CN101747422A

CN101747422A - 日本血吸虫脂肪酸结合蛋白、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN101747422A
Application number: CN200810044088A
Authority: CN
Inventors: 刘锋; 韩泽广; 冯正; 胡薇
Original assignee: Shanghai Human Genome Research Center
Current assignee: Chinese National Human Genome Center at Shanghai; Shanghai Human Genome Research Center
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2010-06-23

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白及其编码基因，日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因，包括：具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；日本血吸虫脂肪酸结合蛋白，包括：具有SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的蛋白、或由这些蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫脂肪酸结合蛋白及其编码基因的用途，本发明的日本血吸虫脂肪酸结合蛋白可应用于制备血吸虫疫苗、筛选药物、制备抗血吸虫抗体及血清学诊断方面，日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因可应用于基因治疗方面。

Description

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及生物基因领域，具体地涉及一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白、其编码基因及应用。

背景技术

血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病的血吸虫有3种，既日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸虫(S.mansoni)和埃及血吸虫(S.haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制血吸虫临床诊断试剂和抗血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。

日本血吸虫作为寄生虫能在人体和动物体内存在很多年而不被宿主的免疫机制杀死，与它的免疫逃避能力有关。其免疫逃避机制有抗原模拟、抗原伪装和免疫调节。其中免疫调节指的是血吸虫的蛋白能够调节、干扰(主要是抑制)宿主的免疫系统，使其不能发挥正常的免疫攻击效能，从而有利于血吸虫的生存。

血吸虫的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein，ESP)就是一类可以发挥免疫调节作用的蛋白质。这些蛋白来自血吸虫的表皮和肠道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸虫各个虫期都产生这类蛋白。ESP是潜在药物靶点和疫苗分子，因为抑制这些蛋白可以干扰血吸虫的免疫逃避机制从而增强宿主的免疫杀灭功能；ESP是潜在的诊断分子，因为这些蛋白游离于宿主的血液中，可以很方便地用现有手段检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白及编码基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一方面，提供了一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白，包括：

具有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白；

具有SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白；

具有SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白；

具有SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因，具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.5所示序列的蛋白；所述的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.6所示序列的蛋白；所述的SEQID NO.3所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.7所示序列的蛋白；所述的SEQID NO.4所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.8所示序列的蛋白。

本发明利用蛋白质组学手段，通过分析体外提取的日本血吸虫的ESP的组成成分，我们发现日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein，FABP)是其ESP的最主要成分，丰度最高，表明该蛋白可能在血吸虫的免疫调节、免疫逃避方面发挥重要作用；同时，通过直接分析感染动物(兔子)的血液，发现该蛋白的确在宿主血液中也存在，而且也是丰度最高，这也使它成为很好的诊断标记分子。这是国际上首次发现FABP出现在日本血吸虫的ESP中。

在本发明的另一方面，提供了日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的用途，包括：作为免疫原，可应用于制备血吸虫疫苗；作为潜在的药物作用靶点，应用于筛选化学和其他种类药物；作为特异性血吸虫抗原，应用于制备抗血吸虫抗体；日本血吸虫脂肪酸结合蛋白还可应用于血清学诊断方面；日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因，可应用于基因治疗方面。

附图说明

图1是本发明日本血吸虫脂肪酸结合蛋白质谱鉴定的代表肽段的示意图；

图2是本发明日本血吸虫19种脂肪酸结合蛋白的序列排列示意图；

图3是本发明日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的进化关系示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1日本血吸虫排泌蛋白的分离和鉴定实验

1).日本血吸虫成虫排泌产物的制备和蛋白提取：

日本血吸虫成虫从感染动物体内分离出来后用PBS洗2次，大约800条成虫用1mlPBS悬浮，10分钟后低速离心把上清吸出收集，重复10编，把上清合并。用丙酮沉淀上清中的蛋白，溶解沉淀用50mM Tris-HCl(pH 8.3)，5mM EDTA，1mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)，0.5％sodium dodecyl sulfate(SDS)and 0.5mM DTT，0.5％SDS，超声促溶。

2).日本血吸虫排泌蛋白的酶解过程：

排泌蛋白混合物用10mM DTT和55mM的碘乙酰氨处理，稀释后用胰酶酶解过夜。

3).日本血吸虫排泌蛋白酶解肽段的在线色谱分离和质谱鉴定：

酶解产生的肽混合物，用真空将溶液体积抽减到30μl。之后，每个组分的肽混合物上样到一个反相捕获柱(C18，5μm，

300μm i.d×5mm，LC Packings)，在20μl/min的流速下脱盐。然后这个捕获柱和一个分析用的75μm×150mm C18柱(LC Packings)相连接，肽混合物就在200nl/min的流速下，从这个柱子上洗脱进入装有Protana NanoES的电喷雾离子源的QSTAR pulser i中。Agilent 1100毛细液相系统(Agilent Technologies)用来提供流动相A(0.5％乙酸/水)和流动相B(0.5％乙酸/乙腈)，线性梯度是60分钟内5％B到50％B，30分钟内50％B到90％B，然后是在90％B停留15分钟。在分析柱后通过一个不锈钢的两通(Valco Instrument)连接一个10-μm直径的PicoTip纳喷雾头(New Objective)，加上2500-3000伏的喷雾电压，以获得稳定的喷雾。MS/MS串联质谱谱图通过信息依赖的采集(IDA)和任务-循环增强来记录。在每个测定扫描中，选取3-6个信号最强、带2到3个电荷的离子，用滚动碰撞能量打碎，以获得串联质谱的信息。

4).日本血吸虫排泌蛋白的软件搜索鉴定：

质谱搜索用的数据库，包括从11717个从公共数据库NCBI下载的日本血吸虫蛋白质序列(时间是2008年10月16日)。搜索软件是MASCOT(http://www.matrixscience.com/，Matrix Science)。搜索参数为：最大漏切点，3个；monoisotopic；肽电荷数，+1/+2/+3；修饰，半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索结果合并后，用下列标准进行过滤筛选：1.对每一个串联质谱谱图的搜索结果列表，只提取排位在第一个的结果，其他的则丢弃；2.搜索得到的肽段中如果有KR，KK，RK，RR等序列，则这个肽段丢弃；3.搜索得到的肽段，长度在8个氨基酸以上的保留，小于8个氨基酸的丢弃；4.重复打到的肽段，只计算其中分值最高的，把这些肽段分值加起来，做为蛋白的得分；5.蛋白的得分超过60，就认为是可信的结果。低分的蛋白，手工检查后保留或者丢弃。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，则丢弃。

同时进行反向蛋白质序列数据库的搜索。反向蛋白库是将日本血吸虫蛋白质序列反转，保持长度、组成不变。根据正向库和反向库搜索得到的结果，确定假阳性率。计算方法：假阳性＝2*(反向库肽段数)/(正向库肽段数+反向库肽段数)。假阳性控制在0％。

5).日本血吸虫体外排泌蛋白的蛋白质组学鉴定结果

共鉴定出110个血吸虫蛋白。其中脂肪酸结合蛋白是丰度最高的蛋白，SC总数是142，肽段得分总和为6676，共鉴定到该蛋白的8种肽段(表1)。而丰度第2位的，其丰度只有脂肪酸结合蛋白的一半不到(SC＝68)。其中的一个肽段TTVTVDDVTAIR，被检测到91次(最高)(表1和图1)。这说明，脂肪酸结合蛋白是日本血吸虫成虫排泌产物中的最主要的蛋白成分。成虫在宿主(如人)体内，其排泌产物必然释放到宿主的血液循环体系中，因此，检测血吸虫排泌产物的存在，就可以检测血吸虫感染。而排泌产物中丰度最高的蛋白，最容易被检出，因此，脂肪酸结合蛋白是最合适的临床诊断分子，可以利用现有的普及的方法如ELISA来很方便地检测患者血样中的血吸虫特征蛋白。

表1.日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在日本血吸虫体外排泌蛋白质组中被发现和鉴定：

实施例2从感染动物血清中直接分析日本血吸虫的排泌蛋白

1.日本血吸虫尾蚴感染兔子，收集感染后第42天的动物血清。血清蛋白酶解后用液相色谱-质谱分析蛋白质组成。质谱数据搜索日本血吸虫的蛋白质数据库，按照上述标准筛选肽段。得到的肽段用Blast搜索兔子的基因/蛋白数据库(包括mRNA，EST，基因组测序数据等)，去掉任何匹配的肽段，保证保留下来的肽段都是血吸虫特有的。然后利用肽段，搜索得到相应的血吸虫蛋白序列。

2.蛋白丰度定量分析：计算每个蛋白鉴定得到的质谱图总数(Spectra count，SC)，以此代表丰度高低。

3.从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白的鉴定结果

我们在国际上首次从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白。鉴定到FABP的3种肽段(表2)，证明了日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白的确存在于宿主动物的血清中，可以被检测到，因而可以成为血吸虫临床诊断的靶标分子。

表2、日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在被感染的动物血清中被发现和鉴定

实施例3日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白的序列和进化分析

本发明日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的序列保守性：从图2来看，第一，鉴定的肽段覆盖率超过70％。第二，脂肪酸结合蛋白在各个物种里序列比较保守，但我们鉴定到的日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的肽段，都经过与宿主动物即兔子的序列的比较，发现这些肽段都是血吸虫特异的、不同于宿主。第三，存在多个日本血吸虫脂肪酸结合蛋白序列，借助于质谱的高分辨力，我们质谱鉴定到的是其中的SJCHGC00443和另外3个变异体，相互之间只相差1个氨基酸残基。因此丰度最高的是SJCHGC00443。

本发明日本血吸虫脂肪酸结合蛋白进化分析：从图3来看，日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白和其他血吸虫的都不相同，基本上属于不同的进化分支。因此日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白具有比较强的种属特异性，用于诊断更具有特异性。

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白具有脂肪酸转运功能，是脂肪代谢中必不可少的关键蛋白。日本血吸虫不能自身合成脂肪酸，因此抑制脂肪酸结合蛋白可以抑制血吸虫的生长，进而杀灭血吸虫。所以脂肪酸结合蛋白是个候选的药物靶点。以往认为日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白定位在血吸虫表皮下的区域(Sub-tegumental region)和肠道上皮，被认为不与宿主的免疫系统作用，而我们的结果表明日本血吸虫的脂肪酸结合蛋白分泌在宿主的血液中，和宿主的免疫系统直接接触，推测可能发挥重要的免疫调节作用。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>日本血吸虫脂肪酸结合蛋白、其编码基因及应用

<130>NP-08-12789

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>699

<212>RNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>1

tttaggcgtt cagtcaatcg aaagtaagat acattaaacc agccttcaac tttctctgga 60

tcgacagtca gcatttgttt aaatcacttc aaaacaacca gttagtcggt aataatgtct 120

tctttcttgg gaaagtggaa actaagcgaa tcacacaact tcgatgctgt tatgtcaaag 180

ctcggtgtct cgtgggcgac ccgacaaatt gggaacacag tgacgccaac tgtcactttc 240

acaatggatg gggatacgat gaccatgctg acagagtcga ctttcaagaa cctctcagtc 300

acgttcaaat ttggtgagga atttgacgag aaaaccagtg atggcagaag cgttaagtca 360

gtcgttacca aagattcaga gtcaaagata actcaaactc aaaaggatag taagaacaca 420

actgtaatcg ttcgtgaaat agtaggtgat actatgaaaa ctactgtaac tgtcgatgat 480

gttacggcta ttcggaatta caaacgattg taacccctgc aaactgatag actggtcaaa 540

tgtttcttga aagcgcttgt atttcagttg acattattac gaaaatgacc accggtggac 600

gtattttgtt actcgtgtca ttctatattt aattaatcag cttcactttt gttcaataaa 660

cattgcttat tattaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 699

<210>2

<211>578

<212>RNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>2

caggatccat gtcttctttc ttgggaaagt ggaaactaag cgaatcacac aacttcgatg 60

ctgttatgtc aaagctcggt gtctcgtggg cgacccgaca aattgggaac acagtgacgc 120

caactgtcac tttcacaatg gatggggata cgatgaccat gctgacagag tcgactttca 180

agaacctctc agtcacgttc aaatttggtg aggaatttga cgagaaaacc agtgatggca 240

gaagcgttaa gtcagtcgtt accaaagatt cagagtcaaa gataactcaa actcaaaagg 300

atagtaagaa cacaactgta atcgttcgtg aaatagtagg tgatactatg aaaactactg 360

taactgtcga tgatgttacg gctattcgga attacaaacg attgtaaccc ctgcaaactg 420

atagactggt caaatgtttc ttgaaagcgc ttgtatttca gttgacatta ttacgaaaat 480

gaccaccggt ggacgtattt ggttactcgc gtcatcctat atttaattaa tcagctccac 540

ttttggttca ataaacattg cttattattt aaaaaaaa 578

<210>3

<211>399

<212>RNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>3

atgtcttctt tcttgggaaa gtggaaacta agcgaatcac acaacttcga tgctgttatg 60

tcaaagctcg gtgtctcgtg ggcgacccga caaattggga acacagtgac gccaactgtc 120

actttcacaa tggatgggga tacgatgacc atgctgacag agtcgacttt caagaacctc 180

tcagtcacgt tcaaatttgg tgaggaattt gacgagaaaa ccagtgatgg cagaagcgtt 240

aagtcagtcg ttaccaaaga ttcagagtcc aagataactc aaactcaaaa ggatagtaag 300

aacacaactg taatcgttcg tgaaatagta ggtgatacta tgaaaactac tgtaactgtc 360

gatgatgtta cggctattcg gaattacaaa cgattgtaa 399

<210>4

<211>399

<212>RNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>4

atgtcttctt tcttgggaaa gtggaaacta agcgaatcac acaacttcga tgctgttatg 60

tcaaagctcg gtgtctcgtg ggcgacccga caaattggga acacagtgac gccaactgtc 120

actttcacaa tggatgggga tacgatgacc atgctgacag agtcgacttt caagaacctc 180

tcagtcacgt tcaaatttgg tgaggaattt gacgagaaaa ccagtgatgg cagaagcgtt 240

aagtcagtcg ttaccaaaga ttcagagtcc aagataactc aaactcaaaa ggatagtaag 300

aacacaactg taatcgttcg tgaaatagta ggtgatacta tgaaaactac tgtaactgtc 360

gatgatgtta cggctattcg gaattacaaa cgattgtaa 399

<210>5

<211>132

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>5

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDTMT MLTESTFKNL 60

SVTFKFGEEF DEKTSDGRSV KSVVTKDSES KITQTQKDSK NTTVIVREIV GDTMKTTVTV 120

DDVTAIRNYK RL 132

<210>6

<211>132

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>6

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDTMT MLTESTFKNL 60

SVTFKFGEEF DEKTSDGRSV KSVVTKDSES KITQTQKDSK NTTVIVREIV GDTMKTTVTV 120

DDVTAIRNYK RL 132

<210>7

<211>132

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>7

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDTMT MLTESTFKNL 60

SVTFKFGEEF DEKTSDGRSV KSVVTKDSES KITQTQKDSK NTTVIVREIV GDTMKTTVTV 120

DDVTAIRNYK RL 132

<210>8

<211>132

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>8

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDTMT MLTESTFKNL 60

SVTFKFGEEF DEKTSDGRNV KSVVTKDSES KITQTQKDSK NTTVIVREIV GDTMKTTVTV 120

DDVTAIRNYK RL 132

Claims

1.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白，其特征在于：包括：

2.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因，其特征在于：具有SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因，其特征在于：所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.5所示序列的蛋白；所述的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.6所示序列的蛋白；所述的SEQID NO.3所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.7所示序列的蛋白；所述的SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.8所示序列的蛋白。

4.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在制备血吸虫疫苗中的应用。

5.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在筛选药物中的应用。

6.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在制备抗血吸虫抗体中的应用。

7.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白在血清学诊断方面的应用。

8.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白的编码基因在基因治疗方面的应用。