CN101756992B

CN101756992B - 一种具有抑制肿瘤细胞多药耐药的高活性抗癌药甲酰阿地咪

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Publication number: CN101756992B
Application number: CN2009101643303A
Authority: CN
Inventors: 秦勇; 林勇; 王霞; 何彬; 宋颢; 郑雪莲; 张�林
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Chengdu Ivy Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2009-09-02
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2029-09-02
Also published as: CN101756992A

Abstract

本发明涉及如化学结构式所示的吲哚生物碱甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)，及其药学上可接受的盐，作为抗肿瘤药物在治疗人类恶性肿瘤中的应用。其作为抗肿瘤药物不仅可直接抑制恶性肿瘤细胞的增长，更为重要的是可作为化疗增敏剂，与其它抗肿瘤药物如阿霉素、长春新碱等联用，通过逆转肿瘤细胞的多药耐药性而达到有效杀灭肿瘤细胞的作用。更有意义的是，其作为化疗药物增敏剂较其直接作为肿瘤细胞生长抑制剂在治疗恶性肿瘤方面更为有效，具有重要的临床应用前景。

Description

一种具有抑制肿瘤细胞多药耐药的高活性抗癌药甲酰阿地咪

技术领域

本发明涉及吲哚生物碱甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)，其单独使用可显著抑制肿瘤细胞增殖，与多种化疗药物联合使用可显著增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，并且逆转多药耐药肿瘤细胞对药物的耐受，能显著提高抗肿瘤药物的活性。

背景技术

1993年McAlpine等发现真菌Aspergillus fischerii(var.brasiliensis)的提取物能够逆转肿瘤细胞耐药，恢复对长春新碱耐药的肿瘤细胞株对药物的敏感性，并且从提取物中分离出了三种成分，分别命名为阿地咪1(ardeemin)，乙酰阿地咪2(5-N-acetylardeemin)和15b羟基乙酰阿地咪3(15b-hydroxy-5-N-acetylardeemin)。它们都属于具有反式异戊二烯基的吲哚生物碱衍生物，乙酰阿地咪2是其中最主要的活性成分，其作用比传统的逆转多药耐药试剂钙拮抗剂维拉帕米(verapamil)强十倍(Hochlowski JE et al.J Antibiot(Tokyo).1993 Mar；46(3)：380-386；Karwowski JP et al.J Antibiot(Tokyo).1993 Mar；46(3)：374-379)。Danishefsky等发现，乙酰阿地咪2可通过抑制多药耐药蛋白P-glycoprotein170(Pgp170)的功能，阻滞药物的外排，增加药物在细胞内的集聚，从而逆转肿瘤细胞对药物的耐受。在体外培养的白血病耐药细胞株和肺癌耐药细胞株，以及小鼠P388白血病荷瘤模型中，乙酰阿地咪2均能显著降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的抗药性。更重要的是，动物实验显示，乙酰阿地咪2的全身毒性作用显著低于维拉帕米，每天给荷瘤小鼠腹腔注射乙酰阿地咪(i.p.，150mg/kg)，连续8天，小鼠耐受性良好，没有明显的体重下降，反之，连续三天给与维拉帕米(i.p..每天150mg/kg)，小鼠的死亡率高达40％。因此，由于乙酰阿地咪具有很强的逆转肿瘤耐药活性，而毒性作用低，极有希望被开发用于在抗肿瘤治疗中克服肿瘤细胞的耐药性(Chou TC etal.Proc Natl Acad Sci USA.1998 95：8369-8374)。

阿地咪1、乙酰阿地咪2和15b羟基乙酰阿地咪3的化学结构。

由于从真菌发酵液和菌丝体中提取分离乙酰阿地咪2难度较大，且得率低，极大地制约了对其的深入研究和开发利用。为了解决这一难题，国际上的研究者尝试采用全合成的方法来获得乙酰阿地咪2(Danishefsky et al J.Am.Chem.Soc.1999，121，11953；Danishefsky et al J.Am.Chem.Soc.1994，116，11143)。专利申请人基于不对称环丙烷化反应作为关键反应，发展了一种在吲哚烷的2，3位并联的四氢吡咯吲哚骨架的合成方法，并以此合成方法为基础，通过20步反应完成了吲哚生物碱阿地咪1、乙酰阿地咪2和甲酰阿地咪4的全合成(Qin，Y.et al.J.Org.Chem.2009，74，298)(图1)。其中，甲酰阿地咪4为通过氧化氮甲基保护基而得到的未见文献报道的新的阿地咪衍生物。专利申请人将所合成的甲酰阿地咪4开展了如下的抗肿瘤活性实验：单独使用抑制肿瘤细胞增殖、与多种化疗药物合用以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和逆转多药耐药肿瘤细胞对药物的耐受性，并与已知化合物乙酰阿地咪2进行比较，发现甲酰阿地咪4活性更强，其对肿瘤细胞的增敏作用和逆转耐药作用显著高于乙酰阿地咪2，具有进一步开发成为治疗肿瘤的药物的前景。

发明内容

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的化合物甲酰阿地咪4(5-N-formalardeemin)，能作为肿瘤细胞生长抑制剂和化疗增敏剂(多药耐药逆转剂)，单用或与其他抗肿瘤药物联合使用于治疗恶性肿瘤。所述的其他抗肿瘤药物包括影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物；直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物；嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物；干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物，通过抑制环氧化酶产生抗肿瘤作用的药物，以及针对EGFR相关Tyrosine激酶，热休克蛋白Hsp90，蛋白酶体Proteasome的抑制剂等。

一、实验材料吲哚生物碱甲酰阿地咪4和乙酰阿地咪2按文献方法(Qin，Y.et al.J.Org.Chem.2009，74，298，图1)通过20步全合成获得。

二、甲酰阿地咪4的抗肿瘤活性研究(图2)。

1.甲酰阿地咪4可显著抑制肿瘤细胞增殖，且其作用呈现剂量依赖关系(见实施例1和2)；

2.甲酰阿地咪4与其他抗肿瘤药物合用，显著增强肿瘤细胞对药物的敏感性(见实施例3)；

3.甲酰阿地咪4可有效逆转多药耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性，其作用呈现剂量依赖关系，并且其活性显著高于乙酰阿地咪2(见实施例4，5和6)；

附图说明

图1是本发明路线中阿地咪1、乙酰阿地咪2和甲酰阿地咪4的合成方法。

图2是甲酰阿地咪4逆转多药耐药人乳腺癌细胞株(MCF-7/Adr)对阿霉素(Adr)和长春新碱(VCR)的耐药性照片。

图3是用不同浓度的甲酰阿地咪4处理人乳腺癌MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。

图4是用不同浓度的甲酰阿地咪4处理人宫颈癌Siha细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。

图5是用阿霉素(0.4μg/ml)和不同浓度的甲酰阿地咪4处理人宫颈癌Siha细后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率。

图6是用阿霉素和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。

图7是用阿霉素和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率。

图8是用阿霉素和不同浓度的甲酰阿地咪4处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr后，MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。

图9是用长春新碱和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞存活率。

图10是用长春新碱和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2处理人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但本发明请求保护的范围不局限于本具体实施方式的说明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。吲哚生物碱乙酰阿地咪2((-)-acetylardeemin)和甲酰阿地咪4((-)-formalardeemin)按文献方法(Qin，Y.et al.J.Org.Chem.2009，74，298)合成制备。

乙酰阿地咪2((-)-N-Acetylardeemin)：[α]_D ²⁰＝-49°(c 0.1，CHCl₃)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.02(s，3H)，1.21(s，3H)，1.42(d，J＝7.6Hz，3H)，2.67(s br，3H)，2.69-2.68(m，1H)，3.02(dd，J＝12.8，5.7Hz，1H)，4.45-4.43(m，1H)，5.16-5.12(m，2H)，5.37(q，J＝7.6Hz，1H)，5.81(dd，J＝16.8，10.8Hz，1H)，6.08(s br，1H)，7.24-7.22(m，1H)，7.45-7.42(m，2H)，7.55-7.52(m，1H)，7.73(d，J＝8.8，1H)，7.80-7.78(m，1H)，8.08(s br，1H)，8.29(d，J＝8.0，1H).

甲酰阿地咪4((-)-N-Formalardeemin)：[α]_D ²⁰＝-52°(c 0.1，CHCl₃)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.02(s，3H)，1.18(s，3H)，1.50(d，J＝6.8Hz，3H)，2.73(t，J＝12.0Hz，1H)，3.03(dd，J＝13.2，6.0Hz，1H)，4.57-4.53(m，1H)，5.17-5.11(m，2H)，5.46(q，J＝7.2Hz，1H)，5.89(dd，J＝17.2，10.8Hz，1H)，6.14(s，1H)，7.20(t，J＝7.2Hz，1H)，7.37(t，J＝8.0Hz，1H)，7.42(d，J＝8.0Hz，1H)，7.51(t，J＝7.6Hz，1H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.78(t，J＝7.6Hz，1H)，8.09(d，J＝8.0Hz，1H)，8.28(d，J＝7.6Hz，1H)，9.10(s，1H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ17.5，22.3，23.0，38.7，41.1，53.2，58.1，60.6，77.3，115.5，117.3，120.5，124.9，125.0，127.0，127.2，127.4，129.6，132.3，134.8，141.1，142.4，147.0，150.1，159.8，161.8，166.2；HRMS-ESI calcd forC₂₇H₂₆N₄O₃Na(M+Na)⁺ 477.1897，found 477.1893；IR(KBr)3310，2895，1715，1643， 1410，1367，755cm^-1.

实施例1 甲酰阿地咪4对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用

实验方法：

人乳腺癌MCF-7细胞用含10％胎牛血清的PRMI1640(Hyclone)培养液培养，置37℃、5％CO2培养箱中。肿瘤细胞0.7×10⁴/孔接种于96孔板上，培养24h后，分别加入终浓度为10μM、20μM、40μM、80μM、160μM的甲酰阿地咪4，对照组加DMSO，另设调零组(只加培养液)，每个组设三个复孔。将96孔板置37℃、5％CO2培养箱再培养72h后，采用MTT比色法检测肿瘤细胞存活率，即每孔加入5mg/ml MTT(美国Sigma公司)试剂10μl，继续培养4h，吸除上清液，用PBS液洗后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μl，放于震荡器上震荡15min后，用酶标仪(570nm波长)测每孔的OD值。用下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(cell survival)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100，结果以均数±标准差表示。

结果：

如图3所示，甲酰阿地咪4剂量依赖性地抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞的生长。

实施例2 甲酰阿地咪4对人宫颈癌Siha细胞的增殖抑制作用

实验方法：

人宫颈癌Siha细胞用含10％胎牛血清的PRMI1640(Hyclone)培养液培养，置37℃、5％CO2培养箱中。肿瘤细胞0.7×10⁴/孔接种于96孔板上，培养24h后，按实施例1加入不同浓度的甲酰阿地咪4，继续培养72小时后，按照实施例1中的方法检测肿瘤细胞存活率。

结果：

如图4所示，甲酰阿地咪4剂量依赖性地抑制体外培养的人宫颈癌Siha细胞的生长。

实施例3 甲酰阿地咪4显著增加人宫颈癌Siha细胞对阿霉素的敏感性

实验方法：

人宫颈癌Siha细胞培养条件同实施例2。肿瘤细胞0.7×10⁴/孔接种于96孔板上，培养24h后，分别单独加入阿霉素(0.4μg/ml，意法玛西亚)，或不同浓度的甲酰阿地咪4(20μM，40μM，80μM，160μM)，或者同时加入阿霉素和不同浓度的甲酰阿地咪4，对照组加DMSO，另设调零组(只加培养液)，每个组设三个复孔。将96孔板置37℃、5％CO2培养箱再培养72h后，通过乳酸脱

氢酶(LDH)释放实验，采用乳酸脱氢酶检测试剂盒(Cyto Tox 96

Non-RadioactiveCytotoxicity Assay，Promega，货号G1780)，检测细胞死亡率。具体方法简述如下：收集每孔的培养上清到一个新的96孔板，加入等体积的底物反应液，室温孵育30分钟后，加入终止液终止反应，用酶标仪(490nm波长)测每孔的OD值，同时加入细胞裂解液裂解细胞，收集上清，检测细胞最大释放值。根据检测的OD490值，按照下列公式计算细胞死亡率：细胞死亡率＝培养上清LDH释放(OD490)/LDH最大释放(OD490)。结果以均数±标准差表示。

结果：

用阿霉素(0.4μg/ml)和不同浓度的甲酰阿地咪4处理人宫颈癌Siha细胞后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测肿瘤细胞死亡率如图5所示。

实施例4 甲酰阿地咪4显著逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr对阿霉素的耐药性，其活性明显高于乙酰阿地咪2

实验方法：

人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr培养在含10％胎牛血清PRMI1640(Hyclone)培养液中，并加入维持剂量的阿霉素(1μg/ml)，置37℃、5％CO2培养箱。肿瘤细胞0.7×10⁴/孔接种于96孔板上，培养24h后，分别单独加入阿霉素(3μg/ml)，甲酰阿地咪4(40μM)，乙酰阿地咪2(40μM)，或者同时加入阿霉素和相应的吲哚生物碱，每组设六个复孔。将96孔板置37℃、5％CO2培养箱再培养72h后，每个组取三复孔分别加入5mg/ml MTT试剂10μl，采用MTT比色法检测细胞存活率。另外三个复孔，按实施例3中方法，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验，检测细胞死亡率。结果以均数±标准差表示。

结果：

如图6和图7，通过检测细胞存活率和细胞死亡率均显示，甲酰阿地咪4能够显著逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对阿霉素的耐药性，更重要的是，其逆转肿瘤耐药的活性显著高于乙酰阿地咪2。

实施例5 甲酰阿地咪4能够剂量依赖性地逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr对阿霉素的耐药性

实验方法：

人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr培养条件同实施例4。按实施例4中条件接种细胞于96孔板，24h后，分别加入阿霉素(3μg/ml)，或不同浓度的甲酰阿地咪4(20μM，40μM，60μM)，或者同时加入阿霉素和相应浓度的甲酰阿地咪4。将96孔板置37℃、5％CO2培养箱再培养72h后，采用MTT比色法检测细胞存活率。结果以均数±标准差表示。

结果：

如图8、通过检测细胞存活率显示，甲酰阿地咪4能够显著逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对阿霉素的敏感性，其作用呈剂量依赖关系。

实施例6 甲酰阿地咪4显著逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr对长春新碱的耐药性，其活性明显高于乙酰阿地咪2

实验方法：

人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/Adr培养条件同实施例5。按实施例5中条件接种细胞于96孔板，24h后，分别加入长春新碱(VCR，1μM)，甲酰阿地咪4(40μM)，乙酰阿地咪2(40μM)，或者同时加入长春新碱和相应的吲哚生物碱，每个组设六个复孔。将96孔板置37℃、5％CO2培养箱再培养72h后，其中三孔采用MTT比色法检测细胞存活率。另外三个复孔，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验，检测细胞死亡率。结果以均数±标准差表示。

结果：

如图9和图10，通过检测细胞存活率和细胞死亡率均显示，甲酰阿地咪4能够显著逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对长春新碱的敏感性，更重要的是，其逆转肿瘤耐药的活性显著高于乙酰阿地咪2。

Claims

1.如化学结构式所示的吲哚生物碱甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甲酰阿地咪作为抗肿瘤药物单独使用或与其它抗肿瘤药物组成药物组合物联合使用治疗恶性肿瘤时，使用的是含有治疗有效剂量的甲酰阿地咪及其药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甲酰阿地咪或其药学上可接受的盐的含量为0.001～99.9wt％。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述其它抗肿瘤药物选自一种影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物、通过抑制环氧化酶产生抗肿瘤作用的药物、EGFR相关的激酶抑制剂、热休克蛋白Hsp90抑制剂或Proteasome抑制剂，其中影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物选自直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物、嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物、干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物。

5.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甲酰阿地咪在治疗人类恶性肿瘤时作为恶性肿瘤化疗增敏剂使用，以克服恶性肿瘤化疗过程中产生的多药耐药性问题。