ES2400411B1 - Dispositivo y método de medición de reflectividad, transmisividad y fluorescencia - Google Patents

Abstract

Dispositivo y método de medición de reflectividad, transmisividad y fluorescencia.#La presente invención hace referencia a un dispositivo y a un método destinados a medir la reflectividad, la transmisividad y/o la fluorescencia de muestras bajo estudio, siendo dichas muestras, preferentemente, hojas vegetales. El dispositivo comprende un medio de sujeción de las muestras formado por, al menos, dos elementos de cierre que, al cerrarse, conforman una cámara oscura para alojar dichas muestras; un medio de detección de la radiación reflejada y de la fluorescencia ascendente de las muestras, conectable a, al menos, uno de los elementos de cierre del medio de sujeción; un medio de detección de la radiación transmitida y de la fluorescencia descendente de las muestras, conectable a, al menos, uno de los elementos de cierre del medio de sujeción; y un medio de análisis espectral conectable a dichos medios de detección.

Description

Dispositivo y método de medición de reflectividad, transmisividad y fluorescencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a un dispositivo y a un método destinados a medir la reflectividad, la transmisividad y/o la fluorescencia de muestras bajo estudio, siendo dichas muestras, preferentemente, hojas vegetales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los dispositivos destinados a la medición de la fluorescencia en hojas vegetales son bien conocidos en el estado de la técnica y se emplean habitualmente tanto en estudios de laboratorio como en estudios de campo. Dichos estudios permiten analizar propiedades de las especies vegetales estudiadas tales como, por ejemplo, los procesos de fotosíntesis propios de cada especie, la emisión de la fluorescencia inducida por el sol, los ciclos diurnos de emisión de dicha fluorescencia, o para la modelización teórica del ciclo del carbono, entre otros. Especialmente, los estudios de campo resultan fundamentales para poder analizar las propiedades de las especies vegetales estudiadas in vivo, lo que permite obtener información en condiciones naturales, tanto del estado de las hojas estudiadas, como de la iluminación a la que son sometidas dichas hojas.

Algunos ejemplos disponibles en el mercado de dispositivos empleados para la medición de la fluorescencia son los dispositivos basados en iluminación artificial, filtrada de forma que se dejan pasar las longitudes de ondas que excitan la fotosíntesis, eliminando aquéllas en las que la clorofila emite la fluorescencia, o los sistemas basados en iluminación artificial modulada, que se superpone a la iluminación natural, equipados con un sistema de detección sincronizado con los pulsos de luz emitidos, como son, por ejemplo, los sistemas PAM (“Pulse Amplitude Modulation) comercializados por la compañía Walz.

Por otra parte, dentro de las herramientas conocidas para el estudio de la reflectividad y la transmisividad en muestras vegetales, cabe citar los siguientes dispositivos, empleados de manera predominante en el estado de la técnica:

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Dispositivos basados en una esfera integradora a la que hay que acoplar una fuente de iluminación externa: Una esfera integradora es una esfera hueca cuyo interior está cubierto con un material de reflectividad cercana al 100% (p. ej. Spectralon®), donde dicha esfera dispone de tres o más aberturas que no son coaxiales, colocándose en una de las aberturas una fuente de luz y, en otra, un detector. La luz que penetra en la esfera sufre múltiples reflexiones en su interior, distribuyéndose de forma homogénea. Mediante la colocación de la muestra estudiada en la tercera de las aberturas, la luz que recoge el detector es la reflejada por la muestra, mientras que, mediante la colocación de la muestra entre la fuente de luz y la abertura, la luz medida en el detector corresponde a la luz transmitida. Las medidas tomadas mediante los dispositivos de esfera integradora proporcionan un promedio de la luz reflejada (o transmitida) hemisféricamente (en todas direcciones).

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Dispositivos que comprenden una pinza que sostiene la muestra estudiada, equipada con un fondo reversible de colores negro y blanco donde, para medir la reflectividad, se coloca la muestra sobre el fondo negro, se ilumina y se mide la luz reflejada. De forma análoga, para medir la transmisividad, se coloca el fondo blanco tras la muestra y se mide la luz que ha atravesado la muestra dos veces, al reflejarse en el fondo blanco, sumándose a la luz reflejada por la superficie de la hoja y donde, mediante un algoritmo, se extrae el valor de una sola transmisión a partir de las dos medidas realizadas.

Para realizar el análisis de la luz detectada mediante los diferentes tipos de dispositivos antes descritos, se emplean los aparatos de análisis espectral usados comúnmente en el estado de la técnica, tales como espectrómetros, espectrorradiómetros, espectrofotómetros, fotómetros de filtros, cámaras CCD (“Charge coupled device”) o CMOS (“Complementary metal-oxide semiconductor”) con filtros espectrales (ruedas de filtros, filtros acusto-ópticos) o cámaras convencionales.

Si bien la utilización de una combinación de los sistemas anteriormente citados (aquéllos utilizados para medir fluorescencia y aquéllos utilizados para medir la reflectividad/transmisividad) constituye una alternativa válida para la medición de las tres propiedades deseadas, es importante resaltar que ninguno de dichos sistemas, por separado, es capaz de realizar la medición conjunta de las tres propiedades consideradas mediante un único soporte experimental.

Adicionalmente, los dispositivos del estado de la técnica no están exentos de problemas técnicos que permanecen aún sin resolver, y que se superan mediante la presente invención. Por una parte, con relación a la medida de la fluorescencia, los dispositivos del estado de la técnica se basan en el uso de luz artificial para provocar la emisión de dicha fluorescencia, siendo ésta de una calidad distinta a la de la luz solar, resultando esta diferencia, a la postre, en la medida de un estado diferente del estado natural de la planta. Por otra parte, la mayoría de estos sistemas sólo permiten medir uno de los dos picos característicos de emisión de fluorescencia de la clorofila o, en

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los casos en los que se miden los dos, dicha medición se realiza en condiciones alteradas, al eliminar gran parte de la luz que activa la fotosíntesis en las longitudes de onda del rojo, para poder detectar el primer pico de emisión.

Con relación a la medida de la reflectividad y la transmisividad, los dispositivos del estado de la técnica también presentan problemas de importancia: respecto a los dispositivos de esfera integradora, resultan poco manejables en estudios de campo (de hecho, su principal función es la realización de estudios de laboratorio), debido a que son muy voluminosos, requieren de una fuente de luz artificial controlada y precisan, adicionalmente, de una batería, además del sistema detector. El propio volumen de la esfera hace que poder medir en la muestra estudiada resulte difícil, necesitando, en numerosas ocasiones, cortar la hoja de muestra para poder realizar las medidas, lo que impide realizar un estudio completo en condiciones naturales. Además, los dispositivos basados en esfera integradora son capaces de medir únicamente luz transmitida/reflejada, pero no fluorescencia.

Por otra parte, el principal problema que acarrean los sistemas de pinza con fondo reversible es que en ellos se asume que la transmisividad en el sentido descendente (en el sentido de la luz incidente), es idéntica a la transmisividad en el sentido ascendente (en el sentido opuesto al de la luz incidente), tras reflejarse en el fondo blanco, lo cual no siempre resulta cierto, especialmente en aquellas zonas del espectro donde se producen fuertes absorciones de radiación, como es el caso de la absorción de la clorofila en las regiones del rojo y del azul. Lo mismo sucede al asumir que la reflectividad en ambas caras de la hoja es idéntica. Por ultimo, la contribución luminosa de la superficie negra del fondo reversible no es, en la práctica, completamente desdeñable, por lo que la medida de la reflectividad en estos sistemas lleva implícito un considerable margen de error.

Con el objetivo de proporcionar una solución a los problemas del estado de la técnica antes mencionados, se plantea la presente invención, basada en un dispositivo portátil completamente adaptado para realizar estudios de campo sin necesitad de alterar el estado de las muestras estudiadas, resultando además mínimamente invasivo, y siendo capaz, al mismo tiempo, de realizar una medida conjunta de todas las propiedades analizadas (reflectividad, transmisividad y fluorescencia), mediante un único montaje experimental.

Concretamente, una de las principales ventajas del presente dispositivo frente a los sistemas de medida de fluorescencia y frente a los dispositivos basados en una esfera integradora, es que la presente invención permite la medida bajo iluminación natural, con luz solar, preservando las condiciones naturales de la muestra, mejorando además sustancialmente la portabilidad y facilidad de uso en condiciones de campo. En cuanto a los sistemas de pinza con fondo reversible, dichos sistemas se basan en el doble paso de la luz a través de la muestra, junto con una pluralidad de aproximaciones teóricas para poder determinar la reflectividad y transmisividad, lo que conlleva un cierto grado de pérdida de precisión que conduce, a la postre, a la toma de medidas erróneas, siendo dicha pérdida un efecto indeseado que se solventa mediante el dispositivo de la invención.

Adicionalmente, la presente invención permite derivar la reflectividad y transmisividad reales, (no afectadas por la emisión de fluorescencia), mediante la medición de la irradiancia, la radiancia ascendente y descendente en la muestra estudiada, así como la emisión de fluorescencia ascendente y descendente. A partir de las sustracción de la fluorescencia a la radiancia, es posible derivar las radiancias reflejada y transmitida reales, de las que se obtienen, en consecuencia, dividiendo por la irradiancia, la reflectividad y la transmisividad reales, lo cual resulta imposible con los sistemas del estado de la técnica antes mencionados, ya que ninguno permite la medida conjunta de la reflectividad, la transmisividad y la fluorescencia. En la actualidad, sólo un sistema basado en un monocromador (dispositivo que permite aislar las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden sobre la muestra) podría medir las citadas componentes de forma separada, pero dicho tipo de dispositivos suelen ser voluminosos y requieren alimentación eléctrica externa, por lo que, aunque en principio puedan ser usados en estudios de campo, no resultan prácticos. Además, debido a que el sistema de medida de los anteriores dispositivos se basa en la realización de un barrido espectral, habitualmente los tiempos de medida resultan excesivamente largos, limitando de manera indeseada el número de medidas realizables en una jornada de trabajo de campo.

Otra ventaja de la presente invención se deriva del uso combinado de, al menos, dos filtros ópticos, con los que se permite la medida precisa de los dos picos de emisión de fluorescencia de las muestras vegetales bajo estudio. El motivo fundamental de utilizar dos filtros es porque, en dichas muestras, existe un solape de absorción y de emisión en la región entre 640 nm y 700 nm, correspondiente al primer pico de emisión de 690 nm. La luz absorbida en dicha región es reemitida en el segundo pico de emisión (740 nm), por lo que, para poder medir el primer pico de emisión es necesario bloquear dicha luz (mediante el filtro de 650 nm), y por tanto, la magnitud de emisión correspondiente al segundo pico se ve reducida. De forma correspondiente, mediante el uso del filtro de 700 nm, a la clorofila le llega la totalidad de la luz que puede absorber, por lo que la magnitud correspondiente al segundo pico poseerá un valor correcto, siendo entonces el primer pico el que se verá enmascarado por la luz reflejada (que no estaría bloqueada en este caso). El interés de medir independientemente cada uno de los dos picos de emisión se deriva de que cada uno de ellos corresponde a un proceso diferenciado de fotosíntesis, por lo que medir ambos proporciona una mayor información que sólo uno de ellos. La mayoría de los sistemas conocidos en el estado de la técnica miden únicamente uno de los dos picos de emisión.

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Otra importante ventaja proporcionada por el presente dispositivo es su versatilidad, ya que permite medir tanto con luz natural, manteniendo las condiciones reales de la planta, como también utilizar luz artificial, en caso de resultar necesario.

Por último, ninguno de los sistemas existentes permite medir la fluorescencia emitida por el reverso de la hoja, es decir, por el lado que no recibe la luz directamente, denominada habitualmente como fluorescencia descendente o transmitida. Esta emisión de fluorescencia no es desdeñable y debe tenerse en cuenta al realizar un balance de energía, además de albergar información sobre la cantidad de clorofila en la hoja, entre otras. El presente sistema permite medir la fluorescencia descendente y la transmisividad de la hoja, mediante un único dispositivo.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención es un dispositivo para medir la reflectividad, la transmisividad y/o la fluorescencia de una muestra bajo estudio en presencia de una fuente de luz incidente, que comprende un medio de sujeción de la muestra formado por, al menos, dos elementos de cierre que, al cerrarse, conforman una cámara oscura para alojar dicha muestra, y caracterizado dicho dispositivo porque:

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al menos, uno de los elementos de cierre comprende una abertura de entrada de la luz incidente;

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al menos, uno de los elementos de cierre comprende una abertura de salida de luz para canalizar la luz reflejada y emitida por la región superior de la muestra bajo estudio, siendo dicha abertura de salida conectable a, al menos, un medio de detección de la radiación reflejada y de la fluorescencia ascendente de la muestra;

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al menos, uno de los elementos de cierre comprende una abertura de salida de luz para canalizar la luz transmitida y emitida por la región inferior de la muestra bajo estudio, siendo dicha abertura de salida conectable a, al menos, un medio de detección de la radiación transmitida y de la fluorescencia descendente de la muestra.

En una realización preferente de la invención los dos elementos de cierre comprenden sendas semicámaras internas que, al cerrarse, conforman la cámara oscura para alojar la muestra bajo estudio.

En una realización preferente de la invención la abertura de entrada de luz del medio de sujeción comprende un portafiltros capaz de alojar uno o más filtros ópticos de la luz incidente sobre la muestra.

En una realización preferente de la invención el portafiltros está equipado con, al menos, un filtro pasa-baja de longitud de onda de corte de 650 nm y un filtro pasa-baja de longitud de onda de corte de 700 nm.

En una realización preferente de la invención los medios de detección comprenden uno o más haces de fibra óptica.

En una realización preferente de la invención, al menos, un elemento de cierre comprende un mecanismo de obturación de la luz incidente sobre la muestra.

En una realización preferente de la invención, al menos, un medio de análisis espectral es un espectrorradiómetro.

En una realización preferente de la invención el medio de análisis espectral está conectado a un ordenador programado con uno o más algoritmos de procesado de las medidas tomadas por los medios de detección y analizadas por dicho medio de análisis.

En una realización preferente de la invención, el medio de sujeción del dispositivo comprende, adicionalmente, un alineador del dispositivo con la fuente de iluminación utilizada.

En una realización preferente de la invención las muestras bajo estudio son hojas vegetales.

Otro objeto de la presente invención es un método de medición de la reflectividad, la transmisividad y la radiación de emisión de fluorescencia de una muestra bajo estudio, que comprende el uso del dispositivo descrito en el presente documento.

En una realización de la invención, el método de medición de la reflectividad, la transmisividad y la radiación de emisión de fluorescencia se aplica a una hoja vegetal.

En una realización de la invención, el método de medición de la reflectividad, la transmisividad y/o la radiación de emisión de fluorescencia de una muestra bajo estudio que comprende, al menos, los siguientes pasos:

a) Reducción de ruido mediante la aplicación de un factor de corrección a las medidas de la luz incidente sobre la muestra, sin colocar ninguna muestra en el dispositivo, pudiendo dicho factor ser bien aplicado de forma independiente a cada longitud de onda, o bien aplicado de forma global a todas las longitudes de onda.

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b) Control de calidad, mediante la división entre sí de cada par de medidas realizadas con y sin el uso de filtro óptico, respectivamente, estimando la función de transmisión del filtro por longitud de onda, esto es, cuánta luz deja pasar en cada longitud de onda relativa a la luz incidente, y verificando que dicha transmisión se mantiene constante a lo largo de las medidas realizadas sobre la muestra bajo estudio, o dentro de un margen de error predeterminado.

c) Procesado de los datos, mediante el cálculo de la reflectividad, la transmisividad y/o la curva de emisión de la muestra bajo estudio.

Finalmente, cabe citar, de forma resumida, las principales ventajas aportadas por el dispositivo de la invención:

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Posibilidad de medir en condiciones naturales: iluminación natural, sin destrucción de muestras.

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Medida conjunta de reflectividad, transmisividad y fluorescencia.

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Medida de la emisión de fluorescencia por el reverso de la hoja.

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Medida de la reflectividad y transmisividad reales (sin contribución de fluorescencia).

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Medida del espectro completo de emisión de fluorescencia.

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Facilidad y comodidad de uso que permite realizar mayor número de medidas y alcanzar muestras que con otros sistemas no se puede.

Si bien la mayoría de las realizaciones de la invención descritas en el presente documento están orientadas al estudio de muestras vegetales, preferentemente hojas, las aplicaciones del presente dispositivo son directamente trasladables a otros campos de la técnica para el estudio de las propiedades ópticas de muestras delgadas, tales como el control de superficies de materiales, análisis de tejidos y/o piel o, en general, para el análisis de las propiedades ópticas de emisión, transmisión y reflexión de superficies delgadas, preferentemente con grosores iguales o inferiores a 3 mm.

Otras características y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción que sigue, así como de las figuras que acompañan al presente documento.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una vista externa en perspectiva del dispositivo de la invención, mostrando sus principales elementos.

La Figura 2 muestra una vista de perfil de una sección del dispositivo de la invención, donde se muestra su estructura interna.

La Figura 3 muestra los resultados obtenidos en la medida de la radiancia de fluorescencia ascendente y descendente en una muestra vegetal que presenta niveles medios de fluorescencia, en función de la longitud de onda, mediante el dispositivo de la presente invención.

La Figura 4 muestra los resultados obtenidos en la medida de la radiancia de fluorescencia ascendente y descendente en una muestra vegetal que presenta niveles bajos de fluorescencia, en función de la longitud de onda, mediante el dispositivo de la presente invención.

La Figura 5 muestra los resultados obtenidos en la medida de la reflectividad y del valor de 1 menos la transmisividad, en función de la longitud de onda correspondiente a la zona de emisión de fluorescencia de una muestra vegetal, mediante el dispositivo de la presente invención.

La Figura 6 muestra los resultados obtenidos en la medida de la reflectividad real y del valor de 1 menos la transmisividad real en una muestra vegetal, mediante el dispositivo de la presente invención.

La Figura 7 muestra una medida de la reflectividad para tres muestras diferentes en función de la longitud de onda, mediante el dispositivo de la presente invención.

La Figura 8 muestra una medida de la fluorescencia en las mismas tres muestras empleadas para la obtención de los datos mostrados en la Figura 7, en función de la longitud de onda, mediante el dispositivo de la presente invención.DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal y como se representa en las Figuras 1 y 2 de este documento, la presente invención se refiere a un dispositivo para medir la reflectividad, la transmisividad y/o la fluorescencia de una muestra bajo estudio que comprende, al menos, los siguientes elementos (A-D):

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A) un medio de sujeción (1) de la muestra. Dicho medio aporta una doble función al dispositivo de la invención: por una parte, permite aislar la muestra estudiada de su entorno, conformando un espacio idóneo para la

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toma de medidas, pero sin necesidad de alejarla de su lugar natural (en una realización de la invención en la que las muestras son hojas vegetales, el medio de sujeción (1) facilita el estudio de dichas hojas sin tener que cortarlas). Por otra parte, el medio de sujeción (1) permite sostener las muestras con la suficiente estabilidad como para garantizar unas condiciones apropiadas para la toma de medidas, evitando vibraciones o movimientos del dispositivo que puedan dar lugar a ruido en los datos obtenidos.

El medio de sujeción (1) está formado por, al menos, dos elementos de cierre (2, 3) que, al cerrarse sobre la muestra bajo estudio, conforman una cámara oscura para alojar dicha muestra. En una realización preferente de la invención, los elementos de cierre (2, 3) están configurados como un sistema de pinza que, mediante la presión ejercida por el usuario, se abren dejando un espacio suficiente para la introducción de la muestra, y que, al cesar la presión ejercida, se cierran con una fuerza suficiente como para mantener la muestra en una posición fija durante la toma de las medidas sin deteriorarla. Los elementos de cierre (2, 3) comprenden, asimismo, sendas semi-cámaras (4, 5) internas (ver Figura 2) a través de las cuales puede propagarse, transmitirse y/o reflejarse la luz incidente sobre una muestra dada, así como propagarse la luz emitida por dicha muestra mediante fluorescencia y que, al cerrarse dichas semi-cámaras (4, 5), forman la cámara oscura. Al ejercer una presión por parte del usuario sobre los elementos de cierre (2, 3), la cámara oscura conformada por las dos semi-cámaras (4, 5) se abre, permitiendo la extracción de la muestra tras la toma de medidas. El mecanismo de pinza de los elementos de cierre (2, 3) se realiza, preferentemente, mediante una goma elástica o un resorte conectado a dichos elementos. En caso de necesitarse aplicar el dispositivo a una superficie no abarcable por la pinza, es también posible desmontar los elementos de cierre (2, 3) y aplicarlos por separado a la muestra bajo estudio.

Adicionalmente, con el objetivo de proporcionar una entrada de la luz incidente (ya sea utilizando una fuente de luz natural o artificial) en el interior de la cámara oscura para iluminar la muestra estudiada, al menos uno de los elementos de cierre (2) comprende una abertura de entrada (6) de luz. En una realización preferente de la invención, con el objetivo de evitar que la luz reflejada en la abertura de entrada (6) contribuya a la luz detectada durante la toma de medidas, dicha abertura (6) posee una superficie interior rugosa o roscada.

Los elementos de cierre (2, 3) disponen, asimismo, de aberturas de salida (7, 8) practicadas sustancialmente en sus zonas superior e inferior, respectivamente, con respecto al plano definido por la muestra a medir, para proporcionar una salida de la luz emitida, reflejada y/o transmitida dentro de la cámara oscura y, por tanto, canalizando dicha luz para su posterior detección.

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B) Un medio de detección (9) de la radiación reflejada y de la fluorescencia ascendente de la muestra, conectable a uno de los elementos de cierre (2) del medio de sujeción (1) (en las Figuras 1-2, el elemento de cierre

(2) superior). Dicho medio de detección (9) comprende, preferentemente, un haz de fibra óptica acoplable a una de las aberturas de salida (7) practicadas en los elementos de cierre (2, 3). El haz de fibra óptica permite recibir la luz reflejada y emitida por la región superior de la muestra bajo estudio, y canalizarla para su posterior análisis.

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C) Un medio de detección (10) de la radiación transmitida y de la fluorescencia descendente de la muestra, conectable a uno de los elementos de cierre (3) del medio de sujeción (1) (en las Figuras 1-2, el elemento de cierre

(3) inferior). Dicho medio de detección (10) comprende, preferentemente, un haz de fibra óptica acoplable a una de las aberturas de salida (8) practicadas en los elementos de cierre (2, 3). El haz de fibra óptica permite recibir la luz transmitida y emitida por la región inferior de la muestra bajo estudio, y canalizarla para su posterior análisis.

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D) Al menos, un medio de análisis espectral (11) conectable a, al menos, uno los medios de detección (9, 10). Dicho medio de análisis espectral es, preferentemente, un espectrorradiómetro conectado a un haz de fibra óptica, o cualquier dispositivo análogo seleccionado entre los habitualmente utilizados en el estado de la técnica, tales como espectrofotómetros, fotómetros de filtros, o cámaras CCD o CMOS equipadas con filtros espectrales (ruedas de filtros, filtros acusto-ópticos), así como cámaras convencionales. En una realización de la invención, la posibilidad de conectar simultáneamente un medio de análisis espectral (11) a cada uno de los medios de detección (9, 10) permite la medición de todos los parámetros deseados (reflectividad, transmisividad y fluorescencia) en una única operación, sin necesidad de modificar el estado de la muestra estudiada, lo que proporciona medidas más precisas y optimiza los tiempos de operación en cada medida. Adicionalmente, en una realización preferente de la invención, en caso de utilizar un único medio de análisis espectral (11) equipado con una única conexión para un haz de fibra óptica, es posible tomar una primera medida de la reflectividad y la fluorescencia ascendente conectando el medio de análisis (11) a uno de los elementos de cierre (2) a través de la conexión del haz de fibra óptica y, tras desconectar dicho medio de análisis (11) y conectarlo al otro elemento de cierre (3), realizar una segunda medida de la transmisividad y de la fluorescencia descendente. Si bien esta realización consume una mayor cantidad de tiempo que las realizaciones en las que se dispone de más de una conexión a uno o varios medios de detección (11), las medidas obtenidas siguen proporcionando gran precisión, dado que también mantienen inalterada la muestra de estudio.

En una realización preferente de la invención, la abertura de entrada (6) de luz del medio de sujeción (1) está equipada con un portafiltros (12) que permite, sin alterar la muestra de estudio, aplicar uno o más filtros ópticos al haz de luz incidente sobre la muestra. Dicho haz puede provenir tanto de una fuente natural como artificial. En las

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realizaciones de la invención en las que el dispositivo se emplea para el estudio de hojas vegetales y de la fluorescencia emitida por la clorofila que contienen dichas hojas, el portafiltros (12) comprende, preferentemente, al menos un filtro óptico pasa-baja de longitud de onda de corte en 650 nm y un filtro óptico pasa-baja de longitud de onda de corte en 700 nm, lo que permite estudiar las regiones del espectro próximas a los picos de emisión de fluorescencia características de las hojas vegetales, localizados alrededor de los 690 nm y los 740 nm, facilitando, así, el estudio de cada región de emisión individualmente. El motivo fundamental de utilizar los dos filtros es porque existe un solape de absorción y emisión en la región entre 640 y 700 nm, correspondiente al primer pico de emisión de 690 nm. La luz absorbida en dicha región es reemitida en el segundo pico de emisión (740 nm), por lo que, para poder medir el primer pico de emisión es necesario bloquear dicha luz (mediante el filtro de 650 nm), y por tanto, la magnitud de emisión correspondiente al segundo pico se ve reducida. De forma correspondiente, mediante el uso del filtro de 700 nm, a la clorofila le llega la totalidad de la luz que puede absorber, por lo que la magnitud correspondiente al segundo pico poseerá un valor correcto, siendo entonces el primer pico el que se verá enmascarado por la luz reflejada (que no estaría bloqueada en este caso). El interés de medir independientemente cada uno de los dos picos de emisión se deriva de que cada uno de ellos corresponde a un proceso diferenciado de fotosíntesis, por los que medir ambos proporciona una mayor información que sólo uno de ellos.

Adicionalmente a la aplicación de filtros ópticos, es posible también disponer de un medio de cierre del portafiltros, de forma que la muestra bajo estudio no reciba ninguna fuente de iluminación. Dicho medio de cierre del portafiltros resulta ventajoso en aquellos casos en los que se desea preservar la muestra de la luz incidente con el objetivo de estudiar su respuesta en condiciones de adaptación a la oscuridad (en el caso de una muestra vegetal, este estado corresponde al cierre de los centros de reacción fotosintética). Preferentemente, el medio de cierre es un disco opaco que se sitúa sobre los filtros ópticos.

En una realización preferente de la presente invención, las aberturas de salida (7, 8) de los elementos de cierre (2, 3) están equipadas con mecanismos de obturación (13) para impedir que llegue luz externa a la muestra cuando alguno de los medios de detección (9, 10) se encuentra desconectado. Igualmente, la abertura de entrada

(6) de luz de uno de los elementos de cierre (2) puede estar también equipada con un mecanismo de obturación (13), para regular el paso de la luz incidente sobre la muestra.

En una realización preferente de la invención, el medio de sujeción (1) comprende, adicionalmente, al menos un alineador (14) (concebido como un sistema de apuntamiento hacia la fuente de iluminación, mediante un colimador y una diana con una marca central) destinado a posicionar adecuadamente el dispositivo para obtener una iluminación óptima de las muestras estudiadas. La línea recta definida por el agujero del colimador y la marca central de la diana está alineada con la pendiente de inclinación que presenta la abertura de entrada (6), de forma que, al penetrar la luz emitida por la fuente de iluminación a través del colimador y proyectarse reflejada sobre la superficie de la diana, permite obtener un alineamiento óptimo del dispositivo, cuando el haz de luz proyectado sobre la diana coincide con la marca central de la misma.

En una realización preferente de la invención, el medio de análisis espectral (11) está conectado a un ordenador programado con uno o más algoritmos que implementan un método de obtención y proceso de las medidas tomadas por los medios de detección (9, 10) y analizadas por dicho medio de análisis (11). Dicho método de proceso es también un objeto de la presente invención, y utiliza como parámetros de entrada las medidas de una fuente de luz incidente de referencia blanca empleada con el con y sin el uso de filtros, de la luz reflejada por la muestra con y sin filtros, de la luz transmitida a través de la muestra con y sin filtros y, opcionalmente, de la curva de transmisividad de el/los filtro/s medida en laboratorio.

En una realización preferente, el método de proceso de las medidas tomadas por los medios de detección comprende, al menos, los siguientes pasos:

a) Reducción de ruido: El primer paso a realizar consiste en la aplicación de un factor de corrección a las medidas de la luz incidente de referencia blanca sin colocar ninguna muestra en el dispositivo, con el objetivo de normalizar las medidas posteriores, dado que ningún material es reflectivo al 100%. Este factor de corrección puede ser bien aplicado de forma independiente a cada longitud de onda, o bien aplicado de forma global a todas ellas (esta última opción resulta adecuada para algunos materiales tales como el Spectralon® o Spectraflec® tienen una respuesta espectral casi constante en el rango de longitudes de onda de interés). La no aplicación de este factor de corrección puede suponer un error del 5% en la medida final.

Adicionalmente, algunos espectrómetros presentan un ruido en su señal de tipo "rizado" o "diente de sierra". En este caso, resulta necesario aplicar un filtro de reducción de ruido (por ejemplo, un filtro pasa-baja) ya que pequeños errores en la señal pueden introducir grandes errores en la estimación de la curva de emisión de fluorescencia.

b) Control de calidad: Este paso comprende dividir entre sí cada par de medidas realizadas con y sin filtro, respectivamente, para estimar la función de transmisión del filtro por longitud de onda, esto es, cuánta luz deja pasar en cada longitud de onda relativa a la luz incidente. El valor obtenido sirve para estimar la estabilidad de la iluminación durante todo el proceso de medida, ya que, si las condiciones fueran óptimas, la estimación de la

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transmisividad del filtro debería ser constante en todos los casos, y todos los valores obtenidos deberían coincidir con la transmisividad del filtro medida en laboratorio (con la excepción del rango espectral donde hay emisión de fluorescencia).

Preferentemente, el protocolo de medida comprende la medición de la luz blanca de referencia antes y después de medir las propiedades de la muestra estudiada. En caso de que se disponga de la curva de transmisividad del filtro óptico empleado, el criterio para establecer que las medidas son correctas es la comparación directa, en el rango de longitudes de onda en que no hay emisión de fluorescencia, de la transmisividad del filtro medida con el valor correspondiente en laboratorio. Si dicha comparación proporciona una coincidencia dentro de un margen de error predeterminado, las medidas son aceptadas como buenas, y en caso contrario las medidas son desechadas.

Puede darse también la situación de no contar con la curva de transmisividad del filtro medida en laboratorio, con lo que, en dicho caso, se busca la mayor coincidencia entre las transmisividades estimadas con cada par de medidas con y sin filtro, desechando aquéllas que se diferencien más allá de un margen de error predeterminado con el valor medio de las medidas obtenidas. Asimismo, se comprueba que los niveles de transmisividad estimados estén dentro de unos márgenes aceptables (por ejemplo, la transmisividad estimada no puede ser inferior al 90% en la zona espectral del verde).

c) Procesado de los datos: Una vez se ha comprobado la consistencia del conjunto de medidas, se procede a calcular los parámetros de interés. Para calcular la reflectividad y la transmisividad, es necesario partir de las medidas con y sin la presencia de la muestra, sin emplear ningún filtro, dividiendo la medida con la muestra por la medida de la luz de referencia blanca (sin la muestra), lo que proporciona el valor de la reflectividad y la transmisividad aparentes (incluyendo el efecto de la emisión de fluorescencia). En este paso es también posible realizar un control de calidad adicional, ya que la reflectividad y la transmisividad no pueden en ningún caso sumar más de 1. En caso de darse ese caso, este hecho es indicativo bien de inestabilidad en la iluminación durante las medidas o bien de contaminación lumínica, pudiendo llegar a descartarse los datos en caso de ser inconsistentes.

Respecto al cálculo de la emisión de fluorescencia, es posible, en principio, obtener su valor directamente a partir de las medidas de la muestra tomadas con el empleo de filtro óptico. Sin embargo, en la práctica, resulta conveniente aplicar un cálculo previo a esta medida, dado que los filtros dejan pasar una pequeña porción de la luz iluminante, de forma que se tenga en cuenta la contaminación que dicha luz proporciona a la señal de emisión de fluorescencia, que también es pequeña y de similar orden de magnitud. Este efecto indeseable debe ser compensado adecuadamente y, para ello, es posible estimar previamente la contribución de la contaminación, multiplicando la medida de la luz de referencia blanca filtrada por la reflectividad (o transmisividad, en su caso) aparente, calculada en la forma descrita en el párrafo anterior. Una vez estimada la cantidad de luz contaminante, ésta se sustrae de la medida filtrada de la muestra bajo estudio, obteniendo, así, la emisión de fluorescencia real.

Por último, hay que tener también en cuenta que la emisión de fluorescencia se produce más allá de los límites de corte del filtro óptico empleado, tanto en ondas cortas como largas, por lo que las colas de la función de emisión no pueden ser estimadas. Para poder obtener un resultado suave, que no esté truncado por el efecto del filtro, opcionalmente se puede realizar un ajuste mediante extrapolación numérica en dichas regiones, pudiéndose optar, preferentemente, entre uno de los tipos de ajuste siguientes:

-

un ajuste de tipo spline (basado en interpolación polinomial), independientemente en cada uno de los extremos.

-

un ajuste de los picos a una suma de funciones gaussianas, con el que se obtiene también la curva completa de emisión.

En las realizaciones de la invención en las que las muestras bajo estudio son hojas vegetales, el ajuste basado en funciones gaussianas permite armonizar los resultados obtenidos de las medidas con los dos filtros (650 nm y 700 nm) asociados a los picos de emisión de la clorofila (690 nm y 740 nm, respectivamente). En la medida con el filtro de 650 nm se obtiene una medida de los dos picos, pero sólo el primero (690 nm) proporciona un valor de emisión correcto (según se ha descrito en párrafos anteriores). En la segunda medida con el filtro de 700 nm se obtiene únicamente el segundo pico de emisión (740nm), con un valor de emisión correcto. Como la transición entre ambos picos de emisión es suave en la naturaleza, es posible realizar un ajuste realista como la suma de dos funciones gaussianas centradas en 690nm y 740nm, para el caso correspondiente al uso del filtro de 650 nm; y de una única función gaussiana, en el caso correspondiente al filtro de 700 nm, centrada en 740 nm, a la que se le suma el resultado de la gaussiana centrada en 690 nm obtenida previamente.

Con las curvas de emisión calculadas, es posible estimar la reflectividad (R) y transmisividad (T) reales de la hoja, sustrayendo dicha emisión de las medidas de la radiancia de la hoja (transmitida o reflejada) y dividiendo por la irradiancia (luz incidente). Del mismo modo, la absorbancia se calcula como 1 – (R + T).

A partir de las medidas procesadas, es posible estimar cualesquiera otros parámetros comúnmente utilizados en el estado de la técnica para el estudio de las propiedades de emisión, transmisión y reflexión de las

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muestras estudiadas, pudiendo ser dichos parámetros, por ejemplo, el valor PAR (“Photosynthetically Available Radiation”) incidente, definido como la integral entre 400 nm y 700 nm de la medida de irradiancia; el valor PAR absorbido (o APAR), definido como la integral entre 400 nm y 700 nm de la irradiancia por la absorbancia; la fracción de APAR, equivalente a la integral entre 400 y 700nm de la absorbancia; el rendimiento de fluorescencia (o “fluorescence yield”), definido como la emisión de fluorescencia dividida por APAR (o, en su defecto, por PAR); el valor de la emisión de pico de fluorescencia en 690 nm y 740 nm; el valor integrado de emisión total de fluorescencia; el ratio entre picos en 690 nm y en 740 nm, o el índice reflectivo fotosintético, definido como la reflectividad a 530 nm entre la reflectividad a 570 nm, así como cualquier otro parámetro que se derive de las curvas de reflectividad o transmisividad.

Por último, con relación a los resultados experimentales obtenidos mediante el dispositivo y el método de la presente invención, algunos ejemplos de dichos resultados se muestran en las Figuras 3-6. Concretamente, las Figuras 3 y 4 muestran los resultados obtenidos en la medida de la radiancia de fluorescencia (F) ascendente (Fa) y descendente (Fd), expresada en mw/cm2/nm/sr, en dos muestras vegetales diferentes (una de ellas con niveles medios de fluorescencia, en la Figura 3, y la otra con niveles bajos de fluorescencia, en la Figura 4), en función de la longitud de onda (L), expresada en nm. En ambas figuras se incluye la contribución tanto de las medidas directas (en trazos gruesos, en las curvas con subíndice 1 de las figuras), como de las medidas obtenidas después de eliminar la contribución residual del filtro empleado (en trazos finos, en las curvas con subíndice 2 de las figuras).

La Figura 5 muestra los resultados obtenidos en la medida de la reflectividad (R) y del valor de 1 menos la transmisividad (T), en función de la longitud de onda (L) correspondiente a la zona de emisión de fluorescencia de una muestra vegetal. La curvas sólidas corresponden a la reflectividad y la transmisividad aparentes (Ra y Ta, respectivamente), obtenidas al dividir la radiancia (que está compuesta por luz reflejada y luz emitida) por la irradiancia. Las curvas discontinuas corresponden a la reflectividad y la transmisividad reales (Rr y Tr, respectivamente), obtenidas tras haber sustraído la contribución de la emisión de fluorescencia a la radiancia medida.

La Figura 6 muestra los resultados obtenidos en la medida de la reflectividad real (Rr) y del valor de 1 menos la transmisividad real (Tr) en una muestra vegetal, para una región de longitudes de onda comprendida entre 350 nm y 2500 nm donde, en la curva superior (en trazo claro) se representa el valor de Tr y en la curva inferior (en trazo oscuro) se representa el valor de Rr, en función de la longitud de onda (L), expresada en nm.

La Figura 7 muestra una medida de la reflectividad (R), expresada en tanto por ciento, para tres muestras diferentes en función de la longitud de onda (L), expresada en nm. Las tres muestras empleadas son una hoja vegetal senescente (Hs), una hoja vegetal verde (Hv) y una tela de origen vegetal tintada en verde (Tv).

La Figura 8 muestra una medida de la fluorescencia, expresada en unidades correspondientes a las cuentas digitales normalizadas del sensor, en las mismas tres muestras empleadas para la obtención de los datos mostrados en la Figura 7, en función de la longitud de onda (L), expresada en nm.

Una vez descrita la presente invención y algunas de sus realizaciones preferentes, cabe resaltar, finalmente, que si bien algunas de dichas realizaciones están directamente orientadas al estudio de muestras vegetales y de la fluorescencia emitida por la clorofila, dichas realizaciones no han de ser consideradas como limitativas frente a variaciones de su diseño o en la combinación de los elementos que integran el dispositivo, así como para su aplicación al estudio de cualquier tipo de muestras delgadas con propiedades de fluorescencia, siempre que dichas variaciones no alteren la esencia de la invención, así como el objeto de la misma.

DESCRIPCIÓN DE LOS ELEMENTOS DE LAS FIGURAS

Elemento

Descripción

1

Medio de sujeción

2

Elemento de cierre

3

Elemento de cierre

4

Semi-cámara

5

Semi-cámara

6

Abertura de entrada de luz incidente

7

Abertura de salida de luz

8

Abertura de salida de luz

9

Medio de detección de la radiación reflejada y de la fluorescencia ascendente

10

Medio de detección de la radiación transmitida y de la fluorescencia descendente

11

Medio de análisis espectral

12

Portafiltros

13

Mecanismo de obturación

14

Alineador

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Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Dispositivo para medir la reflectividad, la transmisividad y/o la fluorescencia de una muestra bajo estudio en presencia de una fuente de luz incidente, que comprende un medio de sujeción (1) de la muestra formado por, al menos, dos elementos de cierre (2, 3) que, al cerrarse, conforman una cámara oscura para alojar dicha muestra, y caracterizado dicho dispositivo porque:

   -

   al menos, uno de los elementos de cierre (2) comprende una abertura de entrada (6) de la luz incidente;

   -

   al menos, uno de los medios de cierre (2) comprende una abertura de salida de luz (7) para canalizar la luz reflejada y emitida por la región superior de la muestra bajo estudio, siendo dicha abertura de salida (7) conectable a, al menos, un medio de detección (9) de la radiación reflejada y de la fluorescencia ascendente de la muestra;

   -

   al menos, uno de los elementos de cierre (3) comprende una abertura de salida de luz (8) para canalizar la luz transmitida y emitida por la región inferior de la muestra bajo estudio, siendo dicha abertura de salida (8) conectable a, al menos, un medio de detección (10) de la radiación transmitida y de la fluorescencia descendente de la muestra.

2. 2.- Dispositivo según la reivindicación 1, que comprende un medio de análisis espectral (11) conectable a, al menos, uno de los medios de detección (9, 10).
3. 3.- Dispositivo según la reivindicación 2, donde el medio de análisis espectral (11) comprende un espectrorradiómetro.
4. 4.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, donde el medio de análisis espectral (11) está conectado a un ordenador programado con uno o más algoritmos de procesado de las medidas tomadas por, al menos, uno de los medios de detección (9, 10) y analizadas por dicho medio de análisis (11).
5. 5.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde los elementos de cierre (2, 3) comprenden sendas semi-cámaras (4, 5) internas que, al cerrarse dichos elementos de cierre (2, 3), conforman la cámara oscura para alojar la muestra bajo estudio.
6. 6.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la abertura de entrada (6) de luz del medio de sujeción (1) comprende, al menos, un portafiltros (12) capaz de alojar uno o más filtros ópticos de la luz incidente sobre la muestra.
7. 7.- Dispositivo según la reivindicación 6, donde el portafiltros está equipado con, al menos, un filtro óptico pasa-baja de longitud de onda de corte en 650 nm y un filtro óptico pasa-baja de longitud de onda de corte en 700 nm.
8. 8.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde, al menos, uno de los medios de detección (9, 10) comprende un haz de fibra óptica.
9. 9.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde, al menos, uno de los elementos de cierre (2, 3) comprende un mecanismo de obturación (13) de la luz incidente.
10. 10.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el medio de sujeción (1) comprende un alineador (14) del dispositivo con la fuente de iluminación utilizada.
11. 11.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la muestra bajo estudio comprende un grosor igual o inferior a 3 mm.
12. 12.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la muestra bajo estudio es una hoja vegetal.
13. 13.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la fuente de luz incidente sobre la muestra es luz solar.
14. 14.- Método de medición de la reflectividad, la transmisividad y/o la emisión de fluorescencia de una muestra bajo estudio que comprende el uso de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. 15.- Método según la reivindicación 14, donde la muestra bajo estudio comprende un grosor igual o inferior a 3 mm.
16. 16.- Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-15, donde la muestra bajo estudio es una hoja vegetal.

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17. 17.- Método de medición de la reflectividad, la transmisividad y/o la radiación de emisión de una muestra bajo estudio que comprende el uso de un dispositivo según la reivindicación 6 que comprende, al menos, los siguientes pasos:

    a) Reducción de ruido mediante la aplicación de un factor de corrección a las medidas de la luz incidente 5 sobre la muestra sin colocar ninguna muestra en el dispositivo, pudiendo dicho factor ser bien aplicado de forma independiente a cada longitud de onda, o bien aplicado de forma global a todas las longitudes de onda.

    b) Control de calidad, mediante la división entre sí de cada par de medidas realizadas con y sin el uso de filtro óptico, respectivamente, estimando la función de transmisión del filtro por longitud de onda, y verificando que dicha transmisión se mantiene constante a lo largo de las medidas realizadas sobre la muestra bajo estudio, o

    10 dentro de un margen de error predeterminado. c) Procesado de los datos, mediante el cálculo de la reflectividad, la transmisividad y/o la curva de emisión de la muestra bajo estudio.
18. 18.- Dispositivo según la reivindicación 4, donde al menos uno de los algoritmos programados en el 15 ordenador comprenden un método de medición de la reflectividad, la transmisividad y/o la fluorescencia de una muestra bajo estudio, según la reivindicación 17.

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    FIG. 1

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    FIG. 2

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    FIG. 3

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    FIG. 4

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    FIG. 5

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    FIG. 6

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    FIG. 7

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    FIG. 8