CN101750496A - 一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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应希堂
胡国茂
郑金来
唐宝军
张坤
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Abstract

本发明涉及一种检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是将包被膜、含乙肝e抗原的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。包被膜上预包被有乙肝e抗体检测线和质控线,本发明将磁性微粒子免疫层析技术引入到乙肝e抗体检测中,操作简便,灵敏度高,特异性好。

Description

一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检验领域,特别是涉及一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起,HBV是一种包含部分双链环状DNA基因组的包膜病毒,属于肝DNA病毒科。当病毒在肝细胞中复制时,可以干扰肝脏的功能,随即免疫系统激活产生一系列特异的反应以对抗并根除传染性因素。作为一种病理性损伤的结果,肝脏发生炎症。持续的HBV感染导致的严重的病理学结果包括:慢性肝脏功能不全,肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
HBeAb在HBeAg转阴后出现,HBeAb阳性预示患者的传染性已显著或相对降低,病毒复制程度已降低或明显缓解。近年发现个别HBeAb阳性,但乙肝病毒核糖核酸(HBV-DNA)亦为阳性者的病情迁延不愈,提示体内仍有病毒复制。
目前HBeAb的检测方法主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法),这些方法都有各自的特点和适用对象。
ELISA和CLIA方法是目前临床免疫分析中普遍使用检测技术,但反应时间相对较长,而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备,无法满足临床急诊术前检测,抢救前指导用药的要求,也限制了在一些基层医疗单位的应用。胶体金或乳胶颗粒为代表的快速检测试纸条,缺点是结果需要肉眼观察,容易受观察者主观判断的影响,且灵敏度较低。
磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test,MICT)是近年来出现的一种单人份快速定量检测技术。它是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金,乳胶颗粒等)来进行免疫层析,通过检测测量磁场强度来示踪待测样品的含量。该技术与传统技术相比具有下述优势:a.所用磁性检测仪器采用固相元件,微型化设计自成一体,独立运行,体积小,操作简便;b.灵敏度比各类目测快速诊断法高10-100倍;c.读数快速,可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据;d.线形范围可达4个浓度数量级;e.超顺磁性纳米微粒由聚合物包被,不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金,乳胶颗粒等)简便快速,单人份操作的优点,又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低,只能定性,不能定量的缺点,是当今即时检验(Point of Care Test,POCT)技术发展的先进代表。
目前MICT中常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs),没有外加磁场的情况下不具有任何磁性,只有在外加磁场作用下才会表现出磁性,商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰,大大方便了偶联过程,标记简便,重复性好。
发明内容
本发明的目的即是将磁性免疫层析技术应用在HBeAb免疫分析中。将HBeAb共价偶联于超顺磁颗粒上,再将限量的HBeAg与磁颗粒上的HBeAb反应,然后喷涂于玻璃纤维垫上,同时将另一株乙肝e抗体包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相,按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测,结合简便易行的磁性检测仪进行检测,可以实现快速灵敏地检测,该技术综合了前述几种方法的优势:既可以单人份检测,也可以批量检测,并且可以即时给出定量结果,测量仪器简单可靠,操作简便,方便实用。
为达到上述的目的,本发明的技术方案如下:将包被膜、含有乙肝e抗原的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上,然后在上层覆盖透明塑料密封膜而制成,其中所述的包被膜上预包被有HBeAb检测线,以及预包被了二抗的质控线。
选用的底板为透明塑料底板,包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜,选用的吸水垫为纤维素膜,磁颗粒垫为玻璃纤维垫,样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所述的样品垫处理液是含有1%-5%酪蛋白(casein)和0.1%-1%的聚乙烯醇(PVP),以及0.01-0.2%吐温-20(Tween-20)的0.02M,pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法,包括以下步骤:
A、磁颗粒的制备:选用直径为50-300nm的超顺磁颗粒,使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将HBeAb标记到磁颗粒上;
B、将限量的HBeAg与磁颗粒上的HBeAb反应,反应后应保磁颗粒上同时存在磁颗粒标记的HBeAb、磁颗粒标记HBeAb-HBeAg复合物,将制备好的磁颗粒偶联物同时使用定量喷液装置以25μl/cm-50μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上;
C、包被膜的制备:使用包被缓冲液分别将HBeAb以及二抗稀释到0.5-2mg/m的浓度,使用定量喷液装置分别将二者以0.5-1.0cm的间隔于硝酸纤维素膜上,晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时,加入干燥剂封存备用;
D、样品垫的处理:将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时;
E、试纸条的组装:在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫,然后在上层覆盖透明塑料密封膜,得到试纸板,根据要求宽度切割即得到试纸条。
所述的步骤A中,含HBeAb磁颗粒的制备:使用含有0.1%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒,加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol,室温反应1小时,使用含有0.1%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入HBeAb使其与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比),室温反应3小时,加入含有0.5%BSA的0.02M,pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟,洗涤磁颗粒,使用含有1%PVP,1%Casein,0.5%Tween-20,5%蔗糖的50mM pH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒,4℃保存备用;
所述的步骤B中,磁颗粒喷涂的方法是:将HBeAg与联接上HBeAb的磁颗粒以1∶2(蛋白质量比)的比例混合,置37℃反应1h后,将反应后的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上,冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。
所述的步骤C中,包被膜的制备方法是:用包被缓冲液(0.02M PB,pH7.0-7.6)将HBeAb稀释为0.5mg/ml,二抗稀释为1mg/ml,使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上,室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时,加入干燥剂封存备用。
本发明运用磁性检测仪来进行结果的判读,依据检测线与质控线的磁性检测值比值来进行阴阳性判断,与传统的快速检测试纸条相比较,本方法避免了检测主观性,结果准确、可靠。
本发明操作简便,适合大规模生产,检测所需的便携式设备也已经上市,因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用单位。
附图说明
图1为本发明检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条结构示意图。
为进一步说明本发明检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法,特举以下的实施例进行说明,该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
具体实施方式
本发明所述的检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条,如图1所示,该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜、喷涂了含HBeAg的磁颗粒的玻璃纤维垫、样品垫、吸水垫,并在上层覆盖透明塑料密封膜,组装而成的试纸条。
在具体实施例中,所采用HBeAb为商品化抗体。利用中和抑制法原理检测标本中的HBeAb,当待测标本中不含有HBeAb时,磁颗粒标记的HBeAb-HBeAg复合物会随着层析作用的进行,复合物向前移动到达HBeAb包被线T处,磁颗粒标记HBeAb-HBeAg复合物再与包被的HBeAb反应,则形成磁颗粒标记HBeAb-HBeAg-包被HBeAb复合物聚集于T线处;当标本中含有HBeAb时,样本中的HBeAb竞争地和磁颗粒标记的HBeAb-HBeAg复合物上的抗原结合,从而抑制磁颗粒标记HBeAb-HBeAg复合物与包被的HBeAb结合,则形成的磁颗粒标记HBeAb-HBeAg-包被HBeAb很少或没有;另外,无论标本中有没有HBeAb,未结合磁颗粒标记HBeAb会继续前行到达质控线C时,二抗与磁颗粒标记HBeAb结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全,一般反应十五分钟后即可使用磁性免疫层析仪器读卡,T线以及C线都会产生相应的磁性信号值,计算T/C的比值,根据预设的界限比值即可判定结果的阴阳性。整个读卡、计算、与预设界限值比对的过程已经完全程序化,磁性检测仪会直接给出阴阳性结果。
本发明所述的检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例:
实施例1
检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法
本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤:
A、抗体的制备:选用商品化的HBeAb,对20mM,pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS,4℃透析过夜备用。
B、包被膜的制备:
包被缓冲液的配制:0.02M pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)为包被缓冲液,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用,有效期两周。
封闭液的配制:含0.5%BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的磷酸盐缓冲液(PBS),0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存备用,有效期一周。
包被膜的制备:用包被缓冲液(0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PB)将抗人HBeAg抗体稀释为0.5mg/ml,而二抗稀释为1mg/ml,使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度硝酸纤维素膜上,室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5%BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS,)中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时,加入干燥剂封存备用。
C、磁颗粒的制备:
醋酸钠缓冲液的配制:用双蒸水和醋酸钠及冰醋酸配制pH值为4.7(pH4.5-5.0均适用),浓度为50mM的醋酸缓冲液,加入Tween-20至终浓度为0.1%,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用,有效期两周。
硼酸保存缓冲液的配制:用双蒸水,硼酸和硼砂配制pH为8.5(pH8.2-9.0均适用),终浓度为50mM的硼酸缓冲液,加入PVP,Casine,Tween-20,蔗糖,终浓度分别为1%,1%,0.5%,5%,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用,有效期一周。
HBeAb磁颗粒的制备:使用含有0.1%Tween-20的50mM pH4.7(pH4.5-5.0均适用)醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒,加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol,室温反应1小时,充分洗涤磁颗粒后加入HBeAb使HBeAb与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比),室温反应3小时,加入含有0.5%BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS,室温封闭30分钟,洗涤磁颗粒,使用含有1%PVP,1%Casein,0.5%Tween-20,5%蔗糖的50mmolpH8.5(pH8.2-9.0均适用)的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒,4℃保存备用。
D、磁颗粒的喷涂与冻干
使用限量的HBeAg与磁颗粒标记HBeAb以1∶2(蛋白质量比)的比例混合,37℃1h后,使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒混合物以50μl/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维垫上,过夜冷冻干燥,加入干燥剂封存备用,
E、样品垫的处理
将1.8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时。
样品垫处理液是含有1%-5%Casein和0.1%-1%的PVA以及0.01-0.2%Tween-20的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS溶液。
F、试纸条的组装及切割
下述所有操作都必须在湿度小于20%,温度20-25℃的房间内进行。
试纸板的组装:使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3.5cm宽的包被膜,2.5cm宽的吸水纸,0.8cm宽的磁颗粒垫,1.8cm宽的样品垫组装于9.8cm宽度透明塑料底板上,贴上上层透明塑料盖板,组装成试纸板。
试纸条的裁切:使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条。
G、试纸卡的组装
将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内,盖上上盖,使用压卡机将上下两片塑料卡压紧,确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。
H、确定该批次的二维码信息
品名:HBeAb磁性检测卡
批次:试纸卡的组装日期,格式为:年/月/日,XXXX/XX/XX
阴阳性判读标准的确定:取100份确认HBeAb标本(强弱均有)、500份随机标本使用该批次试纸卡检测,使用磁性检测仪检测结果,计算每个检测卡的T1/C值,T2/C值,使用统计学方法计算均值和标准差,确定:T/C<0.1,T/C>0.2为阳性,二者之间为灰区。
I、二维码的打印粘贴
将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印,将二维码粘贴于试纸卡的特定位置,使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2%确保二维码粘贴无误。
J、成品包装
将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内,100人份为一个包装置于一个包装盒内,一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液,即制成试纸盒,该试纸盒于室温避光保存,保质期为18个月。层析缓冲液配方为:1%Tween-20,0.5%Triton X-100,I%NP-40,0.05%NaN3,20mmol pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS,。
实施例2
本发明的检测卡的使用方法
1、加样
从包装盒中取出单人份的检测卡,撕开铝箔带包装,将试纸卡置于平整桌面上,用微量移液器取50μl样本血清加入卡上的加样孔内,再加入50μl层析缓冲液,等待反应进行15分钟。
2、测量及结果输出
将MICT检测仪预先开机,将检测卡插入检测仪的插卡口,运行仪器,仪器会自动读取卡上的二维码信息并进行测量,即时打印测量结果,阴阳性结果会在打印结果中显示。

Claims (10)

1.一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条,其特征在于:该试纸条是将包被膜、含乙肝e抗原(HBeAg)的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上,然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成,其中所述的包被膜上预包被有乙肝e抗体检测线和质控线。
2.根据权利要求1所述的包被膜,其特征在于:所述的包被膜为硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的包被膜,其特征在于:所述包被膜上所包被的物质为HBeAb和二抗。
4.根据权利要求3所述的HBeAb,其特征在于:所述HBeAb可以是单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体或将它们进行不同的组合。
5.根据权利要求1所述的磁颗粒垫,其特征在于:所述的磁颗粒垫为在玻璃纤维上喷涂上已联接HBeAg的磁颗粒。
6.根据权利要求5所述的已联接HBeAg的磁颗粒,其特征在于:所述已联接HBeAg的磁颗粒的制备方法为先用共价偶联法将HBeAb联接到磁颗粒上,再加入限量的HBeAg与磁颗粒上的HBeAb反应,反应后磁颗粒上应含有剩余的游离HBeAb。
7.根据权利要求5、6中所述的HBeAg,其特征在于:所述的HBeAg可以是基因重组抗原、人工合成多肽抗原或人血源性抗原。
8.根据权利要求6中所述的磁颗粒标记的HBeAb,其特征在于:其所述的HBeAb可以是单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。
9.根据权利要求1、5中所述的磁颗粒,其特征在于:所述磁颗粒的直径在50nm-300nm。
10.根据权利要求3中所述的二抗,其特征在于:所述的二抗应和权利要求1、5中所述的HBeAb配对。
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