CN101750496A - 一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是将包被膜、含乙肝e抗原的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。包被膜上预包被有乙肝e抗体检测线和质控线，本发明将磁性微粒子免疫层析技术引入到乙肝e抗体检测中，操作简便，灵敏度高，特异性好。

Description

一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，HBV是一种包含部分双链环状DNA基因组的包膜病毒，属于肝DNA病毒科。当病毒在肝细胞中复制时，可以干扰肝脏的功能，随即免疫系统激活产生一系列特异的反应以对抗并根除传染性因素。作为一种病理性损伤的结果，肝脏发生炎症。持续的HBV感染导致的严重的病理学结果包括：慢性肝脏功能不全，肝硬化和肝细胞癌(HCC)。

HBeAb在HBeAg转阴后出现，HBeAb阳性预示患者的传染性已显著或相对降低，病毒复制程度已降低或明显缓解。近年发现个别HBeAb阳性，但乙肝病毒核糖核酸(HBV-DNA)亦为阳性者的病情迁延不愈，提示体内仍有病毒复制。

目前HBeAb的检测方法主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法)，这些方法都有各自的特点和适用对象。

ELISA和CLIA方法是目前临床免疫分析中普遍使用检测技术，但反应时间相对较长，而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备，无法满足临床急诊术前检测，抢救前指导用药的要求，也限制了在一些基层医疗单位的应用。胶体金或乳胶颗粒为代表的快速检测试纸条，缺点是结果需要肉眼观察，容易受观察者主观判断的影响，且灵敏度较低。

磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一种单人份快速定量检测技术。它是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测测量磁场强度来示踪待测样品的含量。该技术与传统技术相比具有下述优势：a.所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目测快速诊断法高10-100倍；c.读数快速，可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；d.线形范围可达4个浓度数量级；e.超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，是当今即时检验(Point of Care Test，POCT)技术发展的先进代表。

目前MICT中常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰，大大方便了偶联过程，标记简便，重复性好。

发明内容

本发明的目的即是将磁性免疫层析技术应用在HBeAb免疫分析中。将HBeAb共价偶联于超顺磁颗粒上，再将限量的HBeAg与磁颗粒上的HBeAb反应，然后喷涂于玻璃纤维垫上，同时将另一株乙肝e抗体包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，可以实现快速灵敏地检测，该技术综合了前述几种方法的优势：既可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：将包被膜、含有乙肝e抗原的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上预包被有HBeAb检测线，以及预包被了二抗的质控线。

选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所述的样品垫处理液是含有1％-5％酪蛋白(casein)和0.1％-1％的聚乙烯醇(PVP)，以及0.01-0.2％吐温-20(Tween-20)的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。

检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

A、磁颗粒的制备：选用直径为50-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将HBeAb标记到磁颗粒上；

B、将限量的HBeAg与磁颗粒上的HBeAb反应，反应后应保磁颗粒上同时存在磁颗粒标记的HBeAb、磁颗粒标记HBeAb-HBeAg复合物，将制备好的磁颗粒偶联物同时使用定量喷液装置以25μl/cm-50μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；

C、包被膜的制备：使用包被缓冲液分别将HBeAb以及二抗稀释到0.5-2mg/m的浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0.5-1.0cm的间隔于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用；

D、样品垫的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时；

E、试纸条的组装：在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。

所述的步骤A中，含HBeAb磁颗粒的制备：使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入HBeAb使其与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mM pH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4℃保存备用；

所述的步骤B中，磁颗粒喷涂的方法是：将HBeAg与联接上HBeAb的磁颗粒以1∶2(蛋白质量比)的比例混合，置37℃反应1h后，将反应后的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。

所述的步骤C中，包被膜的制备方法是：用包被缓冲液(0.02M PB，pH7.0-7.6)将HBeAb稀释为0.5mg/ml，二抗稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

本发明运用磁性检测仪来进行结果的判读，依据检测线与质控线的磁性检测值比值来进行阴阳性判断，与传统的快速检测试纸条相比较，本方法避免了检测主观性，结果准确、可靠。

本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等小批量或单人份使用单位。

附图说明

图1为本发明检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条结构示意图。

为进一步说明本发明检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

具体实施方式

本发明所述的检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条，如图1所示，该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜、喷涂了含HBeAg的磁颗粒的玻璃纤维垫、样品垫、吸水垫，并在上层覆盖透明塑料密封膜，组装而成的试纸条。

在具体实施例中，所采用HBeAb为商品化抗体。利用中和抑制法原理检测标本中的HBeAb，当待测标本中不含有HBeAb时，磁颗粒标记的HBeAb-HBeAg复合物会随着层析作用的进行，复合物向前移动到达HBeAb包被线T处，磁颗粒标记HBeAb-HBeAg复合物再与包被的HBeAb反应，则形成磁颗粒标记HBeAb-HBeAg-包被HBeAb复合物聚集于T线处；当标本中含有HBeAb时，样本中的HBeAb竞争地和磁颗粒标记的HBeAb-HBeAg复合物上的抗原结合，从而抑制磁颗粒标记HBeAb-HBeAg复合物与包被的HBeAb结合，则形成的磁颗粒标记HBeAb-HBeAg-包被HBeAb很少或没有；另外，无论标本中有没有HBeAb，未结合磁颗粒标记HBeAb会继续前行到达质控线C时，二抗与磁颗粒标记HBeAb结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般反应十五分钟后即可使用磁性免疫层析仪器读卡，T线以及C线都会产生相应的磁性信号值，计算T/C的比值，根据预设的界限比值即可判定结果的阴阳性。整个读卡、计算、与预设界限值比对的过程已经完全程序化，磁性检测仪会直接给出阴阳性结果。

本发明所述的检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例：

实施例1

检测血液中乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法

本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤：

A、抗体的制备：选用商品化的HBeAb，对20mM，pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，4℃透析过夜备用。

B、包被膜的制备：

包被缓冲液的配制：0.02M pH 7.2的磷酸缓冲液(PBS)为包被缓冲液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期两周。

封闭液的配制：含0.5％BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存备用，有效期一周。

包被膜的制备：用包被缓冲液(0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PB)将抗人HBeAg抗体稀释为0.5mg/ml，而二抗稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1μl/cm的量将二者以0.6cm的间隔均匀喷印于3.5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有0.5％BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，)中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。

C、磁颗粒的制备：

醋酸钠缓冲液的配制：用双蒸水和醋酸钠及冰醋酸配制pH值为4.7(pH4.5-5.0均适用)，浓度为50mM的醋酸缓冲液，加入Tween-20至终浓度为0.1％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期两周。

硼酸保存缓冲液的配制：用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8.5(pH8.2-9.0均适用)，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP，Casine，Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1％，1％，0.5％，5％，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用，有效期一周。

HBeAb磁颗粒的制备：使用含有0.1％Tween-20的50mM pH4.7(pH4.5-5.0均适用)醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入HBeAb使HBeAb与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1％PVP，1％Casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mmolpH8.5(pH8.2-9.0均适用)的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4℃保存备用。

D、磁颗粒的喷涂与冻干

使用限量的HBeAg与磁颗粒标记HBeAb以1∶2(蛋白质量比)的比例混合，37℃1h后，使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒混合物以50μl/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，

E、样品垫的处理

将1.8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃烘干8小时。

样品垫处理液是含有1％-5％Casein和0.1％-1％的PVA以及0.01-0.2％Tween-20的0.02M pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS溶液。

F、试纸条的组装及切割

下述所有操作都必须在湿度小于20％，温度20-25℃的房间内进行。

试纸板的组装：使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3.5cm宽的包被膜，2.5cm宽的吸水纸，0.8cm宽的磁颗粒垫，1.8cm宽的样品垫组装于9.8cm宽度透明塑料底板上，贴上上层透明塑料盖板，组装成试纸板。

试纸条的裁切：使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.5cm宽的成品试纸条。

G、试纸卡的组装

将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备用。

H、确定该批次的二维码信息

品名：HBeAb磁性检测卡

批次：试纸卡的组装日期，格式为：年/月/日，XXXX/XX/XX

阴阳性判读标准的确定：取100份确认HBeAb标本(强弱均有)、500份随机标本使用该批次试纸卡检测，使用磁性检测仪检测结果，计算每个检测卡的T1/C值，T2/C值，使用统计学方法计算均值和标准差，确定：T/C＜0.1，T/C＞0.2为阳性，二者之间为灰区。

I、二维码的打印粘贴

将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2％确保二维码粘贴无误。

J、成品包装

将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液，即制成试纸盒，该试纸盒于室温避光保存，保质期为18个月。层析缓冲液配方为：1％Tween-20，0.5％Triton X-100，I％NP-40，0.05％NaN3，20mmol pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS，。

实施例2

本发明的检测卡的使用方法

1、加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用微量移液器取50μl样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50μl层析缓冲液，等待反应进行15分钟。

2、测量及结果输出

将MICT检测仪预先开机，将检测卡插入检测仪的插卡口，运行仪器，仪器会自动读取卡上的二维码信息并进行测量，即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。

Claims (10)

1.一种检测乙肝e抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是将包被膜、含乙肝e抗原(HBeAg)的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有乙肝e抗体检测线和质控线。

2.根据权利要求1所述的包被膜，其特征在于：所述的包被膜为硝酸纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的包被膜，其特征在于：所述包被膜上所包被的物质为HBeAb和二抗。

4.根据权利要求3所述的HBeAb，其特征在于：所述HBeAb可以是单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体或将它们进行不同的组合。

5.根据权利要求1所述的磁颗粒垫，其特征在于：所述的磁颗粒垫为在玻璃纤维上喷涂上已联接HBeAg的磁颗粒。

6.根据权利要求5所述的已联接HBeAg的磁颗粒，其特征在于：所述已联接HBeAg的磁颗粒的制备方法为先用共价偶联法将HBeAb联接到磁颗粒上，再加入限量的HBeAg与磁颗粒上的HBeAb反应，反应后磁颗粒上应含有剩余的游离HBeAb。

7.根据权利要求5、6中所述的HBeAg，其特征在于：所述的HBeAg可以是基因重组抗原、人工合成多肽抗原或人血源性抗原。

8.根据权利要求6中所述的磁颗粒标记的HBeAb，其特征在于：其所述的HBeAb可以是单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

9.根据权利要求1、5中所述的磁颗粒，其特征在于：所述磁颗粒的直径在50nm-300nm。

10.根据权利要求3中所述的二抗，其特征在于：所述的二抗应和权利要求1、5中所述的HBeAb配对。

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