CN101762585A - 基于染色技术的细胞形态学镜检装置和方法 - Google Patents

Abstract

一种基于染色技术的细胞形态学镜检装置，包括反应池、测量室、液路单元、以及显微光学系统，其特征在于，液路单元包括细胞样本接口和至少一种试剂接口；液路单元至少与反应池和测量室之一连通；反应池和测量室之间连通；测量室同时位于显微光学系统的内部。一种基于染色技术的细胞形态学镜检方法，其特征在于液路单元将细胞样本和至少一种试剂注入反应池混合在一起；经过一段时间，反应池内的细胞样本被注入测量室；在测量室内部流动的细胞样本被显微光学系统成像。本发明不需要复杂的机械涂片装置，显微光学系统固定，染色后的细胞样本以流水线的方式快速通过显微光学系统，因而可以实现高度自动化、结构紧凑、快速的细胞形态学镜检。

Description

基于染色技术的细胞形态学镜检装置和方法

技术领域

本发明涉及细胞分析领域，尤其是涉及基于染色技术的细胞形态学镜检装置。

背景技术

现有的血液分析仪可以提供丰富的数据，大大提高了临床血液学检验的质量和速度，减轻了检验人员的工作量。然而，它们只能作为血液常规分析过程中的过筛手段，当自动化血球计数仪显示异常结果时或对结果进行了“标记”时一定要作全血涂片染色检查，血涂片染色镜检是提供鉴别诊断和提示进一步必要检查的重要工具，特别是在快速诊断某些特异性感染方面(如疟原虫、黑热病原虫及丝虫病等)，血涂片染色镜检有其重要作用。

传统的方式是采用手工制作，先在一张载玻片上进行血液推片，然后干燥、染色、干燥、观察。人工方式劳动强度大、速度慢，不适合大批量的血样处理。Coulter，Sysmex，Abbott等公司陆续开发出了自动推片染色机，对需要复检的样本进行自动推片染色，用以减少部分复检工作量。

此类设备都是按照标准的方法，需要复杂的机械手进行推片、烘干、染色等处理；染色后的血液细胞样本固定在载玻片上送入显微光学系统；在二维扫描平台的带动下，血片按照设定的扫描规律分区域扫描成像。

现有的自动推片染色机主要存在以下一些问题：实现结构复杂，体积庞大，价格昂贵；多帧图像获取过程中需要二维机械扫描，获取速度慢；图像中细胞数量过多，容易出现扎堆现象，很难采用图像处理的方法进行细胞识别和分割，即使人工计数也容易导致计数误差；还存在故障率高、血涂片质量不稳定等缺点。

发明内容

本发明的主要目的是克服传统自动染色机的缺点，实现一种基于染色技术的细胞形态学快速镜检装置和方法。

本发明的技术路线简介如下：在本发明中摈弃了载物板，直接将采集到的微量细胞样本和试剂在反应池充分混合，经一段时间反应后送入显微光学系统进行镜检。在显微光学系统内，细胞样本以流水线的方式通过，通过快速摄像技术可以在短时间内拍摄大量的显微照片。

本发明的一方面是提供一种基于染色技术的细胞形态学镜检装置，包括反应池、测量室、液路单元、以及显微光学系统。其特征在于，所述液路单元包括细胞样本接口和至少一种试剂接口；所述液路单元至少与所述反应池和所述测量室之一连通；所述反应池和所述测量室之间连通；所述测量室同时位于所述显微光学系统的内部。

本发明的另一方面是提供一种基于染色技术的细胞形态学镜检方法，其特征在于：液路单元将细胞样本和至少一种试剂注入反应池混合在一起；经过一段时间，反应池内的细胞样本被注入测量室；在测量室内部流动的细胞样本被显微光学系统成像。

采用本发明还可以在反应池内对细胞样本进一步稀释，虽然经过稀释后单帧图像拍摄到的细胞数量相对传统技术要少的多，但本发明可以在单位时间内拍摄大量的图像，因而拍摄的细胞总体数量并不会减少，甚至还可以更多，保证了测量结果的统计性和可靠性。

相对于传统的技术，本发明具有如下优点：细胞样本和染色液充分混合，有利于提高染色质量，加快染色速度；由于不要复杂的机械结构进行推片、染色、烘干以及在显微系统下的二维扫描，可以实现紧凑、可靠的自动化检验装置；另外一方面，单帧图像中细胞图像越稀疏，越有利于采用图像处理技术实现细胞图像的自动化分割、识别、统计和分类。

附图说明

图1是本发明用于血液细胞瑞氏染色的一个原理图。

图2是测量室构件的主视图。

图3是测量室构件的俯视图。

图4是本发明用于血液细胞瑞氏染色的工作流程图。

具体实施方式

以血液细胞的瑞氏染色做为在本发明的一个实施例。

图1是该实施例的原理图，一种基于染色技术的血液细胞形态学快速镜检装置，包括反应池1、测量室2、液路单元3、显微光学系统4以及控制单元5。其特征在于液路单元3可以向反应池1注入精确定量的血液样本7和染色液8进行染色，注入定量的缓冲液9对染色样本进行固定，注入稀释液10对固定后的样本进行稀释，或者注入清洗液11对反应池进行清洗；测量室2分别和反应池1、液路单元3相连，同时测量室2也是显微光学系统4的一个组件，位于显微光学系统4的物面上。染色后的样本由反应池1经测量室2流入液路单元3，并在显微光学系统4内实现快速拍摄；为了保证染色的稳定性和一致性，反应池1放置在一个恒温系统6内。控制单元5通过控制液路单元3、显微光学系统4以及恒温系统6实现染色、快速镜检、以及系统的清洗。

液路单元3进一步包括血液操作单元301、染色液操作单元302、缓冲液操作单元303、稀释液操作单元304、清洗液操作单元305、染色样本驱动单元306、废液收集单元307。其中血液操作单元301可以将微量的血液样本7加入到反应池1内，染色液操作单元302可以将定量的染色液8加入反应池1内，缓冲液操作单元303可以将定量的缓冲液9加入反应池1内，稀释液操作单元304可以将定量的稀释液10加入反应池1内，清洗液操作单元305可以将定量的清洗液11加入反应池1内，染色样本驱动单元306用于将染色稀释后的血液样本由反应池1送入测量室2进行检测，废液收集单元307将液路系统中的废液送入废液容器12内。

液路单元3内部的各单元之间可以是完全隔离的，也可共用一些管路、泵、阀等组件，将血液样本7和各种试剂染色液8、缓冲液9、稀释液10、清洗液11通过一条或多条管路送入反应池内。

显微光学系统4进一步包括光源401、光源会聚透镜402、成像透镜403、摄像机404，测量室2也是显微光学系统4的一个部件，位于显微光学系统的物面位置。测量室2包括两个端口A、B，分别和反应池1、液路单元3联通。染色后的血液样本在液路单元3的驱动下由反应池1流经测量室2并到达液路单元3。由光源401发出的光经光源会聚透镜202会聚到测量室2的测量区域，对流经该区域的血液细胞进行照明，被照明的细胞经成像透镜403成像到摄像机404的靶面，最终由控制单元5获取。

测量室2采用透明材料加工而成，如透明塑料、有机玻璃，普通光学玻璃，石英、宝石等等。其结构如图2、3所示，在透明材料中心形成一个扁平的通道，测量过程中，在其中流过的血液细胞样本形成层流状态。通道在光学轴向的高度h要足够小，接近于成像透镜403的景深，保证细胞在不同的位置均可以得到清晰的图像。考虑到流速分布对测量结果的影响，通道宽度d应是成像透镜403的视场直径的3～6倍。为了便于形成稳定的层流，通道长度l应是大于其宽度d(如4倍以上)，通道两侧应该尽可能光滑过度。

染色后血液细胞样本在测量室2内快速通过，为了便于观察其形态和颜色，对光源401和摄像机404提出了如下要求：

·高亮度、宽光谱光源；

·摄像机工作于帧曝光方式；

·如果选择可工作于频闪方式的光源，则摄像机404的电子快门的可以工作在较长的曝光时间模式下；

·如果光源只能工作于持续照明方式，则摄像机404的电子快门必须能够调到较小的曝光时间。

可选用的光源包括，高亮度的白色LED，卤钨灯、频闪放电管等。其中，卤钨灯只能工作于持续照明方式，频闪放电管工作于频闪方式，而LED则可以工作于两种方式，具有更大的灵活性，但亮度要低一些。

在实际应用中，摄像机404的像元尺寸和数量也是需要综合考虑的因素；较大的像元尺寸可以获得更多的光照能量，因此具有更好的信噪比，但是会导致像元数量减少，降低采样图像的空间分辨率；反之，增加像元数量提高了图像空间分辨率，但是降低了图像的信噪比。

在本发明的设计中，成像透镜403可以选用商品化的显微物镜，也可根据实际情况自行设计。

控制单元5进一步包括逻辑控制单元501、液路控制单元502、温度控制单元503、摄像机控制单元504、光源控制单元505。逻辑控制单元501依据设定的逻辑功能通过对液路单元3、恒温系统6、显微光学系统4的协同控制实现血液样本的染色和快速镜检，并在镜检后实现整个系统的清洗，逻辑控制单元501可以是一台PC机，也可以是含有CPU的控制板；液路控制单元502实现对液路单元3元件的控制，包括泵、阀、电机等组件；温度控制单元503实现对恒温系统6的控制；摄像机控制单元504实现对显微光学系统4中的摄像机404的控制；光源控制单元505实现对显微光学系统4中的光源401的控制。

在本实施例中，用到的试剂如下表

试剂名称	主要成分
		染色液8	瑞氏染液(伊红-亚甲基蓝，甲醇)

试剂名称	主要成分
		缓冲液9	磷酸盐缓冲液，PH值到6.5～7.0
稀释液10	生理盐水
		清洗液11	含表面活性剂的溶液

其它参数还包括，

·测量室2：扁平通道尺寸0.1mm(h)×2mm(w)×10mm(l)；

·光源401：超高亮度的白色LED，工作于持续照明方式；

·摄像机404：微视图像的CMOS彩色摄像机MVC1280SAC-GE27，有效像素1280×1024，像素尺寸6.7×6.7μm，快门速度8μs～26ms可调(实际设定在16μs)，帧率27fps，千兆以太网接口；

·成像透镜403：20×的显微物镜。

一个典型的控制流程如图4所示，描述如下：

·血液操作单元301和染色液操作单元302分别输送一定量的血液样本7(20μl)和染色液8(100μl)到反应池1内混合染色一段时间(约30秒)，为了保证染色的一致性，反应池1处于恒温系统6内并维持在30±0.5℃范围内；

·缓冲液操作单元303加入一定量的缓冲液9(100μl)到反应池1内一段时间(5分钟)，使染色后的血液细胞样本稳定化。

·稀释液操作单元304加入一定量的稀释液10(1.8ml)到反应池1内对染色后的血液样本进行稀释。

·染色样本驱动单元306驱动染色样本由反应池1按照一定的流速(4μl/s)进入测量室2，同时由摄像机控制单元504启动图像采集程序测量一段时间(20s)。

·测量完毕后，由清洗液操作单元305加入一定量的清洗液11(2.5ml)到反应池1内对反应池进行清洗，并由废液收集单元307将清洗后的的液体排至废液容器12内，此过程重复2～3次实现系统的彻底清洗。

假定某正常成人的红细胞数量为4×10⁶/μl，直径在6～9μm范围内，白细胞数量为6×10³/μl，直径在7～25μm范围内，基于以上参数可以得到：

·染色稀释后的血液样本大约被稀释了100倍，即红细胞浓度变为4×10⁴/μl，白细胞为60/μl；

·显微视场的区域为0.43mm×0.34mm，厚度即测量室2的厚度0.1mm，那么显微视场对应体积为0.015μl，相应的红细胞数量分别为600个和0.87个；

·如果20s内的帧率保证在25fps，那么共可以得到500帧图像，在这些图像中共可以得到约3×10⁵个红细胞以及435个白细胞，保证了测量结果的统计性；

·在显微图像中，红细胞的直径约为18～27个像素，白细胞直径约为21～75像素；

·血液样本在测量室内的流速约为20mm/s，在摄像机的电子曝光时间(16μs)内，样本液移动的距离为0.32μm，在靶面上对应于0.96像素，不会造成因运动而产生的拖尾现象；

·在摄像机的拍摄的两帧图像时间间隔内(约40ms)，样本液移动的距离为0.8mm，大于显微视场的区域最大边长0.43mm，因此，摄像机每一帧图像都是全新的图像，没有重复拍摄的区域。

该实施例进一步表明采用本发明的装置可以实现快速的血液细胞形态学镜检，得到大量、清晰的细胞染色图像。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明有所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (6)

1.一种基于染色技术的细胞形态学镜检装置，包括反应池(1)、测量室(2)、液路单元(3)、以及显微光学系统(4)，其特征在于，

所述液路单元(3)包括细胞样本接口和至少一种试剂接口；

所述液路单元(3)至少与所述反应池(1)和所述测量室(2)之一连通；

所述反应池(1)和所述测量室(2)之间连通；

所述测量室(2)同时位于所述显微光学系统(4)的内部。

2.根据权利要求1所述的镜检装置，其特征在于所述的连通是指液体在两个部件之间相互或者单向传输。

3.根据权利要求1所述的镜检装置，其特征在于所述测量室(2)是由透明材料构成的扁平流体通道，光学测量方向厚度h小于通道宽度d，通道宽度d小于通道长度l。

4.根据权利要求3所述的镜检装置，其特征在于所述扁平流体通道位于所述显微光学系统(4)的物面位置。

5.一种基于染色技术的细胞形态学镜检方法，其特征在于，

液路单元(3)将细胞样本和至少一种试剂注入反应池混合在一起；

经过一段时间，反应池(1)内的细胞样本被注入测量室(2)；

在测量室(2)内部流动的细胞样本被显微光学系统(4)成像。

6.根据权利要求5所述的镜检方法，其特征在于所述试剂包括化学染色试剂、荧光染色试剂、溶血剂、缓冲液、稀释液、清洗液。

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