CN101747300B

CN101747300B - 基于紫杉醇和氮芥的协同前药及其制备方法

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Publication number: CN101747300B
Application number: CN2009102005329A
Authority: CN
Inventors: 林海霞; 邵军超; 靳丹辉; 阮非; 黄嘉辰
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2029-12-22
Also published as: CN101747300A

Abstract

本发明涉及一种基于紫杉醇-氮芥的协同前药及其制备方法。该协同前药的结构式为：

该协同前药在正常状态下毒性大大降低，具有潜在的应用价值。

Description

基于紫杉醇和氮芥的协同前药及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型协同前药及其制备方法，特别是一种基于紫杉醇-氮芥的协同前药及其制备方法。

背景技术

当今在大多数国家，因恶性肿瘤而引起的死亡是仅次于心脑血管疾病的人类第二大死因。传统的抗肿瘤药物除了抑制和毒害增生活跃的肿瘤细胞的同时，对其它增生较快的正常细胞也同样产生抑制作用，因而产生许多严重的毒副作用，如恶心、呕吐、骨髓抑制和脱发等。

随着生活水平的提高，人们对于癌症治疗期望值有所提高，希望在治愈癌症的同时，人的健康不受到很大的影响。因此开发新型的、能选择性的作用于肿瘤细胞而对正常细胞没有毒性的抗肿瘤药物显得尤为重要。

随着分子和细胞生物学的巨大发展，为抗肿瘤新药的研究提供了广阔的空间。实体肿瘤的“低氧”性为抗肿瘤药物设计提供了一种很好的策略。实体肿瘤包含一定比例的低氧细胞，可通过代谢作用将“可生物还原”的前药还原而释放出活性的药物。

由于肿瘤细胞极易产生耐药性，目前肿瘤的化疗已经由单一化疗进入了联合化疗的阶段。然而联合用药仍然无法避免耐药性和全身毒副作用。如果采用协同前药的策略给药，则可以大大改善这种状况。将两种不同类型的抗肿瘤药物通过适当的形式偶联而形成的就是抗肿瘤类协同前药。该类前药在肿瘤组织中经过适当的机制活化而释放出两种不同类型的抗肿瘤活性药物，由此避免了同时产生耐药性。在保证疗效的前提下，还可以大大降低毒副作用。同时，还可能提高该类药物的抗肿瘤范围。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的基于紫杉醇-氮芥的协同前药。

本发明的目的之二在于提供该协同前药的制备方法。

氮芥是第一个人工合成的抗肿瘤药物，自从20世纪40年代用于治疗恶性淋巴瘤以来已经有60多年的应用历史。紫杉醇是从红豆杉属植物中分离提取的一种具有独特抗癌活性的新型抗癌药，已于1992年底被美国FDA正式批准为治疗卵巢癌和乳腺癌的新药上市。然而它们在临床应用中，“疗效”和“无毒副作用”始终不可兼得。基于上述考虑，本发明设计合成了一种基于紫杉醇-氮芥的协同前药。构效关系研究表明，紫杉醇侧链2’游离的羟基以适当形式被酯化，紫杉醇的抗肿瘤活性大大降低⁴。在氮芥的苯环上引入强吸电子基团如硝基可以大大降低该类化合物的毒性⁵。该硝基是协同前药分子中活化的“扳机”，在细胞环境中被还原，“扳机”被击发，最终释放出紫杉醇和氮芥活性药物。

根据上述理论，本发明采用如下反应机理：

根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：

一种基于紫杉醇-氮芥的协同前药，其特征在于该协同前药的结构式为：

一种制备上述的基于紫杉醇-氮芥的协同前药的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将反应物5-氯-2-硝基苯甲酸溶于氯化亚砜中回流6～8个小时；蒸去氯化亚砜，得淡黄色油状5-氯-2-硝基苯甲酰氯，用无水四氢呋喃稀释，得稀释液；将该稀释液缓慢滴加到碳酸钾和苯胺的无水四氢呋喃溶液中，其中碳酸钾和苯胺的摩尔比为1∶(1～2)；在-10～10℃下搅拌至反应体系中5-氯-2-硝基苯甲酰氯反应完全；抽滤，滤液蒸除溶剂得粗产物；该粗产物用乙酸乙酯重结晶，得白色针状晶体5-氯-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺，称为化合物A；

b.将化合物A溶于二乙醇胺中，惰性气氛下，在100℃～110℃下搅拌反应至化合物A反应完全，加入盐酸中止反应并调节反应体系的pH值至6.5～7，有大量淡黄色固体沉淀析出；滤液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，除去溶剂得淡黄色固体；合并淡黄色固体，经分离纯化得淡黄色针状晶体5-(双(2-羟基乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺，称为化合物B；

c.将化合物B、氯化亚砜、无水碳酸钾和三乙基苄基氯化铵按5∶(20～25)∶(2～3)∶(1～2)的摩尔比溶于无水四氢呋喃中，在室温下搅拌至反应体系中化合物B反应完全；过滤，滤液蒸去溶剂得淡黄色油状粗产物；该淡黄色油状粗产物经分离纯化得淡黄色固体5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺，称为化合物C；

d.将化合物C溶于70％～75％浓硫酸中，在90℃～100℃下搅拌至反应体系中化合物C反应完全；加入水中止反应，产生棕色沉淀；抽滤得固体粗产物，用水洗涤，用乙酸乙酯重结晶得淡黄色晶体5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基苯甲酸，称为化合物D；

e.将化合物D和草酰氯按1∶(3～4)的摩尔比溶于二氯甲烷中，在30℃～40℃下搅拌反应至反应物D完全，除去溶剂和多于的草酰氯得淡黄色固体；该淡黄色固体用甲苯溶解后缓慢滴加到叠氮化钠、三乙胺和PEG-600的甲苯混合溶液中，其中叠氮化钠、三乙胺和PEG-600的摩尔比为1∶(4～6)∶(0.015～0.2)；将反应混合溶液先在55～60℃温度下搅拌1～1.5小时，然后在70～75℃下搅拌5～6小时；加入1.5～2倍摩尔量的叔丁基-2-羟基乙基-氨基甲酸酯；在80～85℃下继续搅拌6～8小时；抽滤除去固体物质，滤液蒸去溶剂得粗产物；该粗产物经过分离提纯得淡黄色固体N-叔丁氧基羰基-2-氨基乙基-5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酸酯，称为化合物E；

f.将化合物E溶于甲醇中，加入6～6.5mol/L盐酸4～6mL；反应液在40～45℃下搅拌至反应体系中化合物E反应完全；用饱和的碳酸氢钠水溶液中止反应；水相用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂得粗产物；该粗产物用乙酸乙酯重结晶得2-氨基乙基-5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酸酯，称为化合物F；

g.将化合物F、氯甲酸对硝基苯酯和吡啶按1∶(2～2.5)∶(2～2.5)的摩尔比溶于二氯甲烷中；反应混合物在0～5℃下搅拌至反应体系中化合物F反应完全；加入饱和硫酸铜溶液洗涤，水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂得粗产物；该粗产物经过分离提纯得5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙基-羰基-4-硝基苯酚酯，称为化合物G；

h.将化合物G、紫杉醇和二甲基-氨基吡啶按1∶(0.8～1)∶(1.7～2)的摩尔比溶于二氯甲烷中；反应混合物在室温下搅拌40～50小时；减压蒸去溶剂得粗产物；该粗产物经分离提纯得5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙基-羰基紫杉醇，称为化合物H，即为基于紫杉醇-氮芥的协同前药。

本发明产物结构新颖，首次将两种不同类型的抗肿瘤药物偶联，形成新型的抗肿瘤协同前药，且该协同前药在正常状态下毒性大大降低，具有潜在的应用价值。本发明采用的方法简便，特别是步骤c，在反应中添加三乙基苄基氯化铵，极大的改善了反应进程，使得反应操作更简便高效。

附图说明

图1为协同前药(H)和紫杉醇在正常条件和低氧条件下对胶质细胞瘤LN299细胞的体外增殖抑制作用图。

图2为协同前药(H)和紫杉醇在正常条件和低氧条件下对胶质细胞瘤D54MG细胞的体外增殖抑制作用图。

图3为协同前药(H)和紫杉醇在正常条件和低氧条件下对胶质细胞瘤U255MG细胞的体外增殖抑制作用图。

具体实施方式

实施例一：本发明的基于紫杉醇-氮芥的协同前药的具体合成步骤：

A.5-氯-2-硝基苯甲酸(15.02g，75.4mmol)溶解在SOCl₂(80mL)中，回流6小时；常压蒸去大部分氯化亚砜，减压除去残余的部分氯化亚砜，得到棕色油状的5-氯-2-硝基苯甲酰氯粗产物，加入无水四氢呋喃稀释；将此溶液通过恒压漏斗在0℃条件下30分钟内滴加入含有苯胺(7.20g，78.2mmol)和无水K₂CO₃(10.30g，75.2mmol)的干燥THF(30mL)溶液中，反应混合物继续搅拌2小时；反应结束后，过滤除去固体物质，滤液减压蒸去溶剂；粗产物在乙酸乙酯中重结晶得到A(19.79g)，收率96％。

B.化合物A(4.53g，16.4mmol)溶解在二乙醇胺(10.16g，96.6mmol)中，在氮气保护下105℃搅拌20小时；反应结束后加入3mol/L盐酸中止反应，调节溶液pH值至6.5-7左右，有大量淡黄色沉淀析出；抽滤出淡黄色沉淀；滤液加乙酸乙酯萃取，无水MgSO-4干燥，蒸去溶剂得淡黄色固体；合并淡黄色固体粗产物，经过硅胶柱层析(流动相∶乙酸乙酯/乙醇＝10∶1)分离得到淡黄色晶体B(4.92g)，收率87％。

C.SOCl₂(3.0mL，42.3mmol)加入无水THF(20mL)稀释；将此溶液在40℃条件下1小时内滴加到含有化合物B(4.83g，14.0mmol)、无水K₂CO₃(3.87g，28.0mmol)和三乙基苄基氯化铵(0.64g，2.8mmol)的干燥THF(30mL)溶液中，反应混合物在相同条件下继续搅拌4小时；反应结束后减压抽滤除去固体物质；滤液减压蒸去溶剂；粗产物经过硅胶柱层析(流动相∶乙酸乙酯/石油醚＝1∶2)分离得到化合物C(5.03g)，收率94％。

D.化合物C(2.02g，5.3mmol)加入浓H₂SO₄(70％，12mL)中，在95℃条件下搅拌6小时；反应结束后，待溶液温度冷却至室温后加入H₂O(14mL)中止反应，有大量棕色沉淀析出；减压抽滤出沉淀，水(5mL)洗；固体在45℃条件下真空干燥1小时；将粗产物溶解在乙酸乙酯(70mL)中，加入活性炭(0.12g)，回流1小时后，减压抽滤除去活性炭；滤液减压浓缩至有大量淡黄色固体析出，减压抽滤出固体，乙酸乙酯(2mL)洗涤，45℃条件下真空干燥1小时得到化合物D(1.43g)，收率88％。

E.化合物D(512mg，1.67mL)溶解在CH₂Cl₂(60mL)中；加入草酰氯(0.69mL，5.42mmol)，在35℃条件下搅拌6小时后，减压蒸去溶剂和过量的草酰氯，得到淡黄色固体，键入新鲜处理的甲苯(20mL)溶解；将此溶液通过恒压漏斗在60℃条件下1小时内滴加到含有NaN₃(161mg，2.48mmol)、三乙胺(0.91mL，6.51mmol)和PEG-600(5滴)的甲苯(30mL)溶液中；反应混合物在70℃条件下搅拌5小时；加入叔丁基-2-羟基乙基-氨基甲酸酯(422mg，2.62mmol)，反应混合物在80℃条件下搅拌6小时；反应结束后减压抽滤除去固体物质；滤液减压蒸去溶剂；粗产物经过硅胶柱层析(流动相∶乙酸乙酯/石油醚＝1∶2)分离得到淡黄色化合物E(481mg)，收率61％。

F.化合物E(101mg，0.22mmol)溶解在甲醇(10mL)中；在40℃条件下加入6mol/L的盐酸(4mL)，在此条件下搅拌12小时；反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液中止反应；减压蒸去有机溶剂，水相用乙酸乙酯(3×50)萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥，减压蒸去溶剂；粗产物在乙酸乙酯中重结晶得到淡黄色化合物F(73mg)，收率92％。

G.化合物F(43mg，0.09mmol)溶解在干燥的CH₂Cl₂(10mL)中；在0℃条件下加入氯甲酸对硝基苯酯(47mg，0.18mmol)和无水吡啶(18mg，0.18mmol)；反应混合物在此条件下搅拌2小时，然后在室温下继续搅拌4小时；反应结束后，加入CH₂Cl₂(15mL)，饱和CuSO₄溶液洗涤，水洗涤，无水MgSO₄干燥，减压蒸去溶剂；粗产物经过硅胶柱层析(流动相∶乙酸乙酯/石油醚＝1∶2)分离得到淡黄色化合物G(54mg)，收率87％。

H.化合物G(37mg，0.07mmol)溶解在干燥的CH₂Cl₂(6mL)中；在室温条件下加入紫杉醇(60mg，0.07mmol)和4-甲基氨基吡啶(18mg，0.14mmol)；反应混合物在此条件下搅拌40小时；反应结束后减压蒸去溶剂；粗产物经过制备薄层层析硅胶板(流动相∶乙酸乙酯/石油醚＝3∶1)分离得到淡黄色化合物H(71mg)，收率82％。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)ppm 10.41(s，1H)，8.15(d，J＝10.0Hz，1H)，8.11(d，J＝7.5Hz，2H)，7.82(d，J＝2.5Hz，1H)，7.73(d，J＝7.5Hz，2H)，7.61-7.58(m，1H)，7.51-7.45(m，4H)，7.41-7.35(m，5H)，7.31-7.29(m，1H)，7.08(d，J＝9.0Hz，1H)，6.39(dd，J＝10.0，2.5Hz，1H)，6.26(s，1H)，6.22(t，J＝9.0Hz，1H)，5.92(dd，J＝9.5，4.5Hz，1H)，5.66(d，J＝7.0Hz，1H)，5.53(d，J＝4.0Hz，1H)，5.48(t，J＝6.0Hz，1H)，4.95(d，J＝9.5Hz，1H)，4.41(t，J＝8.0Hz，1H)，4.30(d，J＝8.5Hz，1H)，4.25-4.21(m，2H)，4.17(d，J＝8.5Hz，1H)，3.87(t，J＝6.5Hz，4H)，3.78(d，J＝7.0Hz，1H)，3.72(t，J＝6.5Hz，4H)，3.51-3.49(t，J＝5.0，2H)，2.53-2.50(m，1H)，2.41(s，3H)，2.35-2.26(m，2H)，2.22(s，3H)，2.11-2.06(m，1H)，1.90(s，3H)，1.81(s，1H)，1.66(s，3H)，1.21(s，3H)，1.11(s，3H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)ppm 203.9，171.4，170.0，168.9，167.6，167.0，155.1，153.0，152.6，142.8，138.1，136.9，133.8，133.6，132.8，132.1，130.2，129.3，129.2，129.1，128.8，127.2，126.8，126.5，126.2，115.6，106.3，100.3，84.5，81.1，79.1，76.5，75.7，75.1，74.5，72.2，71.8，64.6，58.5，53.7，53.4，45.7，43.2，40.5，40.3，35.7，35.6，26.8，22.6，22.2，20.9，14.8，9.7；ESI-MS：m/z 1266.2[M+Na]⁺.

实施例二：5-(双(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙基-羰基紫杉醇的生物活性测试

具体测试过程：

a.96孔板分别植入LN229、D54MG、U251MG三种不同的肿瘤细胞，80000个/孔，置37℃，5％CO₂培养箱内培养24小时；

b.向步骤a中培养好的细胞中分别加入不同浓度的协同前药(H)和紫杉醇溶液，置37℃，5％CO₂培养箱内培养2小时；

c.将步骤b中的细胞分为两组，其中一组置37℃，1％O₂培养箱内培养72小时，另一组置37℃，21％O₂培养箱内培养72小时；

d.向步骤c中培养好的细胞中每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μL，作用4h后加入溶解液，100μL/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。

具体测试结果请参见图1、图2和图3，结果显示，本发明的协同前药在正常状态下毒性大大降低，具有潜在的应用价值。

Claims

1.一种基于紫杉醇－氮芥的协同前药，其特征在于该协同前药的结构式为：

。

2.一种制备根据权利要求1所述的基于紫杉醇－氮芥的协同前药的方法，其反应式如下：

，

其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 将反应物5－氯－2－硝基苯甲酸溶于氯化亚砜中回流6～8个小时；蒸去氯化亚砜，得淡黄色油状5－氯－2－硝基苯甲酰氯，用无水四氢呋喃稀释，得稀释液；将该稀释液缓慢滴加到碳酸钾和苯胺的无水四氢呋喃溶液中，其中碳酸钾和苯胺的摩尔比为1：（1～2）；在－10～10℃下搅拌至反应体系中5－氯－2－硝基苯甲酰氯反应完全；抽滤，滤液蒸除溶剂得粗产物；该粗产物用乙酸乙酯重结晶，得白色针状晶体，称为化合物A；

b. 将化合物A溶于二乙醇胺中，惰性气氛下，在100^oC～110℃下搅拌反应至化合物A反应完全，加入盐酸中止反应并调节反应体系的pH值至6.5～7，有大量淡黄色固体沉淀析出；滤液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，除去溶剂得淡黄色固体；合并淡黄色固体，经分离纯化得淡黄色针状晶体，称为化合物B；

c. 将化合物B、氯化亚砜、无水碳酸钾和三乙基苄基氯化铵按5：（20～25）：（2～3）：（1～2）的摩尔比溶于无水四氢呋喃中，在室温下搅拌至反应体系中化合物B反应完全；过滤，滤液蒸去溶剂得淡黄色油状粗产物；该淡黄色油状粗产物经分离纯化得淡黄色固体，称为化合物C；

d. 将化合物C溶于70％～75％浓硫酸中，在90℃～100℃下搅拌至反应体系中化合物C反应完全；加入水中止反应，产生棕色沉淀；抽滤得固体粗产物，用水洗涤，用乙酸乙酯重结晶得淡黄色晶体，称为化合物D；

e. 将化合物D和草酰氯按1：（3～4）的摩尔比溶于二氯甲烷中，在30℃～40℃下搅拌反应至反应物D完全，除去溶剂和多余的草酰氯得淡黄色固体；该淡黄色固体用甲苯溶解后缓慢滴加到叠氮化钠、三乙胺和PEG-600的甲苯混合溶液中，其中叠氮化钠、三乙胺和PEG-600的摩尔比为1：（4～6）：（0.015～0.2）；将反应混合溶液先在55～60℃温度下搅拌1～1.5小时，然后在70～75℃下搅拌5～6小时；加入1.5～2倍摩尔量的叔丁基－2－羟基乙基－氨基甲酸酯；在80～85℃下继续搅拌6～8小时；抽滤除去固体物质，滤液蒸去溶剂得粗产物；该粗产物经过分离提纯得淡黄色固体，称为化合物E；

f. 将化合物E溶于甲醇中，加入6～6.5 mol/L盐酸4～6 mL；反应液在40～45℃下搅拌至反应体系中化合物E反应完全；用饱和的碳酸氢钠水溶液中止反应；水相用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂得粗产物；该粗产物用乙酸乙酯重结晶，得化合物F；

g. 将化合物F、氯甲酸对硝基苯酯和吡啶按1：（2～2.5）：（2～2.5）的摩尔比溶于二氯甲烷中；反应混合物在0～5℃下搅拌至反应体系中化合物F反应完全；加入饱和硫酸铜溶液洗涤，水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂得粗产物；该粗产物经过分离提纯，得化合物G；

h. 将化合物G、紫杉醇和二甲基－氨基吡啶按1：（0.8～1）：（1.7～2）的摩尔比溶于二氯甲烷中；反应混合物在室温下搅拌40～50小时；减压蒸去溶剂得粗产物；该粗产物经分离提纯，得化合物H，即为基于紫杉醇－氮芥的协同前药。