发明内容
本发明人在这方面进行了深入的探索,并取得了诸多喜人的结果。
在本发明人先前的试验中,已经表明,芍药与冰片、麝香的组合可以明显增强冰片和麝香固有的药理作用,比如抗脑缺血再灌注损伤作用、抗炎性反应作用等。并且三者的组合还降低了冰片的毒性,这对于进一步促进冰片的广泛应用具有现实意义。
同时,当在上述芍药与冰片、麝香组合中加入具有血管活性的灯盏花时,可以具备更为全面的治疗效果。
于是,我们进一步进行了芍药、冰片、麝香与其他血管活性药物组合的试验研究,结果发现,组合物同样具备更好的效果。
因此,本发明的目的在于提供具有协同增效和/或减毒作用的“冰片+麝香+芍药+组分d”组合,用于治疗和/或预防心脑血管、老年痴呆症、脑细胞保护、糖尿病等疾病。
在本发明药物组合物中,可以选择芍药、麝香、冰片药味直接粉碎成粉入药,也可以相当于上述天然药物材生药量的提取物或其他形式入药。因此,本发明药物组合物的活性组分包括药材原粉、脂或水溶性提取物(或有效部位)、或有效成分、或单体,或者采用现有技术中已有的其他制品形式。例如,所述活性组分包括:
a.冰片:是指龙脑香树脂的加工品或菊科植物艾纳香叶提取的结晶,或以樟脑、松节油等为原料,经化学方法合成的精制品。包括龙脑冰片(右旋龙脑)、艾片(左旋龙脑)、合成冰片(含有龙脑及异龙脑)。
b.麝香:是指天然或人工麝香,或含有麝香酮、雄甾酮、和/或麝香-1等糖蛋白、胆固醇等的麝香提取物,或麝香酮单体。
c.芍药:是指芍药(白芍、赤芍、川赤芍)的干燥根粉末,含有芍药总苷类化合物(优选为芍药苷和芍药内酯苷)的提取物,或芍药苷单体。另外,研究表明,同时含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、丹皮酚、丹皮酚原苷、丹皮酚苷、芍药苷元等的有效部位也是有益的。本领域技术人员可以理解的是,本发明芍药苷类的来源并不局限于芍药,含有芍药苷类的其他植物(例如牡丹皮)也可实现本发明,其提取和制备方法为已知技术,在此不作赘述。
在上述组合中,冰片的含量不低于1wt%。
所述活性组分d选自以下d1-d6中的一种:
d1.丹参:是指主要含有丹酚酸*和/或丹参酮*的丹参提取物;或丹参水溶性提取物,主要含有以丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素为代表的酚酸类成分(总酚酸含量40%、优选60%以上),或丹参酚酸单体或其药用盐(例如镁盐),或丹参酚酸单体的混合物;或丹参脂溶性提取物,主要含有丹参酮(丹参酮含量50%、优选80%以上,例如丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮I等),或丹参酮单体或其药用盐(例如磺酸钠盐),或丹参酮单体的混合物;或
d2.银杏:是指银杏提取物(例如低级醇、丙酮、乙酸乙酯的银杏叶提取物),主要含有银杏内酯*和/或银杏黄酮*作为活性成分的银杏提取物(例如标准提取物Egb),或银杏黄酮单体和银杏内酯单体,或银杏内酯单体,或银杏黄酮单体。其中,所述银杏内酯是指含有各种银杏萜类内酯物质(二萜内酯A、B、C、M、J,倍半内酯等)的混合物;“银杏内酯单体”是指上述萜类内酯中各种内酯类物质的单体和/或其衍生物、或其化学修饰物、类似物。所述银杏黄酮是指含有各种银杏黄酮物质(银杏黄酮及其苷、总黄酮醇及其苷、双黄酮、儿茶素等)的混合物;“银杏黄酮单体”是指上述黄酮中各种黄酮类物质的单体和/或其衍生物、或其化学修饰物、类似物;或
d3.红花:是指含有红花总黄色素(例如红花黄色素A*、B,含量50%以上)的红花提取物,(羟基)红花黄色素单体,或者这些单体的混合物;或
d4.葛根:是指含有大豆黄酮、大豆黄酮苷、葛根素*、二葡萄糖大豆苷、甲氧基葛根素、7-木糖-葛根素、二乙酰基-葛根素、芒柄花素等多种异黄酮类的葛根提取物,或葛根总黄酮,或葛根素单体及其衍生物,或大豆黄酮、或大豆异黄酮单体,或者这些单体的混合物;或
d5.川芎:是指含有川芎嗪*、川芎酚、阿魏酸*、挥发油等的川芎提取物,或川芎嗪单体或者川芎嗪衍生物(例如盐酸川芎嗪),或阿魏酸/钠及其衍生物(例如阿魏酸川芎嗪),或者这些单体的混合物;或
d6.人参:是指主要含有人参总皂苷*的人参提取物,或人参皂苷单体;含有人参皂苷的其他植物(例如三七等)也可实现本发明。
从表面上看,上述组分d1-d6似乎是不同的,但是从化学构成上来分析,这些植物中已知的主要药理活性成分可归类为具有“活血化瘀”作用的两大类成分:黄酮、酚酸。从现代医学理论的角度而言,上述植物中的黄酮类成分基本都具有扩张血管、改善组织缺血、抗氧化、改善血液流变学等药理功效;而酚酸类则具有更多样性的作用,如抗炎性反应、内皮细胞保护等药理功效。例如,以葛根素、丹参、银杏叶、三七皂苷、川芎嗪、或红花入药而得的成药,在临床上也均以冠心病、脑卒中、糖尿病和/或老年痴呆为主要适应症。这充分证明,这些植物提取物在药理功效和主要活性成分的化学构成上具高度的“相似性”,这已为本领域技术人员所熟知。同样地,获得上述提取物或单体也属于常规技术。
当我们试图从现有技术中探寻这种“冰片+麝香+芍药+组分d”为基础的药物结合的依据时,我们发现迄今为止的已有技术没有提供科学依据,甚至于没有类似的暗示。
在本发明药物组合物中,各组分的含量为:
组分a,1-15、优选2-10、更优选5-10重量份;和
组分b,5-65、优选10-50、更优选15-45重量份;和
组分c,以芍药苷计,为5-100、优选10-80、更优选20-60重量份;和
组分d,以标有符号*的成分计,为5-100、优选10-80、更优选20-60重量份。
另外,在上下文中,“芍药苷+麝香酮+冰片+丹参素5∶2∶3∶1”,表示这四种活性组分的重量配比为5∶2∶3∶1。
下面的试验将证实:按照本发明描述的具有上述定义之“冰片”、麝香、“芍药”与组分d的组合,具有本发明所述的有益效果。鉴于现有技术中业已存在着相当成熟且有效的制备/提纯上述定义组分的技术,在此不作重点描述。例如,可以采用现代提取和分离技术,以提高活性物质的纯度、尽量除去不需要的杂质,例如:中国专利申请ZL200410096958、ZL200410041752、ZL011103787、ZL021109737、ZL021332983、ZL031131263、ZL02156681X、ZL011301309、ZL2004100413049、ZL00120986、ZL2003101134541、ZL021179239、ZL02149694、ZL92108623、ZL00113019、ZL02153750X、ZL03117754、ZL03141616、JP2000247890A、GB2317613A、中药材2000年23(6):316-6、延边医学院学报1995年18卷(1):73-78)等。
可针对上述组分的理化特性和体内吸收特点,采用标准制剂技术,加入药用辅料制成适宜口服或非肠道给药剂型,类似技术也已相当成熟有效,例如:口崩片(ZL2003101133322、ZL200310123852、ZL03102405、ZL200410016510、ZL200410041256)、缓控制剂(ZL011333332、ZL011387106、ZL02116223、ZL200310110709、ZL01117620、ZL02109758、ZL02116795、ZL02129313、ZL02134118、ZL03100021、ZL03133897)、环糊精包合物(ZL01141436、ZL02108778、ZL200310125175、中国药学杂志2002年37卷(9):673-75)、固体分散物(ZL001194313)、注射剂(ZL001215329、ZL031399428、ZL031573150、ZL2003101241702、ZL021337241、ZL95104038、ZL97101107、ZL02155001、ZL021332983、ZL031279953、ZL03141614、ZL03113037、ZL2003101210259、ZL200410013845)、粉针(ZL200410037717、ZL031323820、ZL021446008、ZL200410002103、ZL03131959.9、ZL200410013937、ZL2003101210259、ZL200410000912)、滴丸(ZL200310107292、ZL03136485、ZL01133515、ZL03135325、ZL200310119222)、分散片(ZL03125462、ZL03112974、ZL02153445)、微或纳米制剂(ZL021378630、ZL00119579)、含磷脂制剂(ZL001278126、ZL031320627、ZL01139971、ZL03128337、中国中药杂志2005年30卷4期:260-263)。
本发明药物组合物,由10-90wt.%的活性组分和90-10wt.%的药用辅料组成,可用于治疗昏迷、高热、心脑血管疾病、老年痴呆症、脑细胞保护,以及用于治疗和预防糖尿病及其并发症、预防心脑血管疾病的复发。上述药物组合物克服了已有药物存在的作用单一、服药量大等缺点,代表了天然药物治疗和预防上述疾病的新趋势。
药理药效学试验研究
一.基础研究
1.协同抗炎作用
1.1对急性渗出性炎症(二甲苯所致小鼠耳肿胀)的影响
1.1.1材料
本发明药物组合A(芍药提取物+麝香+冰片+丹参提取物5∶1∶1∶2),分为15、30、50mg/kg组;
本发明药物组合B(芍药苷+麝香酮+冰片+丹参素5∶2∶3∶1),分为10、15、30mg/kg组;
本发明药物组合C(芍药提取物+麝香+冰片+银杏提取物2∶5∶3∶10),分为15、30、50mg/kg组;
本发明药物组合D(芍药苷+麝香+冰片+银杏黄酮3∶1∶8∶2),分为10、20、40mg/kg组;
空白对照组:生理盐水;
阳性对照药:相当于同样用药量的芍药提取物;10%麝香组;芍药提取物+麝香5∶1,30mg/kg组;阿司匹林0.2g/kg组;丹参素2mg/kg组;银杏黄酮组20mg/kg。
1.1.2方法与结果
ICR小鼠,体重21-23g,按体重随机均分组,每组10只,连续灌胃给药4天(0.4ml/20g),空白对照组给相同体积的蒸馏水。于末次给药1h后,将60μl二甲苯均匀涂于每鼠右耳两面,40min后将小鼠颈椎脱臼处死,用直径8mm巩膜穿孔器取下左右耳片称重,求出两耳重量差、计算肿胀率,t检验比较组间差异,结果见表1。
表1对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(X±SD,n=10)
注:肿胀率=[(右耳重-左耳重)/左耳重]×100%;
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;
与芍药组比较△P<0.05,△△P<0.01;与麝香组比较,#P<0.05。
与丹参素或银杏黄酮比较^P<0.01
1.2对二甲苯致小鼠皮肤毛细血管通透性的影响
1.2.1材料
本发明药物组合物A(芍药提取物+麝香+冰片+60%(红花黄色素)红花提取物12∶2∶3∶20),分为10、20、40mg/kg组;
本发明药物组合物B(芍药提取物+麝香+冰片+60%(葛根素)葛根提取物2∶2∶3∶12),分为10、30、50mg/kg组
阳性对照药:相当于同样药量的芍药提取物;10%麝香组;芍药提取物+冰片10∶1,30mg/kg组;阿司匹林0.2g/kg组;60%(红花黄色素)红花提取物组15mg/kg;60%(葛根素)葛根提取物15mg/kg。
1.2.2方法与结果
参照《中药药理研究方法学》制作动物炎症模型,结果见下表2:
表2对二甲苯所致小鼠皮肤毛细血管通透性的影响(X±SD,n=10)
与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与芍药提取物比较,△P<0.05,△△P<0.01;
与麝香比较,#P<0.05,##P<0.01。
与红花提取物或葛根提取物比较^P<0.01
结果表明:本发明组合物对二甲苯所致小鼠耳肿胀和对二甲苯所致小鼠皮肤毛细血管通透性有明显的抑制作用,具有抑制炎症早期毛细血管通透性增高的作用,与对照组相比具有显著性差异,与同等剂量的单组分提取物组相比,也具有统计学差异(P<0.01),高中剂量组与空白对照组比较P<0.05-0.01,同时也做了其他抗炎实验,结果表明,本发明组合物在抑制蛋清所致大鼠足跎肿胀中也显示了显著的效果,而且效果明显优于芍药提取物、麝香组和单组分提取物组,提示本发明组合物在其单用各自具有抗炎作用的基础上,一定比例的配伍合用更可以促进芍药/冰片/麝香或其他单味药的抗炎作用,起到协同抗炎的作用。
2提高药物活性成分在体内的吸收
2.1材料
本发明药物组合物:芍药苷+麝香酮+冰片+葛根素6∶4∶3∶1;
空白对照组:生理盐水;
阳性对照药:相当于同样用药量的单组分的芍药苷、麝香酮、冰片以及葛根素。
2.2方法与结果
将大鼠分为单用芍药苷、麝香酮组、冰片葛根素组和本发明药物组合物组,给药后(分别以口服和静脉注射两种方式给药)不同时间点,用气相色谱法测定血药浓度,实验表明,麝香酮和冰片能够很快地被吸收,从而提高其血药浓度,口服给药在5-6分钟能够透过血脑屏障进入中枢神经系统,静脉给药可以在2分钟左右透过血脑屏障;同样的方法(气相色谱法),测定芍药苷和葛根素的血药浓度,也证明了麝香酮和冰片能促进药物(芍药苷和葛根素)吸收;同时对三者在1-5∶1-5∶1-5的比例范围内重复上述实验,结果均证实了麝香酮与芍药苷和冰片合用提高药物吸收的作用。
二.心脑血管方面的药理作用
1.对全脑缺血再灌注大鼠脑组织氨基酸类神经递质的影响
1.1材料
本发明药物组合物A(芍药苷+麝香+冰片+川芎嗪1∶2∶3∶6,40mg/kg灌胃);
本发明药物组合物B(芍药苷+麝香+冰片+川芎嗪5∶3∶1∶1,40mg/kg灌胃);
阳性对照药:芍药苷10mg/kg、麝香酮+冰片混悬液12mg/kg、川芎嗪20mg/kg;
1.2方法
造模前每天分两次给药,连续3天,于第4天上午给药30分钟后进行手术。按照标准方法造模,分离双侧颈总动脉,再灌注6h,断头处死,取大脑迅速置于冰盘上取右侧脑自额极至枕叶分为A、B、C、D等分,取C、D脑片称重,按照1ml/50mg加入甲醇匀浆,离心收集上清液,蒸去甲醇,再加入80%乙醇,超声波处理,离心,收集上清液用于检测脑组织氨基酸类神经递质。
中枢神经系统中大部分神经递质是氨基酸类,包括γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly),生理情况下,Glu、Asp对神经元有极强的兴奋作用,GABA、Gly神经元行使作用,为重要的抑制性氨基酸。
分析方法:反相HPLC,峰面积外标法,然后统计学分析。
1.3结果
见下表3。
表3各组全脑缺血再灌注大鼠脑组织氨基酸类神经递质的含量(μmol/g)
与假手术比较,*p<0.05**p<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与麝香+冰片组比较,#P<0.05;与川芎嗪比较^P<0.05
1.4结论
本发明药物组合物各组、芍药苷注射液、麝香酮+冰片注射液和川芎嗪,在大鼠脑组织缺血45分钟,再灌注6小时后(Glu、Asp明显升高),对Asp有一定程度的降低,本发明组合物组最明显;而芍药苷注射液、麝香酮+冰片注射液和川芎嗪对Glu降低不明显,本发明药物组合物两组均可以降低Glu,与对照药组相比具有显著性差异;GABA和Gly的升高也是本发明组合物组最明显,与芍药苷、麝香酮+冰片组和川芎嗪比较,组间具有显著性差异,可能是芍药苷和麝香提取物(麝香酮)以及冰片的作用机制不同而共同带来的有益效果,说明本发明组合物的组合通过降低缺血区脑组织中的Asp,提高了GABA和Gly的含量以对抗兴奋性氨基酸的毒性,从而保护脑缺血后继发神经元的损伤,这些虽然是芳香开窍药(麝香酮和冰片)的药用机理之一,但本发明组合物无疑提高了药效,发挥了协同的作用。
2.对防止血管成形术后再狭窄
血管成形术后再狭窄(RS),属于血瘀证范畴,其发病率高,血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖,是RS的中药病理特征,因此抑制VSMCs异常增殖成为世界性心血管研究预防RS的重要手段。
2.1材料
本发明药物组合物A(芍药苷+麝香+冰片+人参总皂苷3∶2∶6∶2,6、12mg/kg注射);
本发明药物组合物B(芍药苷+麝香+冰片+银杏内酯1∶6∶2∶1,4、8mg/kg注射);
本发明药物组合物C(芍药苷+麝香+冰片+丹参酮10∶1∶2∶1,5、10mg/kg注射);
本发明药物组合物D(芍药苷+麝香+冰片+葛根素1∶2∶1∶10,6、12mg/kg注射);
空白对照组:生理盐水;
阳性对照药:芍药苷注射液、麝香酮注射液、银杏内酯1mg/kg;丹参酮1mg/kg;葛根素6mg/kg;人参总皂苷各8mg/kg;
2.2方法
血管平滑肌细胞分离、培养、鉴定,参照文献(Piper HM编辑,Cell CultureTechinques in Heart and Vessel Research.Springer-Verlag:Germany.1990:280)。
培养贴壁细胞,再换成DMEM(含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)继续培养使细胞生长同步,最后随机加入药物,各浓度用DMEM稀释至10μl/孔。
3H-TdR掺入实验:置换每孔1ml的DMEM,加入luCi的3H-TdR,测定各孔的CPM值。
细胞存活率=贴壁细胞/总细胞数(贴壁细胞+不贴壁细胞)
2.3结果
本实验用细胞计数法分析,各组药物对细胞增殖的影响与对平滑肌细胞3H-TdR掺入基本一致,并且测得细胞存活率没有明显影响,均在90%以上。本发明药物组合物各组、芍药苷注射液和麝香酮注射液对血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖均具有抑制作用,但本发明药物组合物各组最强,与芍药苷和麝香酮比较,组间具有显著性差异,可能是芍药苷和麝香提取物(麝香酮)以及冰片的作用机制不同而共同带来的有益效果。
三.促醒作用
1.材料
小鼠:昆明种,体重19-21g,雌雄各半。
试药:丹参酮+芍药注射液(自制);红花提取物注射液(自制);葛根提取物(自制);麝香酮注射液(自制);安钠咖注射用原料(上海第十四制药厂);本发明组合物A(芍药+麝香+冰片+川芎提取物,重量比2∶1∶1∶5)组;本发明组合物B(芍药+麝香+冰片+人参提取物5∶1∶3∶1)。
2.方法与结果
小鼠随机分组,分别尾静脉注射氯化钠注射液、安钠咖生理盐水溶液、丹参酮+芍药注射液、红花提取物注射液、葛根提取物;麝香酮注射液等试药,每天一次,连续给药2天,于末次给药后15min,腹腔注射戊巴比妥钠生理盐水溶液(3mg/ml)0.3ml/20g,记录小鼠翻正反射消失至恢复的时间,计算各组均值和标准差,进行t检验,结果见表4。
表4对小鼠的促醒作用(X±SD,n=10)
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与红花和葛根提取物△P<0.05,△△P<0.01;与丹参酮+芍药比较:#P<0.05,##P<0.01。
3.结论
与对照组相比,本发明组合物A、B两组、对照药安钠咖组均表现出促醒的作用,而红花和葛根提取物组则无明显粗性作用。与丹参酮+冰片+芍药比较,本组合物两组呈现显著性差异,表明本发明组合物具有良好的促醒药理活性。
四.糖尿病方面的药理作用
1.材料
本发明药物组合物:芍药+麝香+冰片+丹参提取物组(重量比5∶1∶2∶4)
正常对照组:生理盐水;
糖尿病组:生理盐水;
阳性对照药:芍药苷组;芍药+麝香(重量比2∶1)组,80mg/kg灌胃;芍药+麝香+冰片(重量比2∶1∶2)组,80mg/kg灌胃;丹参提取物组;降糖灵片;
2.方法与结果
糖尿病实验模型的建立:二级SD大鼠按照150mg/kg体重尾静脉注射四氧嘧啶液,在四氧嘧啶液作用下,大鼠的胰岛β细胞受到损伤,造成胰岛素发生障碍,3天后尾静脉采血测空腹血糖,血糖值大于11.0mmol/L的为糖尿病大鼠。
每日一次,连续4周,之后,尾静脉采血测空腹血糖(FBG)和血清Ins。
表5对糖尿病大鼠的FBG和血清Ins的影响n=15
与糖尿病组比较:*P<0.05**P<0.01;与芍药苷比较,△P<0.05,△△P<0.01。
上述实验表明,本发明组合物明显降低了四氧嘧啶糖尿病的血糖,并对血清Ins水平影响不明显,这表明芍药、麝香、冰片联合用药及本发明组合物对四氧嘧啶糖尿病大鼠产生了较强的降血糖作用,以本发明组合物作用最强,且降血糖作用不是通过提高胰岛素水平实现的。
五.对高血脂症大鼠的抗氧化作用
1.材料
本发明组合物:芍药+麝香+冰片+银杏提取物1∶2∶3∶5,50mg/kg灌胃;
正常对照组:生理盐水;
高血脂组:生理盐水;
阳性对照药:芍药苷(50mg/kg);VE(50mg/kg);10%冰片;银杏提取物(20mg/kg)。
2.方法与结果
建立高血脂模型,与正常组比较:高脂模型血清和肝脏的LPO明显升高,而SOD活性明显降低。
药物灌胃,处理动物,按照试剂盒说明书操作,测LPO和SOD,结果见表6:
表6对高血脂大鼠血清和肝脏LPO和SOD的影响(nmol/L)n=10
与高血脂组比较:*P<0.05,**P<0.01;与芍药苷比较,△P<0.05,△△P<0.01。
结论
实验表明,本发明组合物的抗氧化活性显著优于单独施用的芍药苷、冰片。
上述结果还证明:麝香经过实验证明具有增强中枢耐缺氧的能力和作用,而且经证实,麝香的增强中枢耐缺氧的能力是对中枢系统的直接作用而非间接影响,因此中医上称其芳香开窍,用麝香既治中风昏迷又治惊痫,但未证明其有明显的抗氧化作用,本申请实验证明其与芍药和冰片合用,抗氧化活性显著优于单用芍药,说明在对高血脂抗氧化方面,三者存在增强协同作用。
本发明组合物的伍用则没有发现毒副作用,没有带来的不良副作用。
另外,还从保护神经细胞、减少脑组织丙二醛(MDA)和NO生成等方面,考察了本发明组合物的抗氧化作用,结果证明本发明组合物对脑组织MDA有明显的抑制作用,降低了脑组织中升高的NO,对神经细胞也显示了保护作用。