有利地，根据本发明的系统还可包括对检测装置检测的辐射进行放大和/或分析的装置。
此外，根据本发明的系统还可包括设置在发射装置和样本之间的第二滤波装置，用于阻止向样本的方向发射的辐射中的至少一个不期望部分。
该系统还可包括命令和控制装置，其将控制信号提供至第一发射装置，以使第一和第二光学辐射引发的辐射在强度上基本相等。
此外，该系统可有利地包括同步装置，将同步信号提供至第一和第二发射装置，以使：
-第一和第二辐射的强度具有相移地周期性变化；以及
-第三和第四辐射的强度具有相移地周期性变化。
另一方面，作为一种选择，该系统可包括调制装置，为发射装置提供调制信号，以使第一、第二、第三和第四辐射的强度以不同调制频率周期性地(例如正弦地)变化。
根据对非限制性实施方式的详细描述和以下附图，本发明的其它特性和有益效果将显而易见。
图1是根据本发明的系统的第一实施方式的图示；
图1之二是根据本发明的系统的第二实施方式的图示；
图2是根据本发明的系统的第一实施方式中的测量原理的图示；
图2之二是根据本发明的系统的第二实施方式中的测量原理的图示；
图3是用可用于根据本发明的系统的不同组件获得的测量灵敏度的表示；
图4和图5是可用于根据本发明的系统的不同组件获得的植物叶的荧光和透射范围的表示；以及
图6是根据本发明的系统的第一实施方式用于葡萄皮表征的图示。
以下描述的非限制性的示例性实施例涉及用于对植物叶中的叶绿素(发色荧光化合物)和多酚(第二发色化合物)的含量进行联合测量的系统。多酚的测量由文献FR 2830325中描述的叶绿素荧光方法执行。叶绿素的测量由测量叶绿素中的差分吸收而实现。
图1和图1之二示出了对植物叶中的叶绿素和多酚的含量进行联合测量的这种系统的两个实施方式。在这两个实施方式中，该系统具有两个部分：发射部10和接收部20。在图1所示的第一实施方式中，发射部10和接收部20分别设置在植物叶样本30的两侧，而在第二实施方式中，发射部10和接收部20设置在植物叶样本30的同一侧。
在任一实施方式中，发射部10包括照射植物叶样本30的前表面的四个辐射源11、12、13、14。如图1和图1之二所示，源11-14中的每个与脉冲电源16-19中的一个相关联，并由同步信号SS控制。源11、12用于测量叶30中的多酚含量，并引发叶绿素的荧光。另两个源13、14用于测量由叶绿素引起的吸收，从而确定样本30中的叶绿素含量。发射部10还包括光学滤波器F1，其位于源11和12与样本30之间。
根据本发明的系统的接收部20包括检测器21，其优选地为根据检测到的辐射提供电信号的硅光电二极管，检测器21与光学滤波器F2相关联，光学滤波器F2位于样本30与检测器21之间。滤波器21的功能是：
-阻止来自激励源11和12的辐射朝向检测器21通过；
-部分地或完全地传送来自另两个源13和14的辐射中未被叶绿素吸收的部分；以及
-还部分地或完全地传送由源11和12发射的光学辐射引发的叶绿素荧光发射。
滤波器F1用来改善源11和12发射的辐射的光谱纯度，并阻止从这些源产生的任何辐射(对应于滤波器F2的灵敏度带)。
系统的接收部20还包括命令和控制单元22以及用于将电源16-19同步从而将源11-14同步的单元23。该系统的接收部还包括测量和转换单元24、计算单元25，计算单元25包括连接于一个或多个外围设备26的计算装置，一个或多个外围设备26包括存储装置、数据传输装置、以及例如屏幕和键盘的用户接口。最后，根据本发明的系统的接收部20包括用于放大由检测器21提供的电信号的放大装置27。
源12、13、14具有固定的强度，该强度由用户预先编程或者可由用户调整。源11的强度是可变的并受控制单元22的控制。控制单元22通过控制信号SC作用于电源19，以调整源11的强度，使由源11引发的叶绿素荧光等于由源12引发的叶绿素荧光。源11-14的启动由包括电子同步装置的同步单元23控制，同步单元23通过同步信号SS作用于电源16-19。
图2和图2之二分别是第一和第二实施方式中的测量原理和不同辐射的光学路径的图示。参照图2和图2之二，四个源11-14优选地为发光二极管(LED)并照射叶30的相同表面31。源11和12分别用于发射两个辐射111和121，这两个辐射旨在引发叶绿素33的荧光并分别引发两个荧光辐射112和122。另两个源13和14分别用于发射两个辐射131和141，旨在由叶30(更精确地，由叶绿素33)部分地吸收但吸收不同的量。
图2表示：
-叶绿素发射的朝向源11和12的相反侧的荧光辐射112和122；以及
-辐射131和141的透射部分。
在系统的接收部20和发射部10位于叶的相反两侧的第一实施方式中，检测器21检测朝向与源11-14相反的一侧发射的辐射。事实上，在第一实施方式中，检测器21另一方面还检测朝向叶的后表面35发射的荧光以测量多酚含量34，并检测叶30的透光度从而可确定叶绿素含量33。
图2之二表示：
-由辐射111和121引发和由叶绿素发射的朝向源11和12的荧光辐射112和122；以及
-辐射131和141的反射部分。
在第二实施方式中，由于系统的接收部20与发射部10位于叶的相同侧，因此检测器21检测朝向源发射的辐射。事实上，在第二实施方式中，检测器21一方面用来检测朝向叶的前表面31发射的荧光以测量多酚34的含量，另一方面检测辐射131和141中由叶30反射的部分以测量叶30的反射率从而可确定叶绿素33的含量。
第一和第二实施方式基本是等价的，因为在生物组织中反射率和透射率是相关的。
在任一实施方式中，每个源11-14的波长都根据待测量的化合物的吸收带、其技术特征(例如光谱纯度或功率)、其商业可用性和成本、以及与检测器21相关的一个或多个滤波器F2的商业可用性和成本而选择。
为了叶30内的多酚34和叶绿素33的联合测量，检测器21是硅光电二极管。滤波器F2是Schott(德国)的3毫米RG715滤色器。这种滤波器的光谱传输带对900nm是720nm(一半高度，45％透射)和更大。
源11发射红光范围内的辐射111，在该范围内，多酚34不会吸收辐射，该辐射引发叶绿素33的荧光并引起荧光辐射112的发射，该辐射用作测量多酚34的吸收的参考。该源的波长优选地为650nm(可避免由花色素苷吸收)，并设定叶绿素a和b的吸收光谱的等吸收点。源12发射紫外范围内的辐射121，其波长位于多酚34的吸收带内，该辐射引发叶绿素33的荧光并引起荧光辐射122的发射。源12的波长例如可为大约370nm。UV源的实例为Roithner Lasertechnik NS370L或UVLED370-10二极管。
源11和12分别通过发射辐射111和121连续照射叶30。根据多酚34在叶中的含量，紫外辐射121由叶的表皮以可变量吸收，而红光辐射111则不被吸收。辐射111和112引发叶绿素33的荧光，然后分别发射红光范围内和近红外范围内的荧光辐射112和122，其强度与叶绿素33接收的辐射111和121的强度成比例。荧光辐射112和122一方面朝向叶30的前表面31发射(图2之二)，另一方面朝向叶30的后表面35发射(图2)。由源11和12激发的荧光发射的比率的测量使得可确定表皮的透光率，从而可通过以下关系确定其多酚级别或含量：
phen = C 0 log ( F R F UV ) - - - ( 1 )
其中，phen是叶30的表皮中多酚的含量(单位为毫微摩尔/平方厘米)，C0是常量，FR和FUV是由源11和12激励的叶绿素所发射的荧光辐射112和122的强度。
在检测滤波器F2的带宽限制下，源13发射720nm的辐射131。该辐射由叶绿素部分吸收，未被吸收的部分一方面如图2之二所示朝向叶的前表面31传播，另一方面如图2所示朝向叶的后表面35传播。
源14发射780nm或更大波长的辐射141。辐射141几乎不被叶绿素33吸收或仅被其稍微吸收，未被吸收的部分朝向叶30的前表面31传播(图2之二)或朝向叶30的后表面35传播(图2)。源14用作测量叶30中的叶绿素33的含量的参考。波长分别为720和780nm的辐射131和141的未吸收部分的强度的差分使得可通过以下关系估计叶绿素含量：
chl = C 2 [ log ( I 780 I 720 ) - C 1 ] - - - ( 2 )
其中chl是叶30中的叶绿素含量(单位为微克/平方厘米)，C1和C2是常量，I780和I720分别是辐射141和131未被叶绿素33吸收的的部分的强度。
荧光辐射122和112中的每个以及辐射131和141中未被吸收的部分的每个都由检测器21至少部分地检测，检测器21生成与检测到的辐射的强度成比例的电信号Sm。然后，电信号Sm由放大装置27放大，将放大的电信号Sma一方面提供给测量和转换单元24、另一方面提供给命令和控制单元22。测量和转换单元24对信号Sma进行模数转换，将数字信号Sn提供给计算单元25。
命令和控制单元22根据放大的数字信号Sma生成控制信号SC。控制信号SC然后用于调整源11发射的辐射111的强度。信号SC是分别由源11和12发射的辐射111和121引发的叶绿素的荧光辐射112和122的强度的函数。如上所述，控制信号SC生成为使由辐射111和121引发的荧光辐射的强度相等。
控制信号SC还提供至计算单元25，其根据信号Sn和控制信号SC计算叶30中叶绿素33和多酚34的含量。
同步单元23通过提供至电源16-19的同步信号SS将整个系统与测量和转换单元以及命令和控制单元22同步。
叶绿素/多酚的比率可通过计算单元25确定。已经说明，该比率由沿着叶30的稳定性区域表征，并能更好地确定植物的氮需求，而孤立获取的多酚或叶绿素沿着叶变化并根据提供的氮的剂量而变化。从而，叶绿素/多酚的比率是用于作物管理的重要指示。
源11-14、滤波器F1和F2、检测器的其它光谱组合可根据如下几点而设想：
-将由荧光测量的化合物：可不使用紫外线而是使用蓝光(450nm)、绿光(530nm)或琥珀黄光(590nm)范围内的激励来测量花色素苷；以及
-滤色器F2：例如RG695(Schott，德国)的滤波器可使用大约710nm的源13，或者例如RG9的滤波器可使用大约730nm的源13。在第一种情况下，源12可优选地使用另一波长使其可发射大约620或630nm的辐射。
图3示出了随波长(单位为nm)和使用的滤波器F2而变化的、叶30中叶绿素33的含量测量的-ΔT/ΔChl灵敏度(单位为cm2/μg)。如Stéphane Jacquemoud和Frédéric Baret在“PROSPECT：A Model ofLeaf Optical Properties Spectra”(Remote Sens.Environ.，1990.34：p.75-91)中所述，通过用Prospect模型进行仿真来获得该灵敏度。对于叶绿素含量在40至80μg/cm2之间变化的平均值，用RG695型滤波器F2和710nm的源13获得的灵敏度41大于用RG715型滤波器F2和720nm的源获得的灵敏度42，灵敏度42又大于用RG9型滤波器F2和730nm的源获得的灵敏度。该图还示出了叶30的透射带44。
为了简化上述实施例中涉及的不同波长的显示和比较，图4和图5示出了叶30的后表面35的荧光带51、叶30的透射带44、RG695滤波器的光谱带52、RG715滤波器的光谱带53、RG9滤波器的光谱带54、以及a类叶绿素、b类叶绿素和栎精(其为多酚)各自的吸收带55、56和57。
在以上描述的所有情况中，根据下文所述过程执行测量。首先，将源11和12交替激活，以引发叶绿素荧光。如文献FR 2830325所述对荧光强度的比率进行测量。将源12的强度保持固定，并调整参考源11的强度，以使叶发射的荧光强度相等。然后，由参考源11发射的光强度使得可确定叶30内的多酚含量。
然后，将用于测量叶绿素的源交替地激活，并测量辐射13和14未被叶吸收的部分。这使得可通过上文的关系式(2)推导出叶绿素含量。
意外的是，在发射部10和接收部20分别位于待表征的生物组织的两侧的第一实施方式中发现，通过将生物实体直接插入在发射部10和接收部20之间，根据本发明的系统可用于表征厚组织或厚生物实体的生物组织。在这种情况下，可在生物实体的至少一部分上直接执行实体生物组织的表征，而无需取得组织样本。根据本发明的系统例如可在茎、种子、整个水果或水果片上直接执行生物组织的表征。在可由根据本发明的系统执行表征的水果中，非限制性地可包括李子、樱桃、橄榄、浆果类(例如葡萄)、黑醋栗和醋栗。因此，在第一实施方式中，根据本发明的系统可更快速、更简单且更便宜地执行生物组织的表征。
通常，测试显示了通过对生物实体的生物组织执行测量来测量：
-组织中发色荧光化合物的含量；
-组织中仅具有轻微的荧光性或不具有荧光性的发色化合物的含量；或
-以上二者，
上述测量可在包括该组织的实体或至少其厚部分上直接执行。这些测量还可在厚组织上执行。因此，并入了通过组织测量的测量系统可用在厚组织上，或直接用于插入在系统的发射部和接收部之间的实体上。示例性地，文献FR 2830325中描述的通过组织的测量可在其组织待表征的生物实体上直接执行。
在第一实施方式中，根据本发明的系统可为如图6所示的钳60的形式，其示出了发射部10和接收部20。将待表征的生物组织或代表征的生物组织的生物实体直接插入钳的两部分之间。示例性地，图6示出了使用钳60表征葡萄61。葡萄的一个外表面接收从源11、12、13、14发出的辐射111、121、131、141，这些辐射由葡萄皮62部分地吸收但以不同量吸收。由辐射111和121引发的荧光辐射112和122、以及辐射131和141的透射部分在通过果肉63之后由检测器21在相对的外表面检测。测量的发色荧光化合物是叶绿素，第二发色化合物在第一变体中是苯丙素类族中的一种，或者在第二变体中是花青苷族中的一种。因此，使用的辐射可具有在以下值周围选择的波长：
-第一辐射：650nm；
-第二辐射：对于测量苯丙素类族的化合物为370nm，对于测量花青苷族的化合物为530或590nm；
-第三辐射：720nm；以及
-第四辐射：780nm。
当然，钳60包括图6中未示出的上文所述的控制装置、同步装置或调制装置。
根据本发明的第二实施方式可提供为便携式装置的形式或安装在精准农业和生物领域中任何机器上的装置。
可设想根据本发明的系统的第二实施方式的两个重要的非限制性的应用：
-用便携式的或安装在农业机械上的装置对农作物的氮需求进行无接触的或远程的估计，用于引导农业实践，尤其用在精准农业中；
-对动物组织或人体组织进行体内表征，尤其是用于肿瘤的早期检测，将例如原卟啉IX(发射峰值为630nm和690nm)的血红蛋白衍生物作为发色荧光化合物、将黑色素作为发色化合物的联合检测。
有利地，本发明可：
-用单一的检测器执行生物组织内的发色荧光化合物和第二发色化合物的含量的测量；
-使系统小型化以获得便携式的、易于使用的、独立且低成本的装置；
-使用发光二极管作为辐射源；
-通过将辐射源置于生物组织的前表面并将检测器置于生物组织的后表面的配置，使测量点周围的空间需求最小化，并使光学耦合最优化；
-将辐射源的波长和检测器的灵敏度带的组合最优化，以执行精确灵敏的测量；以及
-将光学中常用的滤色器设置在检测器和生物组织之间。
本发明不限于上述详细描述的实施例，并可用于表征任何类型的生物组织。

Claims (15)

1.一种用于表征生物组织样本(30)的方法，所述样本包括第一发色荧光化合物(33)和第二发色化合物(34)，所述方法包括以下步骤：
-通过对所述发色荧光化合物(33)的荧光进行光学测量，确定所述样本(30)中所述第二发色化合物的含量，所述确定包括以下步骤：
-由第一发射装置(11，12)向所述样本(30)的方向发射具有不同波长的第一光学辐射(111)和第二光学辐射(121)，所述第一光学辐射和第二光学辐射(111，121)都选择为引发所述发色荧光化合物(33)的荧光辐射(112，122)，以使所述第一辐射和第二辐射中的一个被所述第二发色化合物稍微吸收或完全不吸收，并且所述第一辐射和第二辐射中的另一个被所述第二发色化合物相对较好地吸收；
-由第一测量装置测量由所述第一光学辐射和第二光学辐射(111，121)引发的所述荧光辐射(112，122)；以及
-根据所述第一测量装置的测量结果确定所述样本(30)中所述第二发色化合物(34)的含量；
-通过对所述发色荧光化合物(33)的吸收特性进行光学测量，确定所述样本(30)中所述发色荧光化合物(33)的含量，所述确定包括以下操作：
-由第二发射装置(13，14)向所述样本(30)的方向发射具有不同波长的第三光学辐射(131)和第四光学辐射(141)，以使所述第三辐射和第四辐射中的一个被所述发色荧光化合物部分吸收，并且所述第三辐射和第四辐射中的另一个仅被所述发色荧光化合物稍微吸收或几乎不吸收；
-由第二测量装置测量所述第三光学辐射和第四光学辐射(131，141)中的至少一个未吸收部分；以及
-根据所述第二测量装置的测量结果确定所述样本(30)中所述发色荧光化合物(33)的含量；
其特征在于，所述第一测量装置和所述第二测量装置包括共享的检测装置(21)，所述方法还包括在所述样本(30)和所述检测装置(21)之间进行至少一个第一滤波，所述第一滤波旨在：
-阻止所述第一辐射和第二辐射(111，121)穿过而通向所述检测装置(21)；
-至少部分地允许所述第三辐射和第四辐射(131，141)的所述未吸收部分穿过而通向所述检测装置(21)；以及
-至少部分地允许由所述第一辐射和第二辐射(112，121)引发的所述荧光辐射(112，122)通过。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第一辐射(111)选择为使其波长：
-不在所述第二发色化合物(34)的吸收波长带内；以及
-包含在所述发色荧光化合物(33)的荧光的激发波长带内；将所述第二辐射(121)选择为使其波长：
-包含在所述第二发色化合物(34)的吸收波长带内；以及
-包含在所述发色荧光化合物(33)的荧光的激发波长带内。
3.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，将所述第三辐射(131)选择为使其波长：
1.包含在所述发色荧光化合物(33)的吸收波长带内；以及
2.不在所述第二发色化合物(34)的吸收波长带内；
将所述第四辐射(141)选择为使其波长：
3.不在所述发色荧光化合物(33)的吸收波长带内；以及
4.不在所述第二发色化合物(34)的吸收波长带内。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括在所述第一发射装置(11，12)与所述样本(30)之间进行第二光学滤波，用来阻止向所述样本(30)的方向发射的辐射的一部分。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二光学辐射(121)以预定的强度发射，所述第一光学辐射(111)以可变的强度发射，从而使由所述第一辐射和第二辐射(111，121)中的每个引发的荧光辐射(112，122)在强度上相等。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述第一辐射(111)的强度随着控制信号(Sc)而调整，所述控制信号与由所述第一辐射(111)和所述第二辐射(121)引发的荧光辐射(112，122)相关。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一辐射和第二辐射(111，121)的强度以预定频率交替地变化并具有相移，所述第三辐射和第四辐射(131，141)的强度也是如此。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括确定与所述发色荧光化合物(33)的含量和所述第二发色化合物(34)的含量之间的比率成比例的量。
9.前述任一项权利要求所述的方法用于表征植物叶(30)的使用，其中，所述发色荧光化合物(33)是叶绿素，所述第二发色化合物(34)包括多酚族化合物或苯丙素类化合物。
10.如权利要求9所述的使用，其特征在于，
-将所述第一辐射(111)的波长选择为大约650nm；
-将所述第二辐射(121)的波长选择为大约370nm；
-将所述第三辐射(131)的波长选择为大约720nm；以及
-将所述第四辐射(141)的波长选择为大约780nm。
11.如权利要求9或10所述的使用，其特征在于，还包括根据叶绿素和多酚的含量确定植物的氮需求。
12.用于表征生物组织样本的系统，所述样本包括第一发色荧光化合物(33)和第二发色化合物(34)，所述系统包括：
-第一装置，通过对所述发色荧光化合物(33)的荧光进行光学测量，确定所述样本(30)中所述第二发色化合物的含量，所述第一装置包括：
-第一发射装置(11，12)，向所述样本(30)的方向发射具有不同波长的第一光学辐射(111)和第二光学辐射(121)，所述第一光学辐射(111)和第二光学辐射(121)都选择为引发所述发色荧光化合物(33)的荧光辐射(112，122)，以使所述第一辐射和第二辐射中的一个被所述第二发色化合物稍微吸收或完全不吸收，并且所述第一辐射和第二辐射中的另一个仅被所述第二发色化合物相对较好地吸收；
-第一测量装置，测量由所述第一光学辐射和第二光学辐射(111，121)引发的所述荧光辐射(112，122)；以及
-计算装置(25)，根据对所述荧光辐射(112，122)的测量确定所述样本(30)中所述第二发色化合物(34)的含量；
-第二装置，通过对所述发色荧光化合物(33)的吸收特性进行光学测量，确定所述样本(30)中所述发色荧光化合物(33)的含量，所述第二装置包括：
-第二发射装置(13，14)，向所述样本(30)的方向发射具有不同波长的第三光学辐射(131)和第四光学辐射(141)，以使所述第三辐射和第四辐射中的一个被所述发色荧光化合物部分吸收，并且所述第三辐射和第四辐射中的另一个仅被所述发色荧光化合物稍微吸收或几乎不吸收；
-第二测量装置，测量所述第三光学辐射和第四光学辐射(131，141)中的至少一个未吸收部分；以及
-计算装置(25)，根据对所述第三光学辐射和第四光学辐射(131，141)中的至少一个未吸收部分的测量确定所述样本(30)中所述发色荧光化合物(33)的含量；
其特征在于，所述第一测量装置(21)和所述第二测量装置(21)包括共享的检测装置(21)，所述系统还包括设置在所述样本(30)和所述检测装置之间的第一滤波装置(F2)，所述第一滤波装置(F2)旨在：
-阻止所述第一辐射和第二辐射(111，121)穿过而通向所述检测装置；
-至少部分地允许所述第三辐射和第四辐射(131，141)的所述未吸收部分穿过而通向所述检测装置(21)；以及
-至少部分地允许由所述第一辐射和第二辐射(111，121)引发的所述荧光辐射(112，122)通过。
13.如权利要求12所述的系统，其特征在于，所述检测装置包括硅光电二极管(21)，其用来：
-一方面，检测由所述第一辐射和第二辐射(111，121)中的每个引发的所述发色荧光化合物(33)的荧光辐射(112，122)，以及
-另一方面，至少部分地检测所述第三辐射和第四辐射(131，141)的未吸收部分。
14.如权利要求12至13中任一项所述的系统，其特征在于，还包括位于所述第一发射装置(11-12)和所述样本(30)之间的第二滤波装置(F1)，其用于阻止朝向所述样本(30)发射的辐射的至少一部分。
15.如权利要求12所述的系统，其特征在于，还包括命令和控制装置(24)，其向所述第一发射装置(11，12)提供控制信号(Sc)，从而使由所述第一辐射和第二辐射(111，121)引发的所述发色荧光化合物(33)的所述荧光辐射(112，122)在强度上基本相等。
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